可提高ACE抑制活性的牡蛎活性肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种牡蛎活性肽的制备方法，尤其是一种可提高ACE抑制活性的牡蛎活性肽的制备方法。

背景技术

牡蛎营养丰富，含有包括具有ACE（血管紧张素转换酶）抑制活性等多种活性成分。目前，对牡蛎多采用酶解的方法以得到牡蛎活性肽，但所得到的活性肽是通过酶将蛋白质的肽键在不同地方断裂而得到的源自蛋白质一级结构的多肽序列，本质上是原料蛋白质的氨基酸序列的部分肽片段，其活性受到制约。

Plastein反应又称为合成类蛋白反应或塑蛋白反应，是在反应底物（蛋白水解物）中加入氨基酸或/和蛋白酶，通过蛋白酶催化高浓度的蛋白水解物生成沉淀、触变胶体或者具有触变性粘稠胶状物的过程。 Plastein反应可以使肽通过缩合作用、转肽作用等而改变肽的一级结构，得到不同于原料蛋白质的氨基酸序列的多肽，即Plastein反应可以用来修饰生物活性肽，改变多肽的氨基酸序列从而使其生物活性发生改变。然而，在不同的反应底物中加入不同的氨基酸及蛋白酶，以及反应温度、时间等条件不同，所得产物的活性相差很大。迄今为止，并没有关于通过外源添加氨基酸和蛋白酶的Plastein反应，制备提高ACE抑制活性的牡蛎活性肽的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可提高ACE抑制活性的牡蛎活性肽的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种可提高ACE抑制活性的牡蛎活性肽的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 将牡蛎去壳取肉后用水浸泡至电导率降至小于180PPM，匀浆、煮沸，冷却后得到牡蛎匀浆液；

b. 向牡蛎匀浆液中加入中性蛋白酶，加酶量为牡蛎匀浆液质量的2%，在pH7.0、温度50℃条件下酶解3小时，得到酶解液；

c. 将酶解液用分子量3kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，获得小分子肽液体；

d. 将小分子肽液体进行Plastein反应，所述Plastein反应的条件为：反应底物为质量浓度为45%的小分子肽液体，添加与反应底物质量比为0.5mmol/g的脯氨酸，加入为反应底物质量3%的木瓜蛋白酶，反应温度60℃,反应时间2 h后升温至100℃并保持10分钟；

e. 浓缩、干燥得粉末。

本发明首先采用中性蛋白酶对牡蛎匀浆进行酶解，获得分子量小于3kDa的牡蛎小分子肽，再以牡蛎小分子肽为反应底物，加入定量的脯氨酸及木瓜蛋白酶，在温度60℃下进行Plastein反应2 h，经过灭酶、干燥等处理，获得ACE抑制活性达到80%以上的牡蛎活性肽，具有显著降血压的作用且对人体无副作用。

附图说明

图1是本发明实施例与添加其它氨基酸对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响示意图。

图2是本发明实施例与不同浓度反应底物对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响示意图。

图3是本发明实施例与不同加酶量对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响示意图。

图4是本发明实施例与不同反应温度对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响示意图。

图5是本发明实施例与不同反应时间对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响示意图。

图6是本发明实施例与牡蛎粉、牡蛎肽模拟体外消化时间对ACE抑制率的影响示意图。

具体实施方式

本发明的一种可提高ACE抑制活性的牡蛎活性肽的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 将牡蛎去壳取肉后用水浸泡脱盐，直至电导率降至小于180PPM，匀浆、煮沸，冷却后得到牡蛎匀浆液；

b. 向牡蛎匀浆液中加入酶活力单位为30万的中性蛋白酶，加酶量为牡蛎匀浆液质量的2%，在pH7.0、温度50℃条件下酶解3小时，得到酶解液；

c. 将酶解液用分子量3kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，获得小分子肽液体；

d. 将小分子肽液体进行Plastein反应，所述Plastein反应的条件为：反应底物为质量浓度为45%的小分子肽液体，添加与反应底物质量比为0.5mmol/g的脯氨酸，加入为反应底物质量3%酶活力单位30万的木瓜蛋白酶，反应温度60℃,反应时间2 h后升温至100℃并保持10分钟；

e. 浓缩、冷冻干燥得冻干粉（乳白色粉末）。

实验：

实验1. 本发明实施例与添加其它氨基酸对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响

对比例是以精氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸替代实施例1中脯氨酸并按照实施例1的方法制备冻干粉。

本发明实施例及对比例f步骤后测定不同产物的游离氨基酸减少量，游离氨基酸减少，表明结合到牡蛎活性肽上的氨基酸越多；本发明实施例及对比例e步骤后得到冻干粉按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率，ACE抑制率越高代表降血压效果越好。

