一种烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一种烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因及其应用。

背景技术

烟草作为一种重要的经济作物，其品质和安全性一直是研究人员关注的重点。淀粉是烟草生长过程中积累的重要碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中。成熟的鲜烟叶中淀粉含量高达40％左右，经调制后，大部分淀粉降解为还原糖，但仍有部分留在烟叶中。烟叶中淀粉含量的高低影响着烟叶的外观和内在品质以及卷烟的香吃味。一方面，以淀粉形态存在的糖类在烟支燃吸时会对烟气质量产生不良影响，影响烟丝的燃烧速度及其完全性，也影响阴然持火力；另一方面，淀粉在燃烧时会产生焦糊气味，破坏烟草燃吸时所形成的香味，影响卷烟香气质及吸味口感，同时使安全性下降。近年来，我国烤烟水平不断提高，但与进口烟相比在其内在的化学组成协调性等方面还存在着较大差异。目前，我国烤烟中淀粉含量(质量分数)约为4％～6％，而国外优质烤烟淀粉含量仅为1％～2％。

因此，烟草中影响淀粉含量的基因功能的研究将为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供理论支持，对提高我国烟草产品品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因及其应用，以解决现烤烟中淀粉含量过高的问题，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定基础。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示，含有1845个碱基，命名为NtWAXY。

进一步的，烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由614个氨基酸残基组成。

进一步的，烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组，并反转录为cDNA备用；

(2)设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtWAXY-F：5’-GATTGGCACACTGCTCTCC-3’，

NtWAXY-R：5’-TATGTGATTCTAATATCCCAGCC-3’。

进一步的，在步骤(1)中提取基因组时，以烟草品种红花大金元叶片为样品。

上述任一项的烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因的应用，该基因表达的蛋白与植物叶片中淀粉含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中淀粉含量明显降低。

进一步的，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草淀粉颗粒结合型淀粉合成酶基因的表达量，来调节控制烟叶中淀粉含量情况。

进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有烟草淀粉颗粒结合型淀粉合成酶基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体，转化烟草，筛选获得淀粉含量变化的烟草新品种。

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，干扰NtWAXY基因的表达使其沉默，NtWAXY基因沉默植株中淀粉含量显著下降，进而获得淀粉含量下降的植物新品种。

本发明的有益效果是：

本申请中，通过对特定烟草淀粉颗粒结合型淀粉合成酶NtWAXY的初步研究，发现其与烟草淀粉含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中淀粉含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为与对照植株相比，NtWAXY基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的淀粉含量比较。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

生物材料：

本氏烟草，一种现常用烟草材料，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理。

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2(一种常用载体)带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；10g氯化钠(NaCl)；5g酵母抽提物(yeast extract)，高温高压灭菌。

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏(beef extract)；5g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；5g蔗糖(sucrose)；1g酵母抽提物(yeast extract)；2mL 1M硫酸镁(MgSO4)，高温高压灭菌。

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH

200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草NtWAXY基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

(1)烟草NtWAXY基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtWAXY基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtWAXY-F：5’-GATTGGCACACTGCTCTCC-3’，

NtWAXY-R：5’-TATGTGATTCTAATATCCCAGCC-3’。

以烟草红花大金元叶片(先提取基因组，再反转录为cDNA)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtWAXY基因。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸2min，34个循环后，72℃彻底延伸5min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

(2)构建重组TRV2-NtWAXY载体

将步骤(1)中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接。

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜。

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtWAXY。

需要说明的是，烟草NtWAXY基因，包括1845个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

烟草淀粉颗粒结合型淀粉合成酶蛋白NtWAXY，包括614个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，进一步将所构建的重组TRV2-NtWAXY载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

(1)转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，同时制备了TRV2-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP(载体对照)及TRV2-NtWAXY的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

(2)制备转染用菌液

将步骤(1)中筛选所得阳性农杆菌克隆在5mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)中，28℃、250rpm条件下培养过夜。

取50uL过夜培养物接种至50mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan)中，培养至OD

最后室温放置3h左右后，作为转染用菌液。

(3)瞬时转化

以3-4w(周)苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1mL规格注射器，将步骤(2)中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtWAXY基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2-NtWAXY的侵染植株中，NtWAXY的表达量显著降低，qRT-PCR引物如下：

