表达鞭毛蛋白多肽的经修饰的免疫细胞

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技术领域

本发明涉及表达鞭毛蛋白多肽的经修饰的免疫细胞及其用于治疗癌症的方法。

背景技术

癌症疫苗旨在引发针对肿瘤抗原的免疫应答，这些肿瘤抗原仅在肿瘤细胞中表达(例如，肿瘤睾丸抗原、突变蛋白和病毒抗原)，或者在肿瘤细胞中以升高的水平表达(例如，过表达或差异表达)。临床上已经测试了多种癌症疫苗，包括肽疫苗、质粒DNA疫苗、RNA疫苗、树突状细胞(DC)疫苗和T细胞疫苗。经修饰以表达肿瘤抗原肽的T细胞可以在动物和人中引发强烈而持久的应答，并且当发生抗原致敏(antigen priming)时，过继转移的T细胞可以有效地迁移至次级淋巴器官。然而，癌细胞具有逃避免疫监视的机制，这损害了基于T细胞的疫苗的效力。例如，癌细胞的微环境可导致无效的T细胞致敏、免疫耐受或调节T细胞(Treg)的免疫抑制。仍然需要高效的基于细胞的癌症免疫疗法。

鞭毛蛋白是鞭毛(一种使细菌能够运动的鞭状附属物)的亚单位蛋白。最新研究表明，通过与Toll样受体(TLR)5相互作用，鞭毛蛋白是促炎真核细胞信号传导的有效激活剂。鞭毛蛋白在微生物感染过程中调节先天免疫和适应性免疫两者。鞭毛蛋白刺激许多先天和非免疫细胞(包括树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、上皮细胞和淋巴结基质细胞)中促炎细胞因子和趋化因子的产生。鞭毛蛋白可以直接刺激T细胞增殖，也可以通过将先天免疫细胞募集到感染部位来刺激T细胞增殖。然而，在某些情况下，鞭毛蛋白还可以增强CD4

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发明内容

本申请提供了表达能够结合toll样受体(例如TLR5)的鞭毛蛋白多肽的经修饰的免疫细胞及其用于治疗癌症的方法。

本申请的一个方面提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。

在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ IDNO:24具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，toll样受体选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5，例如TLR5同源二聚体或TLR4/TLR5异源二聚体。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR11。

在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)接头与细胞膜结合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽经由跨膜结构域与细胞膜结合。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含铰链区，例如CD8铰链区。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由经修饰的免疫细胞分泌。

在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞组成的组。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是γδT细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是肿瘤浸润性T细胞或DC激活的T细胞。

在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。

在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至分开的启动子。

本申请的一个方面提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括：将编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的第一核酸序列引入前体免疫细胞中，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的全部或一部分。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)接头与细胞膜结合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽经由跨膜结构域与细胞膜结合。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含铰链区，例如CD8铰链区。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽被分泌。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，前体免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞组成的组。在一些实施例中，前体免疫细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是γδT细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞是肿瘤浸润性T细胞或DC激活的T细胞。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，前体免疫细胞包含工程化受体。在一些实施例中，该方法进一步包括将编码工程化受体的第二核酸引入前体免疫细胞中。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸位于同一载体上。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸在分开的载体上。在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物组成的组。在一些实施例中，载体是非病毒载体。在一些实施例中，载体是游离型表达载体。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，该方法进一步包括分离或富集包含第一核酸序列和/或第二核酸序列的免疫细胞。

在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，该方法进一步包括与至少一种药学上可接受的载剂一起配制经修饰的免疫细胞。

还提供了通过根据上述产生方法中任一个的方法产生的经修饰的免疫细胞。

还提供了药物组合物，其包含根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂。

本申请的另一个方面提供了治疗个体的癌症的方法，该方法包括向该个体施用有效量的根据上述药物组合物中任一个的药物组合物。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，个体是人。

本申请的另一个方面提供了工程化鞭毛蛋白多肽，其包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

还提供了包含这些经修饰的免疫细胞中任一个的组合物、用途、试剂盒和制品。

附图说明

图1显示了来自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和慕尼黑沙门氏菌(S.muenchen)的鞭毛蛋白的示例性氨基酸序列和比对。N-末端处的斜体序列是N-末端结构域，而C-末端处的斜体序列是C-末端结构域。N-末端处的粗体且斜体序列是基序N，而C-末端处的粗体序列是基序C。非斜体序列属于插入高变结构域(intervening hypervariable domain)。

图2A说明了用GAAG接头(SEQ ID NO:36)代替来自鼠伤寒沙门氏菌的全长鞭毛蛋白的高变区，通过在N-和/或C-末端区进行逐步截短(progressive truncation)的鞭毛蛋白片段的设计。图2B-2D显示了图2A的示范性鞭毛蛋白片段的筛选结果。图2E显示了在图2B-2D的筛选中鉴定的具有生物活性的鞭毛蛋白片段的概要。

图3A显示了用可溶性全长鞭毛蛋白或其片段Flic-16a装甲的抗BCMA CAR的设计。图3B-3C显示了当在αβ(图3B)或γδ(图3C)T细胞上表达时，图3A的装甲的抗BCMA CAR对BCMA阳性靶细胞H929的细胞毒性作用。在实验中，仅表达抗BCMA CAR的T细胞(即，未装甲的)和未转导的T细胞用作对照。

图4A-4F显示了当与BCMA阳性H929细胞一起孵育时，表达用全长鞭毛蛋白或其片段Flic-16a装甲的抗BCMACAR的T细胞的细胞因子释放特征。在图4A-4C中，抗BCMA CAR在αβT细胞上表达。在图4D-4F中，抗BCMA CAR在γδT细胞上表达。在实验中，仅表达抗BCMA CAR的T细胞(即，未装甲的)和未转导的T细胞用作对照。图4A和4D显示了TNF-α的释放。图4B和4E显示了IFN-γ的释放。图4C和4F显示了IL-2的释放。

具体实施方式

本发明提供了表达包含全长鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的经修饰的免疫细胞，以及使用这些经修饰的免疫细胞治疗癌症的方法。鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如TLR5)。鞭毛蛋白多肽可以是跨膜分子或由经修饰的免疫细胞分泌。本文描述的经修饰的免疫细胞具有有效的肿瘤溶解活性并引发针对肿瘤部位的抗原特异性T细胞应答。

因此，本发明的一个方面提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由经修饰的免疫细胞分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽经由GPI接头与经修饰的免疫细胞的细胞膜结合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含跨膜结构域和衍生自共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含工程化受体，例如嵌合抗原受体、经修饰的T细胞受体或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。

还提供了包含这些经修饰的免疫细胞的组合物(例如，药物组合物)、试剂盒和制品，以及使用本文所述的经修饰的免疫细胞治疗癌症的方法。

I.定义

如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加生活质量、和/或延长存活。“治疗”还包括减少癌症的病理后果。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。

术语“预防(prevent)”和例如“预防(prevented、preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的复发或延迟疾病或病症的症状的复发。如本文所用，“预防(prevention)”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低疾病或病症的强度、作用，减少症状和/或负担。

如本文所用，“延迟(delaying)”癌症的发展是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。与不使用该方法相比，“延迟”癌症的发展的方法是在给定的时间范围内降低疾病发展的可能性和/或在给定的时间范围内降低疾病程度的方法。这样的比较通常基于使用统计学上显著数量的个体进行的临床研究。可以使用标准方法来检测癌症发展，这些标准方法包括但不限于计算机化轴向断层成像(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影术或活检。发展也可以指最初可能无法检测到的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。

本文所用的术语“有效量”是指足以治疗特定障碍、病症或疾病例如以改善、减轻、减少和/或延迟其一种或多种症状的药剂或药剂组合的量。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(例如，抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不希望的细胞增殖的量。在一些实施例中，有效量是足以延迟疾病发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量能够以一次或多次施用来进行施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、减慢、减缓并且优选地阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。

如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，个体是人。

“分离的”核酸是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。

如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。

如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将异源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是使用异源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。

“辅助治疗(Adjuvant setting)”是指其中个体具有癌症史且通常(但不一定)对疗法(包括但不限于手术(例如，手术切除)、放射疗法和化学疗法)有应答的临床治疗。然而，由于这些个体的癌症史，他们被认为有发展疾病的风险。“辅助治疗”中的治疗或施用是指随后的治疗方式。风险程度(例如，当处于辅助治疗中的个体被认为是“高风险”或“低风险”时)取决于几个因素，最通常是首次治疗时的疾病程度。

“新辅助治疗(Neoadjuvant setting)”是指其中在基本疗法/针对性疗法(definitive therapy)之前进行该方法的临床治疗。

将关于本文鉴定的多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在比对序列(将任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性％值(Edgar，R.C.，Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113,2004)。

如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指基因工程化受体，其将一个或多个抗原特异性地移植到细胞如T细胞上。CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施例中，CAR包含对肿瘤抗原有特异性的抗体的细胞外可变结构域和T细胞或其他受体的细胞内信号传导结构域，例如一个或多个共刺激结构域。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。

如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指包含细胞外抗原结合结构域的内源或经修饰的T细胞受体，该细胞外抗原结合结构域与MHC分子中结合的特异性抗原肽结合。在一些实施例中，TCR包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施例中，TCR包含TCRγ多肽链和TCRδ多肽链。在一些实施例中，TCR特异性结合肿瘤抗原。“TCR-T”是指表达重组TCR的T细胞。

如本文所用，“T细胞抗原偶联物受体”或“TAC受体”是指包含与特异性抗原结合的细胞外抗原结合结构域和T细胞受体(TCR)结合结构域、跨膜结构域及共受体分子的细胞内结构域的工程化受体。TAC受体指定表达TAC受体的T细胞的内源TCR以引发针对靶细胞的抗原特异性T细胞应答。

本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，这些抗体结构包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)

如本文所用，术语“结合”、“特异性结合”或“对……有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如，结合或特异性结合靶标(可以是表位)的抗体是与其结合其他靶标相比以更大亲和力、亲合力、就绪性和/或更长持续时间结合该靶标的抗体。在一个实施例中，抗体与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的抗体与靶标的结合程度的约10％。在某些实施例中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。在某些实施例中，抗体与来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位特异性结合。在另一个实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。

术语“细胞”包括原代目标细胞及其子代。

应当理解，本文所述的本发明的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。

本文对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。

如本文所用，对“不是”值或参数的提及通常意指并描述“不同于”值或参数。例如，方法不是用于治疗X型癌症，意味着该方法用于治疗不同于X型的癌症。

本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。

如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“这些/该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。

应理解的是，为清楚起见，在单独的实施例的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的背景下描述的本发明的不同特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。涉及本文所述的经修饰的免疫细胞和治疗方法的实施例的所有组合均明确涵盖于本发明中，并且就如同每个组合被个别且明确地披露一样披露在本文中。此外，在描述此类变量的实施例中列出的经修饰的免疫细胞的所有子组合也均明确涵盖于本发明中，并且就如同蛋白质的每个这种子组合在本文中被个别且明确地披露一样披露在本文中。

