一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒

技术领域

本发明属于兽医生物诊断技术领域，尤其涉及一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒。

背景技术

新生犊牛腹泻是临床上常见的一种疾病，对犊牛身体健康造成严重危害，是造成奶牛产业经济损失的重要原因之一。引起犊牛腹泻的病原有很多，包括病毒、细菌和寄生虫，其中病毒主要有牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)、牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)和牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)等，且呈世界性流行。牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科瘟病毒属，是单股正链RNA病毒，感染该病毒的牛主要表现为腹泻、黏膜发绀、消化道粘膜糜烂、免疫耐受和持续性感染等，BVDV自然感染对象是奶牛和黄牛，该病毒引起一种接触性传染病-牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine viral diarrhoea/mucosal disease,BVD/MD，危害严重。牛冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为不分段的单股正链RNA病毒，是引起犊牛腹泻和呼吸道感染的重要病原，感染BCoV的犊牛主要表现为腹泻，也可导致成年牛冬痢，呼吸道感染引起牛肺炎等。牛轮状病毒是呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起犊牛腹泻的重要病原，患病牛以排水样稀粪为主要特征，且多可引起继发感染。牛传染性鼻气管炎病毒可引起牛一种急性、热性、接触性传染病，感染该病毒的牛主要表现为呼吸道症状，也是引起牛肠炎型腹泻的重要病原之一，患病牛有时可出现带血性腹泻，新生犊牛可表现为全身性疾病。

随着我国科学技术的不断发展，人民生活水平不断提高，养殖业也不断扩大，由BVDV、BCoV、BRV和IBRV四种病毒引起的犊牛腹泻疾病严重影响着奶牛的健康，给我国奶牛产业带来了很大的影响，造成了巨大的经济损失。对于这四种病毒引起的疾病尚无有效的治疗药物和预防措施，欧洲国家采取尽快检出、淘汰患病牛以根除疾病。目前检测方法主要依赖于病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验、间接免疫荧光技术(IFA)、普通PCR技术和实时荧光定量PCR检测技术等。但这些试验方法存在周期较长、检测量较低、费用高、操作复杂、特异性不好等缺点，因此我们迫切需要建立一种快速、灵敏、稳定且同时能检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV四种病毒的多重荧光定量PCR检测方法，为临床检测提供一种快速、有效的检测技术。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重SYBRGreen I荧光定量PCR引物组。

本发明的目的之二在于提供一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重SYBR Green I荧光定量PCR方法。

本发明的目的之三在于提供一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的试剂盒。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR引物组，所述引物组包括4对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示：

BVDV-F：5'-ACAGGGCAGTCGTCAGTG-3'(SEQ ID NO.1)

BVDV-R：5'-TTCGTAGCAGTCGGTTGG-3'(SEQ ID NO.2)

BCoV-F：5'-AGTTTGAATTTGCAGAGGGACA-3'(SEQ ID NO.3)

BCoV-R：5'-GGTTGCCATCGGCTGTTT-3'(SEQ ID NO.4)

BRV-F:5'-AGATAATGTATGTATGGACGAG-3'(SEQ ID NO.5)

BRV-R:5'-GACGCTGAATAAGGGAAA-3'(SEQ ID NO.6)

IBRV-F：5'-GCAAGGTGGTGGCCTTCGAC-3'(SEQ ID NO.7)

IBRV-R：5'-GAGGTGCCCGTGCGGTAGAG-3'(SEQ ID NO.8)

其中BVDV-F/R、BCoV-F/R、BRV-F/R和IBRV-F/R，分别能特异性与目的基因结合，并特异性扩增出以下基因：BVDV的5’UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和IBRV的gB基因。

通过引物对BVDV-F/R扩增得到目的基因片段大小为137bp；通过引物对BCoV–F/R扩增的到目的基因片段为117bp；通过引物对BRV-F/R扩增得到目的基因片段大小为213bp；通过引物对IBRV-F/R扩增得到目的基因片段大小为151bp。

同时，本发明上述引物组在检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV或在制备BVDV、BCoV、BRV和IBRV检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

(1)提取样本核酸，并进行反转录；

(2)使用引物SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8对步骤(1)中反转录得到的混合物以及4种病毒的阳性质粒分别进行多重荧光定量PCR扩增反应，得到PCR扩增曲线；

(3)根据步骤(2)中得到的扩增曲线进行结果分析。

优选地，所述步骤(1)中样本为粪便。

优选地，所述步骤(2)中多重荧光定量PCR的扩增体系中各组分总浓度为：

优选地，所述步骤(2)中多重荧光定量PCR的扩增程序为：95℃300s、95℃10s、57℃10s，72℃25s，共40个循环。

另外，上述BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法在制备其检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，本发明还提供一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示的引物组。