NtWAXY-F：5’-TGAATTGGATAACGTCCTTCG-3’，

NtWAXY-R：5’-TCGAGCTGTTCAATCTCCTGT-3’。

进一步地，对实验组(TRV2-NtWAXY浸染植株)和对照组(TRV2-GFP浸染植株)中的叶片淀粉含量情况进行了检测(检测方法参照：格锐思生物的支链-直链-总淀粉含量试剂盒(分光光度法))，结果如图2所示。

从图2结果可以看出，实验组中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量与对照组相比均显著下降，总淀粉含量降低了66.0％。这进一步表明，通过沉默NtWAXY基因，可对烟草叶片中植物淀粉的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

以上显示和描述了本发明的基本原理和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草颗粒结合型淀粉合成酶基因及其应用

<130> WPC211439

<141> 2021-05-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列(NtWAXY)

<400> 1

atggcaagca tcacagcttc acactttgtg tcaagaagct caaatgtctg cagtggagca 60

gcctctgtag acaccagagc aaacttgtca cagatagggc tgaggaacca tgctctgact 120

cacaatgggt tgagggctgt taacaaggtt gatatgctgc aatcaagaac taatactaag 180

gcaacagcca agagatccag caaacaggga tccggaactg agatggagag gccatcaggt 240

acaattgttt gtggaaaggg gatgaacgtg atccttgttg gaactgaggt cggtccttgg 300

agcaaaactg gcgggctagg tgatgttctt ggtggactac caccagcctt ggcagcccgt 360

ggacatcgcg taatgacagt atctccccgt tatgaccaat acaaagatgc ttgggatact 420

agcgttgtcg ttgagatcaa agttggagac aaaattgaaa ttgttcgttt ttttcactgc 480

tataaacgtg gggttgatcg tgtttttgtc gaccacccaa tgttcttgga gaaagtttgg 540

ggcaaaactg cttcaaaaat ctatggccct aaagctggac aagattattt ggacaatgaa 600

cttaggttta gcttgttgtg tcaagcagct ctagaagcac ctagagtttt gaatttgaac 660

tgcagcgagt acttctcagg accatatgga gaggatgttg tcttcattgc caacgattgg 720

cacactgctc tccttccctg ctacctaaag tcgatgtacc aatcaagagg aatctatgtg 780

aatgccaagg tcgctttctg catccataac attgcctacc aaggccgatt ttctttttca 840

gacttctctc ttctcaatct gcctgatgaa tacaagagtt cttttgattt cattgatgga 900

tatgaaaagc ctgttaaggg taggaaaatc aactggatga aggctgggat attggaatca 960

catagggtgg ttactgtgag cccatactat gcccaagaac ttatttccgg tgttgacaag 1020

ggtgtcgaac tggataacgt ccttcgtaag acttgcataa ctgggattgt gaatggcatg 1080

gatatccaag agtggaaccc agcaactgac aaatacaccg atgtcaaata tgatataacc 1140

actgtcatgg acgcaaaacc tttactgaag gaggctcttc aagcagcagt tggcttacct 1200

gttgacagga agatcccttt gattggattc attggtagac ttgaagagca gaaaggttct 1260

gacattcttg ttgctgcaat tcacaagttc atcgggttgg atgttcaaat aatagtcctt 1320

ggaactggca aaaaggagtt cgaacaggag attgaacagc tcgaagtgtt gtatcctaac 1380

aaagctaaag gagtggcaaa attcaatgtc cctttggctc acatgatcac agctggtgct 1440

gattttatgt tggttccaag cagatttgaa ccttgtggtc tcattcaatt acatgctatg 1500

cgctatggaa cagtgccaat ctgtgcctca actggtggac ttgttgacac tgtgaaagaa 1560

ggctatactg gattccatat gggagccttc aacgttgaat gcgatgtcgt tgacccagct 1620

gatgtgctta agatagtaac aacagttgct agagctcttg aagtttatgg caccctcgcg 1680

tttgctgaga tgataaaaaa ctgcatgtca caggagctct cctggaagga acctgccaag 1740

aaatgggaga cactgctatt gagcttagga gctgctggca gtgaagccgg tgttgaaggg 1800

gatgaaatcg ccccacttgc caaggaaaat gtggccgctc cctaa 1845

<210> 2

<211> 614

<212> PRT

<213> 人工序列(NtWAXY)