II.经修饰的免疫细胞

本发明的一个方面提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体。在一些实施例中，toll样受体选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽被分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含工程化受体，例如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和树突状细胞(DC)激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的分泌性鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段和锚定GPI的肽序列的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段和跨膜结构域的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5；以及编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体是CAR，例如抗BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的分泌性鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)；以及编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化受体是CAR，例如抗BCMACAR。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段和锚定GPI的肽序列的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)；以及编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。在一些实施例中，工程化受体是CAR，例如抗BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段和跨膜结构域的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)；以及编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，工程化受体是CAR，例如抗BCMACAR。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)；以及编码工程化受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，工程化受体是CAR，例如抗BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，toll样受体选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽被分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含锚定GPI的肽序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了表达TCR的免疫细胞(例如，TCR-T细胞)，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，toll样受体选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽被分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含锚定GPI的肽序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了表达TAC的免疫细胞(例如，TAC-T细胞)，其包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，toll样受体选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽被分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含锚定GPI的肽序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，该鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，该鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，该鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，该鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，该鞭毛蛋白多肽包含与SEQ IDNO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列，该鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。在一些实施例中，免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。

免疫细胞

经修饰的免疫细胞可衍生自多种细胞类型和细胞来源。本文考虑了来自任何哺乳动物物种的细胞，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴和人。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是人细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞与接受者个体是同种异体的(即，来自相同的物种，但不同的捐赠者)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是自体的(即，捐赠者和接受者是相同的)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是同基因的(即，捐赠者和接受者是不同的个体，但是为同卵双胞胎)。

在一些实施例中，经修饰的免疫细胞衍生自原代细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是分离自个体的原代细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞从分离自个体的原代细胞繁殖(例如，增殖和/或分化)。在一些实施例中，原代细胞是造血谱系的细胞。在一些实施例中，原代细胞获自胸腺。在一些实施例中，原代细胞获自淋巴或淋巴结(例如，肿瘤引流淋巴结)。在一些实施例中，原代细胞获自脾。在一些实施例中，原代细胞获自骨髓。在一些实施例中，原代细胞获自血液，例如外周血。在一些实施例中，原代细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，原代细胞衍生自血浆。在一些实施例中，原代细胞衍生自肿瘤。在一些实施例中，原代细胞获自粘膜免疫系统。在一些实施例中，原代细胞获自活检样品。

在一些实施例中，经修饰的免疫细胞衍生自细胞系。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞获自商业细胞系。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是从分离自个体的原代细胞建立的细胞系。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞从细胞系繁殖(例如，增殖和/或分化)。在一些实施例中，细胞系是短命(mortal)细胞系。在一些实施例中，细胞系是永生化(immortalized)细胞系。在一些实施例中，细胞系是肿瘤细胞系，例如白血病或淋巴瘤细胞系。在一些实施例中，细胞系是衍生自PBMC的细胞系。在一些实施例中，细胞系是干细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由HEK293-6E细胞、NK-92细胞和Jurkat细胞组成的组。

可用于本发明的示例性免疫细胞包括但不限于树突状细胞(包括未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞)、T淋巴细胞(例如初始T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤T细胞、Treg细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞及其组合。免疫细胞亚群可以通过本领域已知的一种或多种细胞表面标记(例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)的存在或不存在来定义。在药物组合物包含多个经修饰的免疫细胞的情况下，这些经修饰的免疫细胞可以是免疫细胞类型的特定亚群、免疫细胞类型的亚群的组合、或者两种或更多种免疫细胞类型的组合。在一些实施例中，免疫细胞存在于同质细胞群中。在一些实施例中，免疫细胞存在于可在免疫细胞中增强的异质细胞群中。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞不是淋巴细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞适用于过继免疫疗法。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是PBMC。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是衍生自PBMC的免疫细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是CD4

在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是CD8

在一些实施例中，经修饰的免疫细胞衍生自干细胞。在一些实施例中，干细胞是全能干细胞。在一些实施例中，干细胞是多能干细胞。在一些实施例中，干细胞是单能干细胞。在一些实施例中，干细胞是祖细胞。在一些实施例中，干细胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，干细胞是造血干细胞。在一些实施例中，干细胞是间充质干细胞。在一些实施例中，干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。

经修饰的免疫细胞可包含任何数量(例如，1、2、3、4、5、10、50、100、1000或更多个)的异源核酸序列(包括第一和第二核酸序列)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含单拷贝的第一和/或第二异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含多拷贝的第一和/或第二异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含至少一个另外的异源核酸序列，例如，编码免疫调节剂如细胞因子、趋化因子和/或免疫检查点抑制剂的异源核酸序列。

可以将包含本文所述的一个或多个异源核酸序列的一种或多种核酸瞬时或稳定掺入经修饰的免疫细胞中。在一些实施例中，一种或多种核酸在经修饰的免疫细胞中瞬时表达。例如，一种或多种核酸能以染色体外阵列存在于经修饰的免疫细胞的细胞核中。可以使用本领域已知的任何转染或转导方法(包括病毒或非病毒方法)，将一种或多种核酸引入经修饰的免疫细胞中。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，例如使用磷酸钙、树状聚合物、脂质体或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，例如电穿孔、细胞挤压、声致穿孔、光学转染、刺穿转染(impalefection)、原生质体融合、流体动力学递送或转座子；基于粒子的方法，例如使用基因枪、磁性转染(magnectofection)或磁辅助转染、粒子轰击；以及杂交方法，例如核转染。

在一些实施例中，一个或多个异源核酸序列存在于经修饰的免疫细胞的基因组中。例如，可以通过本领域已知的任何方法将包含一个或多个异源核酸序列的一种或多种核酸整合到经修饰的免疫细胞的基因组中，这些方法包括但不限于病毒介导的整合、随机整合、同源重组方法和定点整合方法，例如使用位点特异性重组酶或整合酶、转座酶、转录激活因子样效应物核酸酶

鞭毛蛋白多肽

本文所述的经修饰的免疫细胞表达能够结合toll样受体(TLR)的鞭毛蛋白多肽。本申请还提供了鞭毛蛋白多肽及其组合物。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段的分泌性鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段和锚定GPI的肽序列的鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段和GPI接头的鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段和跨膜结构域的鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。

在一些实施例中，提供了包含鞭毛蛋白或其片段、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域的鞭毛蛋白多肽，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组的TLR。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5同源二聚体。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR4/TLR5异源二聚体。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR11。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合多于一种TLR。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5同源二聚体和TLR4/TLR5异源二聚体两者。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽能够结合TLR5和TLR11。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽与TLR的结合亲和力为约10

鞭毛蛋白多肽可衍生自结合TLR(例如TLR5)和/或引发免疫应答的任何天然存在的鞭毛蛋白。鞭毛蛋白是鞭毛的结构组分，鞭毛是一种主要与革兰氏阴性细菌有关的运动器官。它的特征是具有插入高变结构域的高度保守的N-和C-末端结构域，该插入高变结构域在不同细菌物种中具有高度可变的序列和长度。已经解析了肠道沙门氏菌FliC鞭毛蛋白的三维结构(PDB条目IUCU)，其显示鞭毛蛋白的N-末端和C-末端结构域形成卷曲螺旋结构域D0和D1，并且插入高变结构域D2和D3主要由β链组成。D1中的N-末端螺旋束后接两个β转角和一个β发夹。参见Samatey F.A.等人Nature(2001)410:331-337。基于202个鞭毛蛋白序列的比对，发现所有鞭毛蛋白在N-末端处含有从起始密码子起约140个残基的保守块，对应于ND0、ND1a和ND1b亚结构域和β转角。而且，所有鞭毛蛋白在C-末端处含有约90个残基的保守块，对应于CD1和CD0螺旋。参见Beatson SA等人(2006)TRENDS in Microbiology14(4):151-155。已经对慕尼黑沙门氏菌鞭毛蛋白(SEQ ID NO:2)进行了诱变研究，该研究鉴定了鞭毛蛋白促炎信号传导所需的“基序N”和“基序C”。基序N对应于慕尼黑沙门氏菌鞭毛蛋白的N-末端的氨基酸残基95-108，基序C对应于慕尼黑沙门氏菌鞭毛蛋白的C-末端的氨基酸残基441-449，其中氨基酸编号基于SEQ ID NO:2。参见Murthy KGK等人J.Biol.Chem.(2004)279(7):5667-5675；以及Donnelly MA和Steiner TS.J.Biol.Chem.(2002)277(43):40456-40461。图1显示了三个示例性细菌鞭毛蛋白序列(SEQ ID NO:1-3)与相应结构域和基序的比对。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽衍生自革兰氏阳性细菌的鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽衍生自选自下组的物种的细菌的鞭毛蛋白，该组由以下组成：沙雷氏菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、李斯特菌属、沙门氏菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽衍生自沙门氏菌属物种，例如鼠伤寒沙门氏菌或慕尼黑沙门氏菌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽衍生自大肠杆菌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽衍生自弧菌属物种，例如创伤弧菌，例如创伤弧菌的FlaB。参见Lee SE等人,Infection and Immunity,74(1):694-702(2006)；Zheng JH等人,Sci.Trans.Med.9:eaak9537(2017)。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:1-3和8组成的组的氨基酸序列。全长鞭毛蛋白序列是本领域已知的，包括但不限于具有UniProt(worldwide web.uniprot.org)登录号Q9ZBA2、Q7MMU2、Q7MIM4、Q56702、Q9KQ61、Q56574、Q56571、O34221、Q7MIM5、Q56703、Q56572、O34223、Q6R4Q0、Q6R4P9、Q5E3N9、Q5E322、Q9KQ60、Q56570、Q7MIM3、O87081、Q6R4Q1、Q60246、Q58FG3、Q7MMU6、Q5E3N5、Q6LTQ2、Q6LTQ1、Q8ECA6、Q8ECA5、Q9R9R9、Q5MBN1、Q5MBN0、O30377、O30376、Q5QZT0、Q884Y7、Q76M63、Q8VS56、Q52079、P21990、P21991、P21989、Q73NZ6、Q9KWX0、Q9KWW9、Q73MN3、P21992、Q9ANU7、Q72S55、P80160、Q5XPI2、Q26501、Q9WZL7、Q8RCD3、Q9KCU2、P02968、Q65EB8、Q5WBM8、Q8EMW3、O69136、Q8RRA1、Q893U2、Q8RR97、Q5KV70、Q8RRA0、Q05203、Q5KV59、Q67K41、Q6QA53、Q52694、O31059、Q6QA52、Q9S526、Q9RQU7、Q9FA23、Q9S0T2、Q93ES1、Q842B7、Q9L9M2、Q83XM5、Q842D2、Q6VMU0、Q9L9M0、Q842D5、Q93ES3、Q842B4、Q9L9M1、Q842A8、Q6VMT9、Q6VMU2、Q5PEW3、Q53834、Q6V2P2、Q75SX0、Q7N5J4、Q56826、Q54444、P13713、Q8GNT8、Q75SX7、Q75SY3、Q75SW4、Q74UY9、Q66PN8、P42273、P42272、Q76DK5、Q6V2M6、Q54864、Q6V2U0、Q56912、Q5DW30、Q8RST5、Q8D3D7、O33578、Q81SF2、Q63D82、Q73AJ3、Q6HKP2、Q81FD5、Q79AJ2、Q79AJ1、Q73AJ4、Q6HKP3、Q81FD6、Q5Y833、Q6LW29、Q93TL9、Q93TL8、Q9AET1、Q03473、Q7NTP3、Q5DY03、Q8CZT1、Q9XB38、Q6VYQ2、Q7TTM9、Q07911、Q07910、Q7VF81、Q9XB37、Q7M7N1、Q56746、Q9R954、Q6L5K3、Q6L5K0、P96751、Q93GT1、P46210、O67803、Q89NY8、Q6NC33、Q9REF9、Q9F4K8、Q9F4K7、P96307、P96309、P96308、Q03842、P58330、P13119、P13118、Q6QMR9、O34166、Q52943、Q89F36、Q89F35、Q98HD0、Q98HC9、O52068、Q43896、P18914、Q5LMV3、Q5FST5、Q6AGB4、Q9KGT9、Q6AMN5、Q6AJQ8、Q748G4、Q6H8R2、Q6MIU6、Q6MI33、Q6MQ75、Q6MQ77、Q729A8、Q72AB5、Q72C43、Q9FAE7、Q8P9C4、Q5GZN6、Q8PL31、Q82UA3、Q48824、Q5X5M6、P53606、Q7NRA5、Q7NRA4、Q9Z3A8、O68144、Q9S639和Q76BR3的序列。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含能够结合TLR的天然存在的鞭毛蛋白的一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的基序N，其对应于SEQ IDNO:2的氨基酸95-108。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的基序C，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸441-449。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含基序N和基序C。