优选地，所述试剂盒还包含BVDV、BCoV、BRV和IBRV的阳性质粒，可通过上述阳性质粒构建荧光定量PCR标准曲线。

优选地，还包括荧光定量PCR所需的试剂，例如ExTaq buffer，dNTPs，MgCl

同时所述试剂盒在检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV中的应用亦在本发明保护范围内。

作为一种优选地可实施方式，所述试剂盒用于检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的方法包括如下步骤：

(1)提取样本核酸，并进行反转录；

(2)使用引物SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8对步骤(1)中反转录得到混合物以及4种病毒的阳性质粒分别进行多重荧光定量PCR扩增反应，得到PCR扩增曲线；

(3)根据步骤(2)中得到的扩增曲线进行结果分析。

优选地，所述步骤(2)中多重荧光定量PCR的扩增体系中各组分总浓度为：

优选地，所述步骤(2)中多重荧光定量PCR的扩增程序为：95℃300s、95℃10s、57℃10s，72℃25s，共40个循环。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的引物组实现了对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的同时、定量检测，该检测方法灵敏度高，特异性好，适用于临床样品的检测。

附图说明

图1为实施例1中BVDV重组质粒、BCoV重组质粒、BRV重组质粒和IBRV重组质粒PCR扩增结果图。

图2a为实施例3中BVDV多重荧光定量PCR扩增曲线图。

图2b为实施例3中BCoV多重荧光定量PCR扩增曲线图。

图2c为实施例3中BRV多重荧光定量PCR扩增曲线图。

图2d为实施例3中IBRV多重荧光定量PCR扩增曲线图。

图3a为实施例3中BVDV多重荧光定量PCR标准曲线图。

图3b为实施例3中BCoV多重荧光定量PCR标准曲线图。

图3c为实施例3中BRV多重荧光定量PCR标准曲线图。

图3d为实施例3中IBRV多重荧光定量PCR标准曲线图。

图4为实施例3中多重荧光定量PCR四种引物的溶解曲线图。

图5为对比例1中多重荧光定量PCR检测方法的特异性结果图。

图6为实施例4中4对引物对目的片段进行荧光定量PCR扩增的结果图。

图7a为实施例5中BVDV荧光定量PCR的敏感性检测结果图。

图7b为实施例5中BRV荧光定量PCR的敏感性检测结果图。

图7c为实施例5中BCoV荧光定量PCR的敏感性检测结果图。

图7d为实施例5中IBRV荧光定量PCR的敏感性检测结果图。

具体实施方式

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购，荧光PCR所用染料为SYRBGreen I。

实施例1

引物设计：

根据BVDV、BCoV、BRV和IBRV的基因组设计荧光定量特异性扩增引物组，具体序列如下：

BVDV-F：5'-ACAGGGCAGTCGTCAGTG-3'(SEQ ID NO.1)

BVDV-R：5'-TTCGTAGCAGTCGGTTGG-3'(SEQ ID NO.2)

BCoV-F：5'-AGTTTGAATTTGCAGAGGGACA-3'(SEQ ID NO.3)

BCoV-R：5'-GGTTGCCATCGGCTGTTT-3'(SEQ ID NO.4)

BRV-F:5'-AGATAATGTATGTATGGACGAG-3'(SEQ ID NO.5)

BRV-R:5'-GACGCTGAATAAGGGAAA-3'(SEQ ID NO.6)

IBRV-F：5'-GCAAGGTGGTGGCCTTCGAC-3'(SEQ ID NO.7)

IBRV-R：5'-GAGGTGCCCGTGCGGTAGAG-3'(SEQ ID NO.8)。

实施例2

BVDV、BCoV、BRV和IBRV阳性质粒的制备，步骤如下：

(1)提取样本核酸，并进行反转录；

(2)以步骤(1)中反转录得到混合物为模板，利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8引物组分别进行普通PCR扩增；

PCR反应总体系为25μL：cDNA(DNA)模板1μL，上、下游引物终浓度为0.2uM/uL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH

BVDV和BCoV普通PCR目的片段扩增反应程序为：预变性95℃5min；变性94℃30s、退火56℃30s、延伸72℃15s，共35个循环，终延伸72℃7min；

BRVPCR反应程序为：预变性95℃5min；变性94℃30s、退火55℃30s、延伸72℃15s，共35个循环，终延伸72℃7min；

IBRVPCR反应程序为：预变性95℃5min；变性94℃30s、退火57℃30s、延伸72℃15s，共35个循环，终延伸72℃7min。

(3)将扩增得到的PCR产物，取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中M为DL 1000Marker；1为BVDV 5’UTR基因；2为BCoV N基因；3为BRV VP6基因；4为IBRV gB基因；5为阴性对照。电泳图中出现大小为137bp的扩增条带，说明样品BVDV检测为阳性；电泳图中出现大小为117bp的扩增条带，说明样品中BCoV检测为阳性；电泳图中出现大小为213bp的扩增条带，说明样品中BRV检测为阳性；电泳图中出现大小为151bp的扩增条带，说明样品中IBRV检测结果为阳性。

