导航：首页> 测量；测试>一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA应用、挖掘及鉴定方法

一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA应用、挖掘及鉴定方法

文献发布时间：2023-06-19 11:59:12

技术领域

本发明涉及猪脂肪沉积领域，具体涉及一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA应用、挖掘及功能鉴定方法。

背景技术

我国地方猪种素有高繁殖性能和优良肉质而享誉世界，能够满足消费者对肉质的需求。但地方猪主要属于脂肪型，具有高背膘厚、低瘦肉率等特点。猪瘦肉率与背膘厚之间呈很强的负相关，而背膘厚较高、瘦肉率较低是制约地方猪养殖经济效益的重要经济性状，已不能适应现代消费市场和理念，且传统选育方法进展缓慢。

畜禽育种目标是由市场和消费需求决定的，随着市场消费观念的转变，地方猪脂肪经济价值较低，如果能在保持其优良肉质与风味的同时，通过品种改良来降低脂肪厚度、提高瘦肉率将是地方猪开发利用和回归市场的主要途径。

柯乐猪为我国优良品种之一，原产贵州赫章，以柯乐(今可乐)为中心产区，分布于贵州西北部和云南宣威、曲靖等地。毛色黑或棕黄，常有额白、尾尖白、四蹄白等特征。额部有明显的八卦型皱纹。具有抗寒、耐湿、耐粗饲料、早熟、易肥的特点。

现有技术中，中国专利申请，申请号为：201711461874.7，发明名称为：一种猪肌内脂肪组织提取的新LncRNA及其应用。但此发明是以大白猪和莱芜猪为研究对象，采用RNA-Seq结合生物信息学方法，分析高低肌内脂肪组织基因表达谱，该LncRNA筛选方法存在局限性，并未采用LncRNA的co-expression靶基因和co-location靶基因联合预测分析法。

现有技术中，中国专利申请，申请号201711365559.4，发明名称：LncRNA及其靶基因在选育高品质畜禽品种中应用，本发明公开了LncRNA及其靶基因在选育高品质畜禽品种中应用。发明发现了与肌内脂肪相关的XLOC_027632，通过共表达网络分析及trans调控作用分析预测差异表达LncRNA的靶基因ROBO1，并进行了验证。但此研究所筛选的差异表达LncRNA方法，方法涉及的局限性太强，不够全面，完全未针对XLOC_027632进行构建真核表达的功能验证。

现有技术中，中国专利申请，申请号201711365575.3，发明名称：一种肌内脂肪相关的LncRNA及其应用，本发明公开了一种肌内脂肪相关的LncRNA及其应用。发明发现了与猪肉肌内脂肪相关的XLOC_004398，通过共表达网络分析及trans调控作用分析预测差异表达LncRNA的靶基因NAP1L3，并进行了验证。发明为培育高肉品质畜禽品种及治疗和预防脂代谢相关疾病研究提供一定依据，探索新的靶标。该专利与201711365559.4专利内容相近，方法涉及的局限性太强，不够全面，完全未针对新LncRNA进行过表达功能验证，验证部分欠缺，方法缺乏系统性、完整性。

因此，为了解决上述问题，为迅速推进地方猪背膘厚选育进展，提高瘦肉率，激活地方猪品种资源经济潜能，本发明拟从柯乐猪中筛选鉴定新关键LncRNA角度，挖掘调控猪脂肪沉积LncRNA，并加以应用，提高地方猪瘦肉率和养殖经济效益，具有明显实用价值及意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA。

本发明的另一目的是提供一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA的应用。

本发明的另一目的是提供一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA挖掘方法。

本发明的另一目的是提供一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA功能鉴定方法。

本如果爱所述LncRNA名称为TCONS_00161198，其序列如SEQ ID.1所示。

本发明所述新LncRNA在调控猪脂肪沉积中的应用。

本发明所述新LncRNA在预测猪肉胴体品质中的应用。

本发明所述新LncRNA在选育不同胴体品质猪中的应用。

本发明所述的新LncRNA挖掘方法为：1)RNA的提取与检测；2)cDNA的合成；3)RNA-seq；4)LncRNA序列对比及分析；5)筛选差异表达LncRNA；6)LncRNA靶基因功能预测及分析；7)对筛选出的LncRNA进行进一步的筛选。