在一些实施例中，鞭毛蛋白或其片段包含至少约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600个或更多个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白或其片段包含不多于约600、550、500、450、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50个或更少个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白或其片段包含约50-60、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-150、100-200、100-250、150-250、250-500或50-550个氨基酸中的任一个。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的N-末端结构域，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-172。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-172。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含如Beatson SA等人(2006)TRENDS in Microbiology 14(4):151-155所述的N-末端结构域中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的截短的C-末端结构域，其在N-末端处缺少不多于约95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5个或更少个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的截短的N-末端结构域，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-172、81-172或95-172。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的C-末端结构域，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸418-505。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸418-505。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含如Beatson SA等人(2006)TRENDS in Microbiology 14(4):151-155所述的C-末端结构域中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的截短的N-末端结构域，其在C-末端处缺少不多于约45、40、35、30、25、20、15、10、5个或更少个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的截短的C-末端结构域，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸450-505、460-505、470-505或481-505。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的N-末端结构域和C-末端结构域两者。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的如本文所述截短的N-末端结构域和天然存在的鞭毛蛋白的C-末端结构域中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的N-末端结构域和天然存在的鞭毛蛋白的如本文所述截短的C-末端结构域中的任一个。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的如本文所述截短的N-末端结构域中的任一个和天然存在的鞭毛蛋白的如本文所述截短的C-末端结构域中的任一个。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的截短的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的截短的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:9-32的氨基酸序列中任一个的N-末端结构域，和/或SEQ ID NO:9-32的氨基酸序列中任一个的C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:9-32的氨基酸序列中任一个的N-末端结构域和C-末端结构域。在一些实施例中，N-末端结构域经由包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的肽接头(GAAG)与C-末端结构域融合。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白的插入高变结构域或其一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽不包含天然存在的鞭毛蛋白的插入高变结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有与C-末端结构域或其截短片段融合的N-末端结构域或其截短片段的融合蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含位于N-末端结构域或其截短片段和C-末端结构域或其截短片段之间的肽接头。在一些实施例中，肽接头衍生自天然存在的鞭毛蛋白的插入高变结构域。在一些实施例中，肽接头不对应于天然存在的鞭毛蛋白的任何插入高变结构域序列。在一些实施例中，肽接头是柔性肽接头。在一些实施例中，肽接头具有低免疫原性。在一些实施例中，肽接头的长度为至少约5、10、15、20、25、30、40、50、72、100个或更多个氨基酸中的任一个。

鞭毛蛋白多肽可包含位于不同结构域之间的一个或多个肽接头。例如，N-末端结构域(例如，截短的N-末端结构域)和C-末端结构域(例如，截短的C-末端结构域)可以经由肽键或经由肽接头彼此融合。连接不同结构域的肽接头可以相同或不同。每个肽接头可以单独优化。肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，肽接头的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50个或更多个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，肽接头的长度为不多于约50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，肽接头的长度为以下中的任一个：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、或约1个氨基酸至约50个氨基酸。

肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。在一些实施例中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含天然存在的鞭毛蛋白或其片段的氨基酸序列变体(例如，N-末端结构域或截短的N-末端结构域，和/或C-末端结构域或截短的C-末端结构域)。例如，可能需要改善鞭毛蛋白多肽的结合亲和力和/或其他生物性质。鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列变体可通过将适当的修饰引入编码鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征，例如TLR结合和/或促炎活性。用于测定鞭毛蛋白多肽活性的测定法是本领域已知的，例如参见Murthy KGK等人J.Biol.Chem.(2004)279(7):5667-5675；Donnelly MA和Steiner TS.J.Biol.Chem.(2002)277(43):40456-40461；以及Crellin NK等人J.Immunol.(2005)175:8051-8059。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与天然存在的鞭毛蛋白或其片段的序列相比具有一个或多个(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20个或更多个氨基酸)保守取代的鞭毛蛋白或其片段。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与天然存在的鞭毛蛋白或其片段的序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性中的任一个)的鞭毛蛋白或其片段。

保守取代示于下表1中。

表1：保守取代

氨基酸可以根据共同的侧链性质分成不同的类别：

a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

c.酸性：Asp、Glu；

d.碱性：His、Lys、Arg；

e.影响链取向的残基：Gly、Pro；

f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。

本领域技术人员将认识到，可使用任何合适的方法在目的基因中产生突变，包括诱变、聚合酶链反应、同源重组或本领域技术人员已知的任何其他基因工程技术。突变可涉及单个核苷酸(例如点突变，其涉及DNA序列内单个核苷酸碱基的去除、添加或取代)或者可涉及大量核苷酸的插入或缺失。突变可由于例如DNA复制的保真度错误等事件而自发产生，或在暴露于化学或物理诱变剂后被诱导。也可以通过使用本领域技术人员熟知的特定靶向方法进行定点突变。

如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向诱变的多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，鉴定靶残基的残基或残基组(例如，带电荷的残基，例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定多肽试剂与其靶标(例如，鞭毛蛋白变体和TLR5)的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，可确定鞭毛蛋白：TLR5复合物的晶体结构以鉴定鞭毛蛋白与TLR5之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可以被靶向或消除作为取代候选。可以筛选变体以确定它们是否含有所希望的性质。

氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的鞭毛蛋白多肽。在Donnelly MA和SteinerTS.J.Biol.Chem.(2002)277(43):40456-40461中描述了保留促炎性质的大肠杆菌鞭毛蛋白的示例性取代和插入变体。

示例性工程化鞭毛蛋白多肽序列示于图1和下表2中。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

表2.

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽从经修饰的免疫细胞分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含信号肽。信号肽(也称为“前导序列”)通常紧接在起始Met之后插入蛋白质的N-末端。鞭毛蛋白多肽从经修饰的免疫细胞输出后，信号肽可能会被切割，从而形成成熟蛋白质。信号肽可以是天然的或合成的，并且它们可以与它们所附接的蛋白质是异源或同源的。信号肽的选择是广泛的并且是本领域技术人员可访问的，包括例如在由新加坡国立大学生物化学系维护的在线前导序列数据库中。参见Choo等人,BMC Bioinformatics,6:249(2005)；和PCT公开号WO 2006/081430。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)接头。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽在C-末端处包含锚定GPI的多肽序列。锚定GPI的多肽序列是本领域已知的，包括但不限于人LFA3、CD44、CD59、人Fcγ受体III(CD16b)的GPI锚序列。参见Kueng等人,J Virol,2007,81(16):8666-8676。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含可直接或间接融合至鞭毛蛋白或其片段的跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜(优选真核细胞膜)中是热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的鞭毛蛋白多肽的跨膜结构域可获自天然存在的蛋白质。可替代地，它可以是合成的、非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中是热力学稳定的疏水性蛋白质区段。

基于跨膜结构域的三维结构对跨膜结构域进行分类。例如，跨膜结构域可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶、或能够穿越细胞磷脂双层的任何其他稳定结构。此外，跨膜结构域也可以或可替代地基于跨膜结构域拓扑学进行分类，包括跨膜结构域穿过膜的通过次数和蛋白质的取向。例如，单次穿膜蛋白穿过细胞膜一次，而多次穿膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2、3、4、5、6、7次或更多次)。膜蛋白可以被定义为I型、II型或III型，这取决于它们的末端和一个或多个穿过膜的区段相对于细胞内部和外部的拓扑学。I型膜蛋白具有单个穿膜区(membrane-spanning region)，并且其取向为使得蛋白质的N-末端存在于细胞脂质双层的细胞外侧，而蛋白质的C-末端存在于胞内侧。II型膜蛋白也具有单个穿膜区，但其取向为使得蛋白质的C-末端存在于细胞脂质双层的细胞外侧，而蛋白质的N-末端存在于胞内侧。III型膜蛋白具有多个穿膜区段，并且可以基于跨膜区段的数量以及N-和C-末端的位置进一步细分。

在一些实施例中，本文所述的鞭毛蛋白多肽的跨膜结构域衍生自I型单次穿膜蛋白。在一些实施例中，来自多次穿膜蛋白的跨膜结构域也可适用于本文所述的鞭毛蛋白多肽。多次穿膜蛋白可包含复杂的(至少2、3、4、5、6、7个或更多个)α螺旋或β折叠结构。优选地，多次穿膜蛋白的N-末端和C-末端存在于脂质双层的相对侧，例如，蛋白质的N-末端存在于脂质双层的胞内侧，而蛋白质的C-末端存在于细胞外侧。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Lyl08)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自CD8α。

用于本文所述的鞭毛蛋白多肽的跨膜结构域还可包含合成的、非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施例中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施例中，蛋白质区段为至少约20个氨基酸，例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906B1和PCT公开号WO 2000/032776 A2中，其相关披露内容通过引用并入本文。

跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域的C-末端侧的胞内区。跨膜结构域的胞内区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施例中，有助于使跨膜结构域在脂质双层中定向。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞内区中。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。

在一些实施例中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽的跨膜结构域包含人工疏水性序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于跨膜结构域的C末端处。在一些实施例中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施例中，跨膜区是疏水性的。在一些实施例中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的亲水性或者疏水性或亲水性特征可以通过本领域已知的任何方法来评估，例如Kyte和Doolittle亲水性分析。