结果如图1所示（图1中横坐标中的脯氨酸即本发明实施例）。结果表明：添加不同的氨基酸对修饰产物的游离氨基酸减少量和ACE抑制率有不同程度的影响。添加缬氨酸以后，游离氨基酸减少量最多52mg/ml，其次是异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸，游离氨基酸减少量分别为45 mg/ml、40 mg/ml、48 mg/ml，但脯氨酸（本发明实施例）ACE抑制率最高，可达80.31 %。

实验2.本发明实施例与不同浓度反应底物对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响

对比例是按照本发明实施例1的方法制备冻干粉，但d步骤反应底物浓度分别为20%、30 %、50 %、55 %。

f步骤后测定不同产物的游离氨基酸减少量；对比例e步骤后得到冻干粉按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率。

本发明实施例与不同浓度反应底物对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响结果如图2所示（图2中横坐标浓度45%为本发明实施例，数据采用实验1），结果表明本发明实施例ACE抑制率最高。

实验3：本发明实施例与不同加酶量对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响

对比例是按照本发明实施例1的方法制备冻干粉，但d步骤加酶量分别为1.0 %、2.0%、4.0 %、5.0 %。

f步骤后测定不同产物的游离氨基酸减少量；e步骤后得到冻干粉按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率。

本发明实施例与不同加酶量对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响结果如图3所示（图3中横坐标加酶量3%为本发明实施例，数据采用实验1），结果表明本发明实施例ACE抑制率最高。

实验4：本发明实施例与不同反应温度对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响

对比例是按照本发明实施例1的方法制备冻干粉，但d步骤反应温度分别为30℃、40℃、50℃、70℃。

f步骤后测定不同产物的游离氨基酸减少量； e步骤后得到冻干粉按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率。

本发明实施例与不同反应温度对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响结果如图4所示（图4中横坐标反应温度60℃为本发明实施例，数据采用实验1），结果表明本发明实施例ACE抑制率最高。

实验5：本发明实施例与不同反应时间对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响

对比例是按照本发明实施例1的方法制备冻干粉，但d步骤反应时间分别为1h、3h、4h、5h。

f步骤后测定不同产物的游离氨基酸减少量； e步骤后得到冻干粉按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率。

本发明实施例与不同反应时间对游离氨基酸减少量及ACE抑制率的影响结果如图5所示（图5中横坐标反应时间2h为本发明实施例，数据采用实验1），结果表明本发明实施例ACE抑制率最高。

实验6：本发明实施例与牡蛎小分子肽氨基酸组成

将本发明实施例c步骤所获得的小分子肽液体冻干，得到的冻干粉为对比例。将本发明实施例与对比例分别经过酸碱水解和不经过酸碱水解，加水定容后，直接用氨基酸自动分析仪上样分析氨基酸的变化情况，结果如表1。分析方法参见GB/T5009124-2003。

表1对比例和本发明实施例游离氨基酸和氨基酸组成含量变化

从表1结果可以看出，本发明实施例中游离氨基酸组分与对比例相比，除Pro外都有所减少；氨基酸组成中除Cys和Met没有增加，其他氨基酸含量都有增加。因为反应体系中多添加了Pro，游离氨基酸中Pro含量有少量的增加，但是氨基酸组成中Pro含量的增加大于游离氨基酸中Pro含量的增加，说明添加的Pro结合到肽链中，形成了新的肽。

实验7：牡蛎粉、牡蛎肽及本发明实施例模拟体外消化时间对ACE抑制率的影响

将本发明实施例牡蛎匀浆冻干粉（牡蛎粉）、实验6所得到的牡蛎小分子肽冻干粉（牡蛎肽）及本发明实施例的冻干粉（Plastein反应）均按照 1 mg/mL 溶解在超纯水中，用0.5 mol/L 的 HCl 调至 pH 2.0，分别作为底物。

按m（胃蛋白酶）/m（底物）1：40的比例在体外模拟胃液中加入底物，150转37℃摇床中消化4小时，分别在模拟胃消化1、2、3、4小时取样，用NaOH溶液终止反应。取出各阶段终止反应后溶液，冻干后按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率。

胃消化阶段剩余液体按m（胰酶）/m（底物）1：25的比例加入体外模拟肠液。150转37℃摇床中消化5小时，分别在模拟肠消化1、2、3、4、5小时取样，用10% TFA溶液终止反应。

取出各阶段终止反应后溶液，冻干后按照现有方法测定不同产物的ACE抑制率。

结果如图6所示。本发明实施例（Plastein反应修饰产物）和牡蛎肽的ACE抑制活性均高于牡蛎粉，尤其是本发明实施例不仅能提高ACE抑制活性，而且与胃肠消化酶作用后活性进一步得到增强。