优选的，本发明所述新LncRNA挖掘方法为：

RNA的提取与检测方法为：

S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取0.5～5g；

S2)将组织粉末移至有0.5～3mL Trizol的离心管中，混匀，室温静置2～8min；

S3)加入0.1～0.5mL氯仿，混匀，静置2～8min，2～6℃离心10～20min；

S4)将上清液转移至离心管中，加入0.2～0.8mL异丙醇，混匀，静置5～15min，2～6℃离心10～20min；

S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65-80％乙醇，混合均匀，2～6℃离心2～8min；

S6)将步骤S5)重复一次；

S7)移去上清液后静置1～5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70～-85℃保存；

S8)RNA完整性检测：将2～8μL RNA与0.5～1.5μL RNA Loading buffer混匀，取3～8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 2～8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70～-85℃保存；

cDNA的合成方法为：从总RNA中去除核糖体RNA，随后将RNA打断成250～300bp的短片段，以片段化的RNA为模板，随机寡核苷酸为引物合成cDNA第一条链，随后用RNase H降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链，纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，筛选350～400bp的cDNA；

RNA-seq的方法为：使用USER酶降解含U的cDNA第二链，最后进行PCR扩增并获得文库；初步定量，稀释文库至1ng/ul；再检测对文库的插入片段长度insert size进行检测，insert size分布在250～300bp符合预期；库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求pooling后进行Illumina PE150测序；

LncRNA序列对比及分析方法为：获得原始数据后，对原始数据进行过滤：去除带接头序列；去除无法确定碱基信息大于0.2％序列；去除单端序列含50％以上低质量碱基序列，分析可用序列，筛选出与参考基因组对比后有效数据，对对比率进行统计；

筛选差异表达LncRNA的方法为：RNA-seq的基因表达水平用FPKM表示，计算各样本所有基因或转录本的表达值后，通过盒形图展示不同样本基因或转录本表达水平的分布情况，通过所有样本的表达矩阵，进行基因或转录本水平的表达差异显著性分析，寻找与处理组相关的功能基因或转录本，使用p value＜0.05且|log2FoldChange|＞1作为差异显著性标准；

LncRNA靶基因功能预测及分析方法为：对比蛋白编码基因与LncRNA的位置关系和表达相关性预测LncRNA靶基因，对差异表达LncRNA的靶基因进行功能富集分析GO/KEGG预测Ln cRNA主要功能。

进一步优选的，RNA的提取与检测方法为：

S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取1～2g；

S2)将组织粉末移至有0.5～3mL Trizol离心管中，混匀，室温静置5min；

S3)加入0.2mL氯仿，混匀，静置5min，4℃离心15min；

S4)将上清液转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，静置10min，4℃离心15min；

S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入75％乙醇，混合均匀，4℃离心5min；

S6)将步骤S5)重复一次；

S7)移去上清液后静置3分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-80℃保存；

S8)RNA完整性检测：将5μL RNA与1μL RNA Loading buffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 5min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存；

本发明所述对筛选出的LncRNA进行进一步筛选的方法为：

1)引物设计与合成

根据测序数据原始序列，设计LncRNA荧光定量引物；以猪的GAPDH基因作为LncRNA内参，各基因号及引物序列见表4；

2)RNA提取与检测

S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取0.5～5g；

S2)将组织粉末移至有0.5～3mL Trizol的离心管中，混匀，室温静置2～8min；

S3)加入0.1-0.5mL氯仿，混匀，静置2～8min，2～6℃离心10～20min；

S4)将上清液转移至离心管中，加入0.2～0.8mL异丙醇，混匀，静置5～15min，2～6℃离心10～20min；

S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65-80％乙醇，混合均匀，2～6℃离心2～8min；

S6)将步骤S5)重复一次；

S7)移去上清液后静置1～5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70～-85℃保存；

S8)RNA完整性检测：将2～8μL RNA与0.5～1.5μL RNA Loading buffer混匀，取3～8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 2～8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70～-85℃保存；

3)cDNA合成

对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

4)差异表达LncRNA的验证

从筛选出的差异表达LncRNA中随机选择出LncRNA，利用qRT-PCR对测序结果进行验证，将合成的引物稀释至10nM，以逆转录的cDNA为模板，反应体系采用10μL，包含SYBRGreen qPCR Master Mix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-free H