鞭毛蛋白多肽可包含位于鞭毛蛋白或其片段与跨膜结构域之间的铰链区。铰链区是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和一个或两个结构域相对于彼此的运动。可以使用提供鞭毛蛋白或其片段的这种柔性和相对于鞭毛蛋白多肽中的跨膜结构域的运动的任何氨基酸序列。

铰链区可含有约10-100个氨基酸，例如约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，铰链区的长度可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一个。

在一些实施例中，铰链区是天然存在的蛋白质的铰链区。本领域已知的包含铰链区的任何蛋白质的铰链区适用于本文所述的鞭毛蛋白多肽。在一些实施例中，铰链区是天然存在的蛋白质的铰链区的至少一部分，并且赋予鞭毛蛋白多肽柔性。在一些实施例中，铰链区衍生自CD8α。在一些实施例中，铰链区是CD8α的铰链区的一部分，例如，含有CD8α的铰链区的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。

抗体(例如，IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链区也适用于本文所述的鞭毛蛋白多肽。在一些实施例中，铰链区是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链区。在一些实施例中，铰链区是抗体的铰链区，并且包含抗体的铰链区和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施例中，铰链区包含抗体的铰链区和抗体的CH3恒定区。在一些实施例中，铰链区包含抗体的铰链区以及抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施例中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区以及CH2和CH3恒定区。在一些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。

非天然存在的肽也可用作鞭毛蛋白多肽的铰链区。在一些实施例中，铰链区是肽接头，例如(GxS)n接头，其中x和n独立地可以是3至12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内信号转导以诱导免疫应答(例如，效应子功能)的蛋白质的至少一部分。本文所述的鞭毛蛋白多肽的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的胞内信号传导结构域，其转导信号并调节由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、DC、淋巴结(LN)基质细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)介导的应答。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的胞内部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(例如，T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖和存活。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含单个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(例如，约2、3、4个或更多个中的任一个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域，例如CD28的两个拷贝的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白(例如，本文所述的任两个或更多个共刺激蛋白)的两个或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域经由任选的肽接头彼此融合。一个或多个共刺激信号传导结构域能以任何合适的顺序排列。多个共刺激信号传导结构域可提供累加或协同刺激作用。

宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的激活可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域可适用于本文所述的鞭毛蛋白多肽。共刺激信号传导结构域的一种或多种类型基于例如鞭毛蛋白多肽将在其中表达的免疫细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、DC、基质细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所希望的免疫效应子功能等因素来选择。用于鞭毛蛋白多肽的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白的胞内信号传导结构域，包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。

在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(即CD137)、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽中的细胞内信号传导结构域包含衍生自CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽中的细胞内信号传导结构域包含衍生自4-1BB(即CD137)的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽中的细胞内信号传导结构域包含衍生自OX40的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽中的细胞内信号传导结构域包含衍生自DAP10的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽中的细胞内信号传导结构域包含衍生自CD27的共刺激信号传导结构域。

本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体也在本披露的范围内，使得共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施例中，与野生型对应物相比，共刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变化(例如，1、2、3、4、5或8个)。包含一个或多个氨基酸变化的此类共刺激信号传导结构域可称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的增加和增强的对免疫应答的刺激。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的减少和降低的对免疫应答的刺激。

在一些实施例中，其中鞭毛蛋白多肽包含GPI接头或跨膜结构域，鞭毛蛋白多肽还包含信号肽，该信号肽将鞭毛蛋白多肽靶向细胞(例如，ER)的分泌途径，并且将允许鞭毛蛋白多肽整合和锚定到宿主细胞的脂质双层中。适用于本文所述的跨膜鞭毛蛋白多肽且包含天然存在的蛋白质的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列的信号肽对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施例中，信号肽衍生自选自由CD8α、GM-CSF受体α、IL-3和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施例中，信号肽衍生自CD8α。

在一些实施例中，可以包括肽标签(通常是能够被可获得的抗血清或化合物识别的短肽序列)用于随后鞭毛蛋白多肽的表达和运输。多种标签肽可用于本文所述的鞭毛蛋白多肽，但不限于PK标签、FLAG八肽、MYC标签、HIS标签(通常为4至10个组氨酸残基的一段)和e-标签(US 6，686，152)。当使用几个标签时，一个或多个标签肽可以独立地位于蛋白质的N-末端、其C-末端、内部或这些位置中的任一处。可以使用抗标签抗体通过免疫检测测定法检测标签肽。

工程化受体

上述任何经修饰的免疫细胞可以进一步表达工程化受体。示例性工程化受体包括但不限于CAR、工程化TCR和TAC受体。在一些实施例中，工程化受体包含特异性结合抗原(例如，肿瘤抗原)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含TCR共受体的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，工程化受体由编码鞭毛蛋白多肽的异源核酸序列编码。在一些实施例中，工程化受体由可操作地连接至启动子(例如，组成型启动子或诱导型启动子)的第二异源核酸编码。在一些实施例中，通过将蛋白质插入细胞膜中同时使细胞通过微流体系统(例如，CELL

在一些实施例中，工程化受体包含靶向至少一种肿瘤抗原的一个或多个特异性结合结构域，和一个或多个细胞内效应结构域，例如一个或多个初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。

在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。许多嵌合抗原受体是本领域已知的并且可以适用于本发明的经修饰的免疫细胞。也可以通过使用例如抗体分子的抗原结合片段或抗体可变结构域将CAR构建为对任何细胞表面标记具有特异性。本文可以使用产生CAR的任何方法。参见，例如US 6,410,319、US7,446,191、US 7,514,537、US9765342B2、WO 2002/077029、WO 2015/142675、US2010/065818、US 2010/025177、US 2007/059298、WO 2017025038 A1以及Berger C.等人,J.Clinical Investigation 118:1 294-308(2008)，将这些文献通过引用特此并入。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是CAR-T细胞。

本发明的CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞外结构域包含特异性结合至少一种肿瘤抗原的至少一个靶向结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域产生促进含CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指增强或促进靶细胞的免疫攻击的例如免疫效应子细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答可以指促进靶细胞的杀伤或者靶细胞生长或增殖的抑制的T细胞或NK细胞的性质。例如在CAR-T细胞中的免疫效应子功能的实例包括细胞溶解活性(例如，抗体依赖性细胞毒性或ADCC)和辅助活性(例如，细胞因子的分泌)。在一些实施例中，CAR具有细胞内信号传导结构域，其具有减弱的免疫效应子功能。在一些实施例中，与具有全长和野生型CD3ζ以及任选的一个或多个共刺激结构域的CAR相比，该CAR具有不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少中任一个的免疫效应子功能(例如，针对靶细胞的细胞溶解功能)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域产生促进含CAR的细胞的增殖和/或存活的信号。在一些实施例中，CAR包含选自CD28、CD137、CD3、CD27、CD40、ICOS、GITR和OX40的信号传导结构域的一个或多个细胞内信号传导结构域。天然存在的分子的信号传导结构域可包含分子或其片段或衍生物的整个细胞内(即胞内)部分或整个天然细胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”是指以刺激性方式起作用以诱导免疫效应子功能的胞内信号传导序列。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12组成的组的蛋白质的非功能性或减弱的信号传导结构域。非功能性或减弱的信号传导结构域可以是具有减弱或消除一种或多种免疫效应子功能(例如，细胞溶解活性或辅助活性，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的点突变、插入或缺失的突变信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含非功能性或减弱的CD3ζ(即CD3ζ或CD3z)信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域不包含初级细胞内信号传导结构域。与具有相同构建体但具有野生型初级细胞内信号传导结构域的CAR相比，减弱的初级细胞内信号传导结构域可诱导不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少中任一个的免疫效应子功能(例如，针对靶细胞的细胞溶解功能)。

在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含一个或多个(例如，1、2、3个或更多个中的任一个)共刺激结构域。“共刺激结构域”可以是共刺激分子的细胞内部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(例如，T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖和存活。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子可表示为以下蛋白质家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活性NK细胞受体。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性结合CD83的配体。

在一些实施例中，CAR包含单个共刺激结构域。在一些实施例中，CAR包含两个或更多个共刺激结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含功能性初级细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施例中，CAR不包含功能性初级细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)。在一些实施例中，CAR包含由一个或多个共刺激结构域组成或基本上由其组成的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含由非功能性或减弱的初级细胞内信号传导结构域(例如，突变CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成或基本上由其组成的细胞内信号传导结构域。在靶向结构域与肿瘤抗原结合后，CAR的共刺激结构域可转导信号以增强具有CAR的工程化免疫细胞(例如，T细胞)的增殖、存活和分化，并抑制激活诱导的细胞死亡。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域衍生自选自由以下组成的组的一个或多个分子：CD27、CD28、4-1BB(即CD137)、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含衍生自CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，本申请的嵌合受体中的细胞内信号传导结构域包含衍生自4-1BB(即CD137)的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。

在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含多肽，该多肽从N-末端到C-末端包含：CD28的共刺激信号传导结构域、4-1BB的共刺激信号传导结构域和CD3ζ的胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，CAR的靶向结构域是抗体或抗体片段，例如scFv、Fv、Fab、(Fab’)

在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如WO 2017/025038，将其以全文并入本文。图3A显示了示例性CAR构建体。在一些实施例中，抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：CD8前导序列、抗BCMAsdAb、CD8铰链、CD8跨膜、4-1BB细胞内共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMACAR包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Lyl08)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域是CD4、CD3、CD8α或CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含CD8α的跨膜结构域。

在一些实施例中，细胞外结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施例中，铰链区包含CD8α的铰链区。

在一些实施例中，CAR包含信号肽，例如CD8αSP。

在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体。在一些实施例中，工程化TCR对肿瘤抗原有特异性。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(例如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原衍生自肿瘤细胞的细胞内蛋白质。已经描述了许多对肿瘤抗原(包括肿瘤相关抗原)有特异性的TCR，包括例如NY-ESO-1癌-睾丸抗原，p53肿瘤抑制抗原，针对黑素瘤(例如，MARTI、gp100)、白血病(例如，WT1、次要组织相容性抗原)和乳腺癌(例如，HER2、NY-BR1)中肿瘤抗原的TCR。本领域已知的任何TCR可用于本申请。在一些实施例中，TCR对肿瘤抗原具有增强的亲和力。例如在US 5830755和Kessels等人Immunotherapythrough TCR gene transfer.Nat.Immunol.2，957-961(2001)中描述了示例性TCR和用于将这些TCR引入免疫细胞中的方法。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是TCR-T细胞。

TCR受体复合物是由可变TCR受体α和β链(在γδT细胞情况下为γ和δ链)与三个二聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)ζ/ζ或ζ/η形成的八聚体复合物。每个亚基的跨膜结构域中的可电离残基形成将复合物保持在一起的相互作用的极性网络。TCR复合物具有激活T细胞中信号传导级联的功能。

在一些实施例中，工程化受体是包含一种或多种T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的工程化TCR。例如在US 20170166622 A1中描述了示例性TFP，将其通过引用并入本文。在一些实施例中，TFP包含TCR亚基的细胞外结构域，该TCR亚基包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，TFP包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，TFP包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。