(4)将四种病毒扩增得到的特异性目的条带进行胶回收纯化，将胶回收纯化得到的目的片段分别克隆至pUC-57载体，转化至DH5α感受态细胞，对转化产物进行培养，提取质粒，PCR检测为阳性克隆送至吉林省库美生物科技有限公司测序，测序结果显示均获得了序列正确的扩增片段，利用Nanodrop 2000测定质粒浓度，计算质粒拷贝数，作为质粒标准品。

实施例3

一种实时多重荧光定量PCR检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的方法，步骤如下：

将pUC-57-BVDV重组质粒、pUC-57-BCoV重组质粒、pCU-57-BRV重组质粒和pUC-57-IBRV重组质粒使用灭菌的三蒸水进行10倍倍比梯度稀释至10

对比例1

实验方法同实施例4，唯一不同的是，所用的引物组如下：

BVDV-2F：5'-AGTCGTCAGTGGTTCGACGCCTTGG-3'(SEQ ID NO.9)

BVDV-2R：5'-CCTATCAGGCTGTATTCGTAA-3'(SEQ ID NO.10)

BCoV-2F：5'-GTACCCTACTATTCTTGGTTCTC-3'(SEQ ID NO.11)

BCoV-2R：5'-TCGGTGCCATACTGGTCTTT-3'(SEQ ID NO.12)

BRV-2F：5'–GTAGATAATGTATGTATGGACGAG-3'(SEQ ID NO.13)

BRV-2R：5'-ATGACGCTGAATAAGGGAAA-3'(SEQ ID NO.14)

IBRV-2F：5'–ACCTGGTGGACAAGAAGTGGCG-3'(SEQ ID NO.15)

IBRV-2R：5'–TGCGGTAGAGCCCCGCCGAGCCCAG-3'(SEQ ID NO.16)

利用上述四对引物对目的片段进行荧光定量PCR扩增，结果如图5所示，对比例所用的4对引物未能均匀地扩增出荧光曲线，表明该引物组扩增效果不好。

实施例4

本实施例进行SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8的特异性试验，步骤如下：

以提取的牛细小病毒、牛隐孢子虫、牛球虫和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的DNA以及反转录完成的牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)和BVDV的cDNA为模板，同时设立阴性对照，利用上述引物对SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8及所建立的多重荧光定量PCR进行扩增(扩增程序同实施例3)，检测该方法的特异性，结果如图6所示，其中1：IBRV质粒标准品；2：BCoV质粒标准品；3：BRV质粒标准品；4：BVDV质粒标准品；5：BPV；6：牛球虫；7：牛隐孢子虫；8：ddH

实施例5

本实施例进行SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8的敏感性试验，步骤如下：

将BVDV、BCoV、BRV和IBRV的质粒标准品进行10倍倍比梯度稀释，其中：

BVDV质粒稀释浓度为：1.41×10

BCoV质粒稀释浓度为1.17×10

BRV质粒稀释浓度为1.36×10

IBRV质粒稀释浓度为1.2×10

以稀释好的质粒为模板，利用已建立的多重荧光定量PCR检测方法进行扩增，反应体系和反应条件与实施例3相同。同时，利用普通PCR对稀释好的质粒标准品进行稀释，与所建立的多重荧光定量PCR检测方法进行比较。

结果表明：多重荧光定量PCR检测方法可以检出BVDV的最低样品浓度为1.41×10

实施例6

本实施例进行SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8的重复性试验，步骤如下：

分别用BVDV1.41×10

因此，本试验所建立的多重SYRB GreenI荧光定量PCR检测方法，能快速、准确、定量地检测出BVDV、BCoV、BRV和IBRV四种病原，为犊牛腹泻病病原检测提供一种有效手段，对犊牛腹泻病的诊断具有重要意义。

表1多重荧光定量PCR的组内、组间重复性试验结果

实施例7

本实施例提供一种用于检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的试剂盒，该试剂盒包含实施例1中的引物组，同时还包含BVDV、BCoV、BRV和IBRV的阳性质粒，可通过上述阳性质粒构建荧光定量PCR标准曲线，还包含荧光定量PCR所需的试剂，例如ExTaq buffer，dNTPs，MgCl

该试剂盒的扩增体系以及扩增参数的设置同实施例3。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒

<130> 2021.4.22

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

acagggcagt cgtcagtg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttcgtagcag tcggttgg 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agtttgaatt tgcagaggga ca 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

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ggttgccatc ggctgttt 18

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

agataatgta tgtatggacg ag 22

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gacgctgaat aagggaaa 18

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<211> 18

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<213> 人工序列()

<400> 7

gcaaggtggt ggccttcgac 20

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gaggtgcccg tgcggtagag 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

agtcgtcagt ggttcgacgc cttgg 25

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cctatcaggc tgtattcgta a 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

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gtaccctact attcttggtt ctc 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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tcggtgccat actggtcttt 20

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gtagataatg tatgtatgga cgag 24

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acctggtgga caagaagtgg cg 22

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

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tgcggtagag ccccgccgag cccag 25