5)数据统计与分析

计算皮下脂肪组织中目的LncRNA和内参基因mRNA表达量，计算各性状参数，分析各性状间相关性,结果以“平均数±标准差”表示。

本发明所述新LncRNA的应用鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)LncRNA真核表达载体的构建

S1)引物设计及PCR扩增

设计其克隆引物，先以柯乐猪皮下脂肪组织cDNA为模板，通过普通PCR反应，扩增出长度为810bp目的片段全长；设计基因引物，扩增引物、反应体系和程序见表7、表8和表9；

S2)产物纯化及载体连接

S2.1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；

S2.2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入离心管中；

S2.3)向离心管中加入300～500μL BufferDE-A，将离心管放置于65～85℃水浴锅中加热，摇晃，直到凝胶完全融化；

S2.4)完全融化后向离心管中加入150～250μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,室温离心20～40s，弃掉离心管中的滤液；

S2.5)向制备管中加入400～600μL的BufferW1，室温离心20～40s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；

S2.6)向制备管中加入600～800μL的BufferW2，室温离心20～40s，弃掉滤液，然后再重复一次；

S2.7)室温离心1～3min，去掉离心管中的残留液体，室温放置1～3min；

S2.8)将制备管放入新的0.5～2.0mL离心管中，向制备膜的中间加放入50～70℃的水浴锅加热的洗涤液25～35μL，室温静止放置1～3min，离心0.5～2min，滤液即为纯化后的产物，将离心管取出，放于-15～-25℃冰箱备用；

S2.9)载体连接，连接方法如表10：

3)产物转化

S1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1-3ul加入到80～120μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置2～4min；

S2)38～43℃水浴70～110s；

S3)冰浴中放置1～5min；

S4)每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡35～45min；

4)菌液PCR鉴定

S1)制备含相应抗性的琼脂平板；

S2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养10～15min；

S3)倒置平板于37℃培养12-16h可出现菌落；

S4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌10～16h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer3ul，ddH2O 14μL，循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min，将阳性克隆菌液送测序；测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切；

5)无内毒素质粒提取

在25mL LB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜，步骤如下：

S1)吸取6～10mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃离心0.5-1.5min，移去上清，保留沉淀；

S2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1,P1中提前加入RNase A，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；

S3)向离心管中加入500μL溶液P2，摇晃7～15s，使菌体基本裂解；

S4)加入700μL溶液P3，翻转7～15s，充分混匀，4℃离心8～12min；

S5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，4℃离心0.5～1.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，4℃离心0.5～1.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S7)将步骤S6)重复操作一次；

S8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心1～4min；

S9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2～8min，4℃离心1～3min；

S10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度；

6)猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存

S1)细胞复苏

S1.1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；

S1.2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，离心8～12min；

S1.3)弃培养基上清，留细胞沉淀，加入适量10％完全培养基吹打成细胞悬液，将离心管中悬液转移至细胞培养瓶中，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO

S2细胞传代

S2.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗2～4次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

S2.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；

S2.3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO

S3细胞冻存

S3.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗2～4次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

S3.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL 10％细胞完全培养基终止消化；

S3.3)将培养瓶中悬液移至离心管中，离心5～15min，移弃培养基上清；

S3.4)在上述离心管中加入100μL DMSO和900μL胎牛血清，吹打制成细胞悬液；

S3.5)将细胞悬液转移至1.5mL的细胞冻存管中，梯度温度冻存，先4℃保存2h，再移至-20℃保存2h，最后置于液氮或-80℃冰箱保存；

S4)细胞转染及诱导分化

S4.1)细胞转染

以6孔板为例，将细胞悬液接种于6孔板中，当细胞完全汇合2d后进行转染。

S4.1.1)6孔板中每孔转染试剂配制：

试剂A：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

试剂B：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

S4.1.2)将试剂B加入A中，室温孵育15～25min，形成DNA-脂质体复合物。

S4.1.3)移弃6孔板中培养基，用无双抗PBS清洗2次，将上述混合试剂加入6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；