在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。

在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。

在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。

在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。

在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。

在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。例如在US20160368964 A1中描述了示例性TAC受体，将其通过引用并入本文。在一些实施例中，TAC包含靶向结构域、特异性结合与TCR复合物相关的蛋白质的TCR结合结构域和T细胞受体信号传导结构域。在一些实施例中，靶向结构域是特异性结合肿瘤抗原的抗体片段，例如scFv或V

T细胞共受体在T细胞上表达为膜蛋白。它们可稳定TCR:肽:MHC复合物并促进信号转导。T细胞共受体的两种亚型CD4和CD8对特定MHC类型表现出强特异性。CD4共受体仅能稳定TCR:MHC II复合物，而CD8共受体仅能稳定TCR:MHC I复合物。CD4和CD8在不同T细胞类型上的差异表达导致不同的T细胞功能亚群。CD8+T细胞是细胞毒性T细胞。

CD4是在免疫细胞(例如，T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的表面上表达的糖蛋白。CD4具有暴露于细胞外细胞表面的四个免疫球蛋白结构域(D

CD8是由两条α链构成的同源二聚体(较不常见)或由一条α链和一条β链构成的异源二聚体(较常见)的糖蛋白，它们各自包含通过细柄(thin stalk)与膜连接的免疫球蛋白可变(IgV)样细胞外结构域和细胞内尾部。CD8主要在细胞毒性T细胞的表面上表达，但也可以在自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突状细胞中发现。CD8胞内尾部与Lck相互作用，一旦TCR结合其特异性抗原就会磷酸化TCR复合物的胞内CD3和ζ链。胞内CD3和ζ链上的酪氨酸磷酸化引发磷酸化级联，最终导致基因转录。

在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达多于一种工程化受体，例如CAR、TCR、TAC受体的任何组合。

在一些实施例中，由经修饰的免疫细胞表达的工程化受体(例如CAR、TCR或TAC)靶向一种或多种肿瘤抗原。肿瘤抗原是由可引发免疫应答、特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的靶向抗原的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2(ephrinB2)、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

在一些实施例中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达许多可用作免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，例如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。又另一组靶抗原是癌胚胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤所特有的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(例如，CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。

在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，并且不存在于体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所特有的，相反，它也可以在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可能是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统不成熟且不能作出应答，或者它们可能是在正常细胞上通常以极低的水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如艾伯斯坦-巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

核酸

本文所述的经修饰的免疫细胞包含编码本文所述的鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体中任一种的一个或多个异源核酸序列。

在一些实施例中，提供了分离的核酸，其包含编码本文所述的鞭毛蛋白多肽中任一种的核酸序列。在一些实施例中，提供了分离的核酸，其包含编码本文所述的工程化受体中任一种的核酸序列。在一些实施例中，核酸是DNA。在一些实施例中，核酸是RNA。在一些实施例中，核酸是线性的。在一些实施例中，核酸是环状的。

编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列和/或编码工程化受体的核酸可以可操作地连接至一个或多个调节序列。控制编码序列的转录和/或翻译的示例性调节序列是本领域已知的，并且可以包括但不限于启动子；用于转录的适当起始、调节和/或终止(例如，polyA转录终止序列)，mRNA转运(例如，核定位信号序列)、加工(例如，剪接信号)、稳定性(例如，内含子和非编码5’和3’序列)、翻译(例如，起始Met、三联体前导序列、IRES核糖体结合位点、信号肽等)的另外的元件；以及用于将插入物引入病毒载体中的插入位点。在一些实施例中，调节序列是启动子、转录增强子和/或允许鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体正确表达的序列。

术语“调节序列”或“控制序列”是指影响与其可操作地连接的编码序列的表达的DNA序列。此类调节序列的性质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，调节序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，调节序列包括启动子、终止子和在一些情况下的增强子、反式激活因子或转录因子。

术语“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并置。与编码序列“可操作地连接”的调节序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达在与调节序列相容的条件下完成。

如本文所用，“启动子”或“启动子区”是指控制与其可操作地连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA区段。启动子区包括涉及RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。此外，启动子包括调节RNA聚合酶的识别、结合和转录起始活性(即，一种或多种转录因子的结合)的序列。这些序列可以是顺式作用的，或可以对反式作用因子有应答。根据调节的性质，启动子可以是组成型启动子或调节型启动子。调节型启动子可以是可诱导的或对环境有应答的(例如，对例如pH、厌氧条件、渗压剂、温度、光或细胞密度等诱因有应答)。许多这样的启动子序列是本领域已知的。参见，例如，美国专利号4,980,285；5,631,150；5,707,928；5,759,828；5,888,783；5,919,670以及Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Press(1989)。

在一些实施例中，编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列可操作地连接至第一启动子。在一些实施例中，编码工程化受体的核酸序列可操作地连接至第二启动子。在一些实施例中，编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列和编码工程化受体的核酸序列可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列和编码工程化受体的核酸序列可操作地连接至分开的启动子。

在一些实施例中，启动子是内源启动子。例如，可以使用本领域已知的任何方法(例如，CRISPR/Cas9方法)，将编码鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体的核酸敲入内源启动子下游的经修饰的免疫细胞的基因组中。在一些实施例中，内源启动子是丰度蛋白如β-肌动蛋白的启动子。在一些实施例中，内源启动子是诱导型启动子，例如可由经修饰的免疫细胞的内源激活信号诱导。在一些实施例中，其中经修饰的免疫细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子(例如，IL-2启动子、NFAT启动子或NFκB启动子)。在一些实施例中，启动子是异源启动子。

已经探索了各种启动子以在哺乳动物细胞中进行基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可用于本发明。启动子可大致分为组成型启动子或调节型启动子，例如诱导型启动子。在一些实施例中，编码鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体的异源核酸序列可操作地连接至组成型启动子。在一些实施例中，编码鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体的异源核酸序列可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施例中，组成型启动子可操作地连接至编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列，而诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，而诱导型启动子可操作地连接至编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列，而第二诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可由第一诱导条件诱导，而第二诱导型启动子可由第二诱导条件诱导。在一些实施例中，第一诱导条件与第二诱导条件相同。在一些实施例中，同时诱导第一诱导型启动子和第二诱导型启动子。在一些实施例中，依次诱导第一诱导型启动子和第二诱导型启动子，例如，在第二诱导型启动子之前诱导第一诱导型启动子，或在第二诱导型启动子之后诱导第一诱导型启动子。

组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成性地表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在大量研究中广泛比较了此类组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率。在一些实施例中，启动子是hEF1α启动子。

在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，例如物理条件、经修饰的免疫细胞的微环境或经修饰的免疫细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或其组合。在一些实施例中，诱导条件不诱导经修饰的免疫细胞和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(例如，电离辐射、光)、温度(例如，热)、氧化还原状态、肿瘤环境和经修饰的免疫细胞的激活状态。

在一些实施例中，启动子可由诱导物诱导。在一些实施例中，诱导物是小分子，例如化学化合物。在一些实施例中，小分子选自由多西环素、四环素、醇、金属或类固醇组成的组。已最广泛地探索了化学诱导的启动子。此类启动子包括其转录活性受存在或不存在小分子化学物质(例如，多西环素、四环素、醇、类固醇、金属和其他化合物)调节的启动子。具有反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)和四环素应答元件启动子(TRE)的多西环素诱导型系统是目前最成熟的系统。WO9429442描述了四环素应答启动子对真核细胞中基因表达的严格控制。WO 9601313披露了四环素调节的转录调节剂。另外地，例如在TetSystems.com的网站上描述了Tet技术(例如，Tet-on系统)。任何已知的化学调节的启动子可用于驱动本申请的治疗性蛋白的表达。

在一些实施例中，诱导物是多肽，例如生长因子、激素或细胞表面受体的配体，例如特异性结合肿瘤抗原的多肽。在一些实施例中，多肽由经修饰的免疫细胞表达。在一些实施例中，多肽由异源核酸中的核酸编码。许多多肽诱导物也是本领域已知的，并且它们可适用于本发明。例如，基于蜕皮激素受体的基因开关、基于孕酮受体的基因开关和基于雌激素受体的基因开关属于使用类固醇受体衍生的反式激活因子的基因开关(WO 9637609和WO9738117等)。

在一些实施例中，诱导物包含小分子组分和一种或多种多肽两者。例如，依赖于多肽二聚化的诱导型启动子是本领域已知的，并且可以适用于本发明。1993年开发的第一个小分子CID系统使用FK1012(药物FK506的衍生物)以诱导FKBP的同源二聚化。通过使用类似的策略，Wu等人通过使用Rapalog/FKPB-FRB*和Gibberelline/GID1-GAI二聚化依赖性基因开关成功地使CAR-T细胞可通过启动开关(ON-switch)方式滴定(C.-Y.Wu等人，Science350，aab4077(2015))。其他二聚化依赖性开关系统包括香豆霉素/GyrB-GyrB(Nature 383(6596):178-81)和HaXS/Snap-tag-HaloTag(Chemistry and Biology 20(4):549-57)。

在一些实施例中，启动子是光诱导型启动子，并且诱导条件是光。用于调节哺乳动物细胞中的基因表达的光诱导型启动子也是本领域熟知的(参见，例如Science 332,1565-1568(2011)；Nat.Methods 9,266-269(2012)；Nature 500:472-476(2013)；NatureNeuroscience 18:1202-1212(2015))。基于此类基因调节系统对(1)DNA结合或(2)转录激活结构域募集到DNA结合蛋白的调节，它们可大致分为两类。例如，在哺乳动物细胞中开发并测试了基于视黑蛋白的合成哺乳动物蓝光控制转录系统，该系统应答于蓝光(480nm)而触发细胞内钙增加，从而导致钙调磷酸酶介导的NFAT动员。最近，Motta-Mena等人描述了从天然存在的EL222转录因子开发的新的诱导型基因表达系统，该系统在人细胞系和斑马鱼胚胎中赋予对转录起始的高水平且蓝光敏感性控制(Nat.Chem.Biol.10(3):196-202(2014))。另外地，利用红光诱导的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的光感受器光敏色素B(PhyB)和光敏色素相互作用因子6(PIF6)的相互作用进行红光触发的基因表达调节。此外，还开发了紫外线B(UVB)诱导型基因表达系统并证明其在哺乳动物细胞中的靶基因转录中是有效的(Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies，第25章，第四版，CRC Press，2015年1月20日)。本文所述的任何光诱导型启动子可用于驱动本发明的治疗性蛋白的表达。

在一些实施例中，启动子是由光诱导型分子和光的组合诱导的光诱导型启动子。例如，化学诱导物上的可光切割的光笼化基团(photocaged group)保持诱导物无活性，除非通过辐射或其他方式去除该光笼化基团。此类光诱导型分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经开发了笼化蜕皮激素、与lac操纵子一起使用的笼化IPTG、用于核酶介导的基因表达的笼化丰加霉素、与Tet-on系统一起使用的笼化多西环素以及用于光介导的FKBP/FRB二聚化的笼化Rapalog(参见，例如Curr Opin Chem Biol.16(3-4):292-299(2012))。