<400> 2

Met Ala Ser Ile Thr Ala Ser His Phe Val Ser Arg Ser Ser Asn Val

1 5 10 15

Cys Ser Gly Ala Ala Ser Val Asp Thr Arg Ala Asn Leu Ser Gln Ile

20 25 30

Gly Leu Arg Asn His Ala Leu Thr His Asn Gly Leu Arg Ala Val Asn

35 40 45

Lys Val Asp Met Leu Gln Ser Arg Thr Asn Thr Lys Ala Thr Ala Lys

50 55 60

Arg Ser Ser Lys Gln Gly Ser Gly Thr Glu Met Glu Arg Pro Ser Gly

65 70 75 80

Thr Ile Val Cys Gly Lys Gly Met Asn Val Ile Leu Val Gly Thr Glu

85 90 95

Val Gly Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met Thr Val Ser

115 120 125

Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Val

130 135 140

Glu Ile Lys Val Gly Asp Lys Ile Glu Ile Val Arg Phe Phe His Cys

145 150 155 160

Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val Asp His Pro Met Phe Leu

165 170 175

Glu Lys Val Trp Gly Lys Thr Ala Ser Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Ala

180 185 190

Gly Gln Asp Tyr Leu Asp Asn Glu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln

195 200 205

Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Val Leu Asn Leu Asn Cys Ser Glu Tyr

210 215 220

Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp

225 230 235 240

His Thr Ala Leu Leu Pro Cys Tyr Leu Lys Ser Met Tyr Gln Ser Arg

245 250 255

Gly Ile Tyr Val Asn Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ala

260 265 270

Tyr Gln Gly Arg Phe Ser Phe Ser Asp Phe Ser Leu Leu Asn Leu Pro

275 280 285

Asp Glu Tyr Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Glu Lys Pro

290 295 300

Val Lys Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ser

305 310 315 320

His Arg Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Gln Glu Leu Ile Ser

325 330 335

Gly Val Asp Lys Gly Val Glu Leu Asp Asn Val Leu Arg Lys Thr Cys

340 345 350

Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Ile Gln Glu Trp Asn Pro Ala

355 360 365

Thr Asp Lys Tyr Thr Asp Val Lys Tyr Asp Ile Thr Thr Val Met Asp

370 375 380

Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu Ala Leu Gln Ala Ala Val Gly Leu Pro

385 390 395 400

Val Asp Arg Lys Ile Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu

405 410 415

Gln Lys Gly Ser Asp Ile Leu Val Ala Ala Ile His Lys Phe Ile Gly

420 425 430

Leu Asp Val Gln Ile Ile Val Leu Gly Thr Gly Lys Lys Glu Phe Glu

435 440 445

Gln Glu Ile Glu Gln Leu Glu Val Leu Tyr Pro Asn Lys Ala Lys Gly

450 455 460

Val Ala Lys Phe Asn Val Pro Leu Ala His Met Ile Thr Ala Gly Ala

465 470 475 480

Asp Phe Met Leu Val Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln

485 490 495

Leu His Ala Met Arg Tyr Gly Thr Val Pro Ile Cys Ala Ser Thr Gly

500 505 510

Gly Leu Val Asp Thr Val Lys Glu Gly Tyr Thr Gly Phe His Met Gly

515 520 525

Ala Phe Asn Val Glu Cys Asp Val Val Asp Pro Ala Asp Val Leu Lys

530 535 540

Ile Val Thr Thr Val Ala Arg Ala Leu Glu Val Tyr Gly Thr Leu Ala

545 550 555 560

Phe Ala Glu Met Ile Lys Asn Cys Met Ser Gln Glu Leu Ser Trp Lys

565 570 575

Glu Pro Ala Lys Lys Trp Glu Thr Leu Leu Leu Ser Leu Gly Ala Ala

580 585 590

Gly Ser Glu Ala Gly Val Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys

595 600 605

Glu Asn Val Ala Ala Pro

610