在一些实施例中，启动子是辐射诱导型启动子，并且诱导条件是辐射，例如电离辐射。辐射诱导型启动子也是本领域已知的，用以控制转基因表达。辐射细胞后发生基因表达的改变。例如，一组称为“立即早期基因(immediate early gene)”的基因可在电离辐射后迅速反应。示例性立即早期基因包括但不限于Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其启动子区包含辐射应答序列。共有序列CC(A/T)

在一些实施例中，启动子是热诱导型启动子，并且诱导条件是热。本领域还广泛研究了驱动转基因表达的热诱导型启动子。包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等在内的热休克或应激蛋白(HSP)在热或其他物理和化学应激下在保护细胞方面起着重要作用。已经在临床前研究中尝试了几种热诱导型启动子，包括热休克蛋白(HSP)启动子以及生长停滞和DNA损伤(GADD)153启动子。1985年首次描述的人hsp70B基因的启动子似乎是最高效的热诱导型启动子之一。Huang等人报道，在引入hsp70B-EGFP、hsp70B-TNFα和hsp70B-IL12编码序列后，肿瘤细胞在热处理后表达极高的转基因表达，而在没有热处理的情况下，未检测到转基因的表达。在IL12转基因加热处理的小鼠组中，体内肿瘤生长显著延迟(CancerRes.60:3435(2000))。另一组科学家将HSV-tk自杀基因与hsp70B启动子相关联，并在携带小鼠乳腺癌的裸鼠中测试该系统。与未进行热处理的对照相比，向其肿瘤施用了hsp70B-HSVtk编码序列并进行了热处理的小鼠显示出肿瘤消退和显著的存活率(Hum.GeneTher.11:2453(2000))。本领域已知的另外的热诱导型启动子可以在例如Gene and CellTherapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日中找到。本文讨论的任何热诱导型启动子可用于驱动本发明的治疗性蛋白的表达。

在一些实施例中，启动子可由氧化还原状态诱导。可由氧化还原状态诱导的示例性启动子包括诱导型启动子和低氧诱导型启动子。例如，Post DE等人开发了低氧诱导型因子(HIF)应答启动子，其特异性且强烈地诱导HIF活性肿瘤细胞中的转基因表达(GeneTher.8:1801-1807(2001)；Cancer Res.67:6872-6881(2007))。

在一些实施例中，启动子可由经修饰的免疫细胞的生理状态(例如，内源激活信号)诱导。在一些实施例中，其中经修饰的免疫细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子，其可由经修饰的T细胞的内源激活信号诱导。在一些实施例中，经修饰的T细胞被诱导物(例如，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、离子霉素或植物血凝素)激活。在一些实施例中，通过经由工程化受体(例如，CAR、TCR或TAC)识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原来激活经修饰的T细胞。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是IL-2启动子。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是NFAT启动子。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是NFκB启动子。

本文所述的一个或多个异源核酸序列可存在于异源基因表达盒中，该异源基因表达盒包含一个或多个蛋白质编码序列和任选的一个或多个启动子。在一些实施例中，异源基因表达盒包含单个蛋白质编码序列。在一些实施例中，异源基因表达盒包含由单个启动子驱动的两个或更多个蛋白质编码序列(即，多顺反子)。在一些实施例中，异源基因表达盒还包含一个或多个调节序列(例如，5’UTR、3’UTR、增强子序列、IRES、转录终止序列)、重组位点、一个或多个选择标记(例如，抗生素抗性基因、报告基因等)、信号序列或其组合。

在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体的核酸中任一种的载体。在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的鞭毛蛋白多肽中任一种的第一核酸序列和编码本文所述的工程化受体中任一种的第二核酸序列的载体。在一些实施例中，编码鞭毛蛋白多肽的第一核酸序列经由编码可自切割的接头(例如，P2A、T2A、E2A或F2A肽)的第三核酸序列与编码工程化受体的第二核酸序列融合。在一些实施例中，提供了包含第一载体和第二载体的组合物，该第一载体包含编码本文所述的鞭毛蛋白多肽中任一种的第一核酸序列，该第二载体包含编码本文所述的工程化受体中任一种的第二核酸序列。

在一些实施例中，提供了包含编码CAR(例如，抗BCMA CAR)的第一核酸序列和编码全长鞭毛蛋白的第二核酸序列的载体，其中该第一核酸序列经由编码可自切割的接头(例如，P2A)的第三核酸序列与该第二核酸序列融合。在一些实施例中，提供了包含编码CAR(例如，抗BCMA CAR)的第一核酸序列和编码含有SEQ ID NO:24氨基酸序列的鞭毛蛋白多肽的第二核酸序列的载体，其中该第一核酸序列经由编码可自切割的接头(例如，P2A)的第三核酸序列与该第二核酸序列融合。在一些实施例中，提供了包含编码CAR(例如，抗BCMA CAR)的第一核酸序列和编码含有SEQ ID NO:32氨基酸序列的鞭毛蛋白多肽的第二核酸序列的载体，其中该第一核酸序列经由编码可自切割的接头(例如，P2A)的第三核酸序列与该第二核酸序列融合。

“载体”是包含分离的核酸并可用于将该分离的核酸递送到细胞内部的物质组合物(composition of matter)。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记。术语“载体”也应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。

在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。

已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒，并在体外或离体将其递送至经修饰的免疫细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活的慢病毒载体。例如，可以用本领域已知的方案包装自灭活的慢病毒载体。可以使用本领域已知的方法，将所得的慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(例如，人T细胞)。

在一些实施例中，载体是非病毒载体(例如，质粒)或游离型表达载体。

在一些实施例中，载体是表达载体。“表达载体”是可用于转化所选宿主并提供编码序列在该所选宿主中表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合载体。表达包括优选地将核酸分子转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。在真核细胞的情况下，它们通常包含确保转录起始的启动子以及任选的确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。此外，根据所使用的表达系统，可以将能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌到介质中的前导序列添加到所述核酸序列的编码序列中，并且这些前导序列是本领域熟知的。将一个或多个前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，并且优选地，能够将翻译蛋白或其一部分的分泌引导到周质空间或细胞外介质中的前导序列。任选地，核酸序列可以编码融合蛋白，该融合蛋白包括赋予所希望的特性(例如，表达的重组产物的稳定化或简化纯化)的N-末端鉴定肽。合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-BergcDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等人,Cancer Immunol Immunother(2001)50(3),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。

制备方法

本申请还提供了制备本文所述的经修饰的免疫细胞中任一种的方法。

在一些实施例中，提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括：将编码本文所述的鞭毛蛋白多肽中任一种的第一核酸序列引入前体免疫细胞中。在一些实施例中，前体免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞组成的组。在一些实施例中，前体免疫细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞是γδT细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞是肿瘤浸润性T细胞或DC激活的T细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞包含本文所述的工程化受体中的任一种。在一些实施例中，该方法进一步包括将编码本文所述的工程化受体中任一种的第二核酸引入前体免疫细胞中。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸位于同一载体上。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸在分开的载体上。在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物组成的组。在一些实施例中，载体是非病毒载体。在一些实施例中，载体是游离型表达载体。在一些实施例中，该方法进一步包括分离或富集包含第一核酸序列和/或第二核酸序列的免疫细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括与至少一种药学上可接受的载剂一起配制经修饰的免疫细胞。

在一些实施例中，提供了包含本文所述的核酸或载体中任一种的分离的宿主细胞。宿主细胞可用于鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体、编码鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体的核酸或载体的表达或克隆。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞(例如，哺乳动物细胞)。在一些实施例中，宿主细胞包含编码第一多肽的第一载体和编码第二多肽的第二载体。在一些实施例中，宿主细胞包含含有编码第一多肽和第二多肽的分离的核酸的单个载体。

可以使用本领域已知的多种方法制备前体免疫细胞。例如，原代免疫细胞(例如，T细胞)可获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域已知的多种技术(例如，FICOLL

在一些实施例中，例如通过PERCOLL

在一些实施例中，可以使用针对阴性选择的细胞特有的表面标记的抗体的组合通过阴性选择进一步富集T细胞群。例如，一种方法涉及通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4

将载体或核酸引入宿主细胞(例如，前体免疫细胞)的方法是本领域已知的。可以通过物理、化学或生物方法将载体或核酸转移到宿主细胞中。

用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。在一些实施例中，通过电穿孔将载体引入细胞中。

用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。

用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞在引入一个或多个异源核酸后离体繁殖。在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞培养以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞培养不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，进一步评估或筛选转导的或转染的前体免疫细胞以选择经修饰的免疫细胞。

报告基因可用于鉴定可能转染的细胞和评估调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受者生物体或组织中或者不由接受者生物体或组织表达的基因，该基因编码其表达由一些易于检测的性质(例如，酶活性)表现的多肽。在将DNA引入接受者细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人FEBSLetters 479:79-82(2000))。

证实前体免疫细胞中存在一个或多个异源核酸的其他方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(例如，ELISA和蛋白质印迹)来检测特定肽的存在或不存在。

III.治疗方法

本申请的一个方面涉及治疗个体的癌症的方法，该方法包括向该个体施用有效量的本文所述的经修饰的免疫细胞中的任一种。本申请考虑了经修饰的免疫细胞，其可以单独施用或与另一种疗法组合施用，并且在至少一些方面，与药学上可接受的载剂或赋形剂一起施用。在一些实施例中，在施用之前，可以将经修饰的免疫细胞与本领域熟知的合适的药物载剂和赋形剂组合。

在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物，其中该经修饰的免疫细胞包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽在表达后能够结合toll样受体。在一些实施例中，toll样受体选自由TLR4、TLR5、TLR11、TLR2、TLR3和TLR9组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽被分泌。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是膜结合的。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含工程化受体，例如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含编码工程化受体如CAR、工程化TCR或TAC受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。

在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物，其中该经修饰的免疫细胞包含编码含有鞭毛蛋白或其片段的分泌性鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽由鞭毛蛋白或其片段组成或基本上由其组成。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含编码工程化受体如CAR、工程化TCR或TAC受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。

在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物，其中该经修饰的免疫细胞包含编码含有鞭毛蛋白或其片段和锚定GPI的肽序列的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ IDNO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ IDNO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列位于鞭毛蛋白多肽的C-末端处。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含编码工程化受体如CAR、工程化TCR或TAC受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。

在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物，其中该经修饰的免疫细胞包含编码含有鞭毛蛋白或其片段和跨膜结构域的鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽能够结合toll样受体(例如，TLR5)。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的基序N和/或基序C。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的N-末端结构域和/或C-末端结构域。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含鞭毛蛋白的氨基酸1-172和/或氨基酸418-505，其中氨基酸序列编号基于SEQ ID NO:2。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-172和/或氨基酸407-494。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-172和/或氨基酸465-553。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽是全长鞭毛蛋白。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含含有鞭毛蛋白的基序N的N-末端结构域和含有该鞭毛蛋白的基序C的C-末端结构域，其中该N-末端结构域与该C-末端结构域经由肽接头彼此融合。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由CD8、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽还包含铰链结构域，例如衍生自CD8的铰链结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自选自下组的共刺激分子，该组由CD27、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合组成。在一些实施例中，将药物组合物全身或局部施用于个体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含编码工程化受体如CAR、工程化TCR或TAC受体的第二异源核酸序列。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或分开的载体上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。

在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的癌症(例如，骨髓瘤或浆细胞瘤)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的包含经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物，其中该经修饰的免疫细胞包含编码分泌性鞭毛蛋白多肽的第一异源核酸序列和编码靶向BCMA的嵌合抗原受体的第二异源核酸序列，其中该鞭毛蛋白多肽包含与选自由SEQ ID NO:1、12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含选自由SEQ ID NO:1、12、14-16、20、22-24和28-32组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施例中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施例中，靶向BCMA的CAR包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体上，例如慢病毒载体。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接至同一启动子或分开的启动子。

在一些实施例中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导外周T细胞的重新分布；(4)在肿瘤中诱导免疫应答；(5)减小肿瘤尺寸；(6)缓解患有癌症的个体的一种或多种症状；(7)抑制肿瘤转移；(8)延长存活；(9)延长至癌症进展时间；(10)预防、抑制或降低癌症复发的可能性；(11)改善个体的生活质量；(12)促进肿瘤中的T细胞浸润以及(13)降低先存肿瘤转移(例如，转移至淋巴结)的发生率或负担。在一些实施例中，该方法实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高中任一个的肿瘤细胞死亡率。在一些实施例中，该方法减小至少约10％(包括例如，至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个)的肿瘤尺寸。在一些实施例中，该方法抑制至少约10％(包括例如，至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个)的转移。在一些实施例中，该方法将个体的存活延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多个月中的任一个。在一些实施例中，该方法将至癌症进展时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多个月中的任一个。

本文所述的方法适用于治疗多种癌症，包括实体癌和液体癌两者。这些方法适用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。本文所述的方法可以在辅助治疗或新辅助治疗中用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法(例如，化学疗法、手术、激素疗法、辐射、基因疗法、免疫疗法(例如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等)的组合疗法(即，该方法可在基本疗法/针对性疗法之前进行)。在一些实施例中，该方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施例中，癌症对于先前疗法是难治的。在一些实施例中，该方法用于治疗先前未被治疗的个体。

在本文所述的方法中施用的经修饰的免疫细胞的有效量将取决于许多因素，例如所治疗的癌症的特定类型和阶段、施用途径、鞭毛蛋白多肽和/或工程化受体的活性等。适当的剂量方案可由医师基于临床因素确定，这些临床因素包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。在一些实施例中，药物组合物的该有效量低于诱导毒理学效应(即，高于临床上可接受的毒性水平的效应)的水平，或在将药物组合物施用于个体时处于可以控制或耐受潜在副作用的水平。在一些实施例中，药物组合物的有效量包含约10

在一些实施例中，将药物组合物施用一次(例如，推注)。在一些实施例中，将药物组合物施用多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一个)。如果是多次施用，则它们可以通过相同或不同的途径进行，并且可以在相同部位或替代部位进行。药物组合物可以以合适的频率施用，例如从每天到每年一次。通过监测患者的疾病体征并相应调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。

在一些实施例中，待治疗的个体是哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于人、猴、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猫、兔、猪、绵羊、山羊、马、牛等。在一些实施例中，个体是人。

药物组合物

本申请还提供了药物组合物，其包含本文所述的经修饰的免疫细胞中的任一种和任选的药学上可接受的载剂。

本申请人的药物组合物可以包含任何数量的经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物包含单拷贝的经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物包含至少约1、10、100、1000、10

如本文所用，术语“载剂”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载剂通常是pH缓冲水溶液。合适的药物载剂的实例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。

包含此类载剂的药物组合物可通过熟知的常规方法配制。溶剂或稀释剂优选是等渗的、低渗的或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度。代表性实例包括无菌水，生理盐水(例如，氯化钠)，林格氏溶液，葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液，汉克氏溶液(Hank's solution)和其他生理平衡盐水溶液(参见，例如最新版的Remington:The Science and Practice ofPharmacy，A.Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins)。

本文所述的药物组合物可以经由任何合适的途径施用。在一些实施例中，将药物组合物肠胃外、经皮(进入真皮)、腔内、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、鞘内或静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物皮下(在皮肤下)施用。在一些实施例中，将药物组合物静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物经由输注或注射施用于个体。在一些实施例中，将药物组合物直接施用至靶部位，例如通过基因枪递送至内部或外部靶部位或者通过导管施用至动脉中的部位。在一些实施例中，将药物组合物局部(例如，瘤内)施用。施用可以使用常规的注射器和针头或本领域可获得的能够促进或改善一种或多种活性剂在受试者中的递送的任何化合物或装置。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本披露的药物组合物可以包含蛋白质载剂，像例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人来源的。本领域可获得呈冷冻、液体形式或冻干形式的各种病毒配制品(例如，WO 98/02522、WO 01/66137、WO 03/053463、WO 2007/056847和WO 2008/114021等)。固体(例如，干粉固体或冻干固体)组合物可通过涉及真空干燥和冷冻干燥的方法获得(参见，例如WO 2014/053571)。设想本披露的药物组合物除本文所述的经修饰的免疫细胞外还可包含其他生物活性剂，这取决于药物组合物的预期用途。

在一些实施例中，药物组合物被适当地缓冲以供人使用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如，PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或能够维持生理或弱碱性pH(例如，约pH 7至约pH 9)的Tris缓冲液。在一些实施例中，还可以通过添加合适的张力改性剂如甘油使药物组合物与血液等渗。

在一些实施例中，药物组合物包含在单次使用的小瓶中，例如单次使用的密封小瓶。在一些实施例中，药物组合物包含在多次使用的小瓶中。在一些实施例中，药物组合物以散装包含在容器中。

在一些实施例中，药物组合物必须满足用于向个体施用的某些标准。例如，美国食品与药品管理局已经发布了为基于细胞的免疫治疗产品设定标准的监管指南，包括21CFR610和21CFR 610.13。本领域已知评估药物组合物的外观、特性、纯度、安全性和/或效力的方法。在一些实施例中，药物组合物基本上不含能够产生变应原作用的外来蛋白质，例如细胞培养中使用的除经修饰的免疫细胞之外的动物来源的蛋白质。在一些实施例中，“基本上不含”小于药物组合物的总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一个。在一些实施例中，药物组合物在GMP级工作坊(GMP-level workshop)中制备。在一些实施例中，对于肠胃外施用，药物组合物包含小于约5EU/kg体重/小时的内毒素。在一些实施例中，对于静脉内施用，药物组合物中至少约70％的经修饰的免疫细胞是活的。在一些实施例中，当使用如美国药典(USP)中所述的14天直接接种测试方法评估时，药物组合物具有“无生长”结果。在一些实施例中，在施用药物组合物之前，包括经修饰的免疫细胞和药学上可接受的赋形剂两者的样品应在最终收获前约48-72小时(或与培养物的最后再补料(re-feeding)同时)取出用于无菌测试。在一些实施例中，药物组合物不含支原体污染。在一些实施例中，药物组合物不含可检测的微生物剂。在一些实施例中，药物组合物不含传染病病原，例如HIV I型、HIV II型、HBV、HCV、人T淋巴细胞病毒I型和人T淋巴细胞病毒II型。

IV.试剂盒和制品

还提供了包含本文所述的经修饰的免疫细胞中任一种或组合物(例如，药物组合物)的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了含有本文所述的药物组合物中任一种的试剂盒，并且优选提供了其使用说明书。在一些实施例中，除了经修饰的免疫细胞之外，试剂盒还包含第二癌症疗法，例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。一个或多个试剂盒可以针对个体的特定癌症进行定制，并且包含针对个体的相应的第二癌症疗法。

试剂盒可以包含一种或多种另外的组分，例如容器、试剂、培养基、诱导物、细胞因子、缓冲液、抗体等，以允许经修饰的免疫细胞进行繁殖或诱导。试剂盒还可以包含用于将药物组合物局部施用(例如，瘤内注射)至肿瘤部位的装置。

本申请的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供另外的组分，例如缓冲液和解释信息。因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(例如，密封小瓶)、瓶、罐、软质包装等。试剂盒的一些组分可以以水性介质或以冻干形式包装。

制品可包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(例如，玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或障碍(例如，癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装插页将进一步包括用于将组合物施用于个体的说明书。标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)重构配制品。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外地，制品可进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

试剂盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其包装的数量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。

实例

以下实例仅是本发明的示例，因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实例和详细描述是作为说明而并不是作为限制而提供的。

实例1：具有生物活性的鞭毛蛋白片段的设计和筛选

设计二十四个基于鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的片段(图2A，SEQ ID NO:9至32；参见表2)，使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因测定进行筛选。通过逐步截短鞭毛蛋白的N-末端和C-末端区，同时保持基序C和N完整来设计这些片段。此外，当与嵌合抗原受体组合使用时，连接鞭毛蛋白的C-末端和N-末端区的高变区被短GAAG接头(SEQ ID NO:36)替换，以减小鞭毛蛋白有效负荷的大小。这些肽连同全长鞭毛蛋白和阴性对照(无基序C/无基序N鞭毛蛋白)由Genscript合成。

在NF-κB SEAP报告基因测定中对这些基于鞭毛蛋白的片段(本文中也称为FBF)进行筛选。简言之，将FBF与表达人TLR5(puno1-htlr5，Invivogen)和NF-κB SEAP报告基因(pnifty2-seap，Invivogen)的稳定工程化HEK293细胞在HEK-blue检测培养基(hb-det3，Invivogen)中以指定浓度在37℃和5％CO

总之，我们已经鉴定了长度为207个氨基酸的鞭毛蛋白片段(SEQ ID NO:24)，并且与全长鞭毛蛋白相比，其表现出类似的人TLR5激活活性。此类片段提供了具有减小的大小但完整的信号传导能力的有效负荷。尽管递送载体具有大小限制，本文所述的FBF能够经由单个载体将鞭毛蛋白片段与嵌合抗原受体组合递送至免疫细胞，如以下实例中所示。

实例2：装甲有具有生物活性的鞭毛蛋白片段-16a的嵌合抗原受体的设计

具有生物活性的FBF，即Flic-16a(SEQ ID NO:24)被设计为组成型分泌性FBF。在质粒中经由自切割P2A序列将编码Flic16a的序列与常规的抗BCMA CAR序列组合以提供用Flic-16a装甲的CAR构建体。还设计了用全长鞭毛蛋白装甲的CAR构建体和未装甲的抗BCMACAR构建体(图3A)。多种抗原结合结构域序列适用于构建本文披露的抗BCMACAR构建体。参见例如WO2017/025038，将其以全文并入本文。CAR构建体的序列如下所示。

SEQ ID NO:33BCMA CAR氨基酸序列

SEQ ID NO:34BCMA-CAR-Flic-16a FBF氨基酸序列

SEQ ID NO:35BCMA-CAR-全长鞭毛蛋白氨基酸序列

实例3：病毒转染和病毒粒子生产

将慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech#632164)通过用人延伸因子1α启动子(hEF1α)替换其内置(built-in)启动子进行修饰以提供PLVX-EF1A。通过EcoRI和BamHI消化将实例2的每种CAR构建体(即，用Flic 16a装甲的CAR、用全长鞭毛蛋白装甲的CAR和未装甲的CAR构建体)克隆到慢病毒载体中，从而去除嘌呤霉素抗性基因。如下所述将编码CAR构建体的所得慢病毒载体包装到病毒粒子中。

简言之，将包含pMDLg/pRRE(Addgene#12251)、pRSV-Rev(Addgene#12253)和pMD2.G(Addgene#12259)的慢病毒包装质粒混合物与编码CAR构建体的PLVX-EF1A载体以预优化的比率与聚乙烯亚胺(PEI)预混合，适当混合，并在室温下孵育5分钟。在温和混合下将转染混合物滴加到293-T细胞中。将转染的293-T细胞在37℃和5％CO

实例4：免疫细胞制备

在R10培养基中收集白细胞并将其与0.9％NaCl溶液以1:1(v/v)的比率混合。将3mL Lymphoprep培养基缓慢添加到含有3mL白细胞的15mL离心管中，以提供6mL稀释的淋巴细胞混合物。将淋巴细胞混合物在20℃下以800g离心30分钟而不制动。然后用200μL移液管收集淋巴细胞血沉棕黄层。使用0.9％NaCl或R10培养基将收获的级分稀释至少6倍，以降低溶液的密度。然后将收获的级分在20℃下以250g离心10分钟。完全抽吸出上清液，并将10mLR10培养基添加到细胞沉淀中。将混合物在20℃下以250g进一步离心10分钟。再次抽吸出上清液。将2mL R10培养基在37℃下预热，然后将其与100IU/mL IL-2一起添加到细胞沉淀中。随后将细胞沉淀轻轻重悬以提供PBMC样品。计数PBMC样品中的细胞数。使用Miltenyi PanT细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)从PBMC样品中纯化人T细胞，以提供α/βT细胞。

随后使用人T细胞激活/扩增试剂盒(Milteny#130-091-441)将α/βT细胞预激活48小时。每两个细胞使用一个负载的抗生物素MACSiBead粒子(即，1:2的珠-细胞比)。

通过向PBMC中添加5μM唑来膦酸盐和1000IU/mL IL-2来制备γ/δT细胞，并培养14天，定期更换补充有1000IU/mL IL-2的培养基。可替代地，从PBMC或脐带血(UCB)中分离γ/δT细胞，然后用抗γ/δTCR抗体和抗CD3抗体(OKT3)刺激，随后以1:2的比率与基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)共孵育至少10天。

实例5：T细胞转导

α/βT细胞的转导

收集预激活的α/βT细胞并重悬于含有300IU/mL IL-2的1640培养基中。将包含编码实例2的每种CAR构建体的载体的慢病毒粒子用相同的培养基稀释至感染复数(MOI)为5，并用于感染10

γ/δT细胞的转导

通过密度离心(lymphoprep)从白细胞去除术材料分离PBMC并冷冻保存。回收PBMC并在补充有IL-2(1000IU/ml)和5％人AB血清的细胞培养基AIM-V中用唑来膦酸(5μΜ)激活，并且保存在加湿室(37℃，5％CO

实例6：嵌合抗原受体表达的定量

在转导后第3天及之后(通常是第3、7和14天)，通过流式细胞术评估细胞中实例2的CAR的表达。从培养物中收集细胞的等分试样，洗涤，沉淀并重悬于50-100μl以1:100稀释于PBS+0.5％FBS中的稀释的抗体(eBioscience抗小鼠TCRβPE和抗CAR抗体)中。然后将细胞在4℃下孵育30分钟。根据制造商的说明，还向细胞中添加了活性染料eFluor780或SYTOXBlue。孵育后，将细胞在PBS中洗涤两次并重悬于100至200μl PBS中进行分析。通过流式细胞术定量每个样品的平均荧光。

对于抗BCMA sdAb染色，将细胞用Alexa Fluor 488标记的小鼠抗骆驼sdAb抗体(Genscript)染色。使用FlowJo(Tree Star，Inc.)分析所有流式细胞术实验的结果。

实例7：细胞毒性测定

表达全长鞭毛蛋白或FBF装甲的CAR的α/βT细胞的细胞毒性

在20小时共培养测定中测定表达用全长鞭毛蛋白或Flic-16a FBF装甲的CAR构建体的αβT细胞(图3A)以及表达未装甲的CAR构建体的对照αβT细胞的细胞毒性。简言之，通过离心收集效应细胞(即，αβT细胞)，然后用补充有2％热灭活的FBS(Invitrogen)的1640无酚红培养基(Invitrogen)稀释至所希望的浓度。靶细胞H929(人浆细胞瘤/骨髓瘤细胞系)表现出靶抗原BCMA的适当表达。将效应细胞与靶细胞以不同的效应子与靶标比率(E:T＝2:1、1:1、0.5:1和0.25:1)在96孔板中在37℃下共培养20小时。包括仅含测定缓冲液(1640无酚红培养基加2％hiFBS)、仅含靶细胞(T)、仅含效应细胞(E)和最大裂解靶细胞(1％tritonX-100溶液)的孔作为对照条件。每种条件一式三份进行，并且使用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。完成20小时共培养后，将测定板离心，并将上清液收集在新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃-25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读数器(Molecular Devices)在492nm和650nm处测量板的吸光度，并如前所述计算细胞毒性。

如图3B所示，在每个E:T比率下，表达全长鞭毛蛋白和Flic-16a FBF装甲的CAR的αβT细胞均表现出比未装甲的CAR-αβT细胞更高的针对靶H929细胞的功效。此外，在更高的E:T比率下，与全长鞭毛蛋白装甲的CAR-αβT细胞相比，Flic-16a-FBF装甲的CAR-αβT细胞表现出相似的功效。

表达全长鞭毛蛋白或FBF装甲的CAR的γ/δT细胞的细胞毒性

用慢病毒粒子转导γδT细胞，这些慢病毒粒子包含编码全长鞭毛蛋白或Flic-16aFBF装甲的CAR构建体或对照未装甲的CAR的载体。在转导后七天评估效应γδT细胞的细胞毒性。简言之，将转导的或未转导的γδT细胞与BCMA阳性靶细胞系H929一起孵育，并使用如上所述的LDH测定试剂盒(Roche)评估γδT细胞的细胞毒性作用。

如图3C所示，与CAR-αβT细胞不同，在所有测试的E:T比率下与全长鞭毛蛋白装甲的CAR-γδT细胞相比，FBF Flic-16a装甲的CAR-γδT细胞显示出相似的功效。在两种情况下，鞭毛蛋白装甲都能提供明显的益处，因为与未装甲的CAR-T对应物相比，在全长鞭毛蛋白或Flic-16a FBF装甲的CAR-αβT细胞或CAR-γδT细胞中观察到增加的细胞毒性作用。

实例8：细胞因子释放

将用慢病毒粒子(其包含编码全长鞭毛蛋白或Flic-16 FBF装甲的CAR构建体或对照未装甲的CAR构建体的载体)转导的αβ或γδT细胞与BCMA-阳性H929细胞以1:1的比率在37℃下共培养48小时。收集共培养物的上清液以使用以下试剂盒分析效应细胞的细胞因子释放：人IFNγ试剂盒(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)、人TNFα试剂盒(Cisbio，目录号62HTNFAPEH)和人IL2试剂盒(Cisbio，目录号62HIL02PEH)。简言之，将细胞上清液和标准品直接分配到测定板中，以使用

根据4参数逻辑(4PL)曲线生成ELISA标准曲线。与线性回归相比，标准曲线回归方法能够在更宽的浓度范围内准确测量未知样品的浓度。因此，4PL回归方法适合于分析生物系统，例如细胞因子释放。

与靶细胞共培养的表达全长鞭毛蛋白或FBF装甲的CAR的α/βT细胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2释放

如图4A-4C所示，当与靶细胞共培养时，全长鞭毛蛋白装甲的和Flic-16aFBF装甲的CAR-αβT细胞均显示出与未装甲的CAR-αβT细胞相比显著更高的IFN-γ、TNF-α和IL-2释放水平。此外，全长鞭毛蛋白装甲的CAR-αβT细胞分泌的细胞因子水平略高于Flic-16a FBF装甲的CAR-αβT细胞。总之，鞭毛蛋白装甲的CAR-αβT细胞显示出有效的细胞因子释放曲线，这与在实例7中观察到并描述的高抗肿瘤细胞毒性相关。

与靶细胞共培养的表达全长鞭毛蛋白或FBF装甲的CAR的γ/δT细胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2释放

鞭毛蛋白装甲的CAR-γδT细胞的细胞因子释放曲线类似于鞭毛蛋白装甲的CAR-αβT细胞的细胞因子释放曲线。如图4D-4F所示，当与靶细胞共培养时，全长鞭毛蛋白和Flic-16a FBF装甲的CAR-γδT细胞显示出与未装甲的CAR-γδT细胞相比显著更高的IFN-γ和TNF-α释放水平，尽管IL-2释放水平略低。此外，全长鞭毛蛋白装甲的CAR-γδT细胞分泌的细胞因子(除IL-2以外)水平略高于Flic-16a FBF装甲的CAR-γδT细胞。总之，鞭毛蛋白装甲的CAR-γδT细胞显示出有效的细胞因子释放曲线，这与在实例7中观察到并描述的高抗肿瘤细胞毒性相关。

序列表

<110> 南京传奇生物科技有限公司

<120> 表达鞭毛蛋白多肽的经修饰的免疫细胞

<130> 76142-20018.41

<140> 尚未指定

<141> 一并同时提交

<150> PCT/CN2019/070296

<151> 2019-01-03

<160> 39

<170> Windows用FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 494

<212> PRT

<213> 鼠伤寒沙门氏菌

<400> 1

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<212> PRT

<213> 慕尼黑沙门氏菌

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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<213> 鼠伤寒沙门氏菌

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<213> 鼠伤寒沙门氏菌

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<220>

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<220>

<223> 合成构建体

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915 920 925

Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala

930 935 940

Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe

945 950 955 960

Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser

965 970 975

Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn

980 985 990

Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala

995 1000 1005

Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg

1010 1015 1020

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 36

Gly Ala Ala Gly

1

<210> 37

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(2)

<223> 能以至多10的任何整数形式的重复序列存在

<400> 37

Gly Ser

1

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(5)

<223> 能以至多10的任何整数形式的重复序列存在

<400> 38

Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 39

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(4)

<223> 能以至多10的任何整数形式的重复序列存在

<400> 39

Gly Gly Gly Ser

1