S4.2)诱导分化

将转染后的细胞悬液接种于6孔板中，细胞完全汇合2d后将培养基更换为诱导分化培养基，并记为0d，更换培养基前先用含双抗的PBS清洗小心清洗细胞2次，诱导至2d后将培养基更换为维持分化培养基，每2d更换一次培养基；

S5)细胞总RNA的提取及cDNA的合成

S5.1)分别提取转染36h后的细胞RNA，移弃培养板中的培养基，用PBS清洗3次，加入1mL Trizol，室温静置5min，充分裂解细胞，再将培养板中的混液移至离心管中；

S5.2)加入0.1～0.5mL氯仿，混匀，静置2～8min，2～6℃离心10～20min；

S5.3)将上清液转移至离心管中，加入0.2～0.8mL异丙醇，混匀，静置5～15min，2～6℃离心10～20min；

S5.4)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65-80％乙醇，混合均匀，2～6℃离心2～8min；

S5.5)将步骤S5)重复一次；

S5.6)移去上清液后静置1～5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70～-85℃保存；

S5.7)RNA完整性检测：将2～8μL RNA与0.5～1.5μL RNA Loading buffer混匀，取3～8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 2～8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S5.8)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70～-85℃保存；

S5.9)cDNA的合成：对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

S6)实时荧光定量PCR反应

样品为猪皮下脂肪前体细胞，使用CFX96实时定量PCR仪对基因表达量进行定量分析，以GAP DH基因作为内参，对单个样品设置3个重复,实时荧光定量体系采用10μL，包含SYBR Green qPCR Master Mix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-f ree H

S7)油红O染色、萃取及甘油三酯的检测

诱导分化第8d时进行以下操作：

S7.1)用PBS将需要染色的细胞清洗2～4次，再用4％多聚甲醛固定20～30min；

S7.2)弃多聚甲醛并用PBS清洗3次，加入现配且已过滤除菌的油红O工作液，染色试剂加入量以刚好能覆盖细胞培养板底部为最佳，染色20～40min；

S7.3)移弃油红O工作液，用PBS清洗2～4次，显微镜下拍照；

S7.4)往各孔细胞中加入等量异丙醇，置入37℃恒温摇床，100rpm/min，20min后用酶标仪检测510mm波长的吸光值；

S8)数据统计与分析

计算皮下脂肪前体细胞中LncRNA、靶基因、脂肪沉积相关酶基因和内参基因mRNA表达量，结果以“平均数±标准差”表示；用独立样本T检验分析组间基因表达量差异；制图。

无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，本发明所指的P1、P2、P3溶液是指试剂盒中标注的溶液。

本发明所述的功能鉴定方法包括以下步骤：

1)LncRNA真核表达载体的构建

S1)引物设计及PCR扩增

S2)产物纯化及载体连接

S2.1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；

S2.2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入1.5mL的离心管中；

S2.3)向离心管中加入400μL BufferDE-A，将离心管放置于75℃水浴锅中加热，摇晃，直到凝胶完全融化；

S2.4)完全融化后向离心管中加入200μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,室温离心30s，弃掉离心管中的滤液；

S2.5)向制备管中加入500μL的BufferW1，室温离心30s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；

S2.6)向制备管中加入700μL的BufferW2，室温离心30s，弃掉滤液，然后再重复一次；

S2.7)室温离心2min，去掉离心管中的残留液体，室温放置2min；

S2.8)将制备管放入新的1.5mL离心管中，向制备膜的中间加放入65℃的水浴锅加热的洗涤液30μL，室温静止放置2min，离心1min，滤液即为纯化后的产物，将离心管取出，放于-20℃冰箱备用；

S2.9)载体连接，连接方法如表10：

3)产物转化

S1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1～3ul加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3min；

S2)42℃水浴90s；

S3)冰浴中放置3min左右；

S4)每管中加入500～800μl37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡40min；

4)菌液PCR鉴定

S1)制备含相应抗性的琼脂平板；

S2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15min；

S3)倒置平板于37℃培养12～16h可出现菌落；

S4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌14h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3ul，ddH2O 14μL，循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min，将阳性克隆菌液送测序；测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切；

5)无内毒素质粒提取

在25mL LB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜，步骤如下：

S1)吸取8mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃离心1min，移去上清，保留沉淀；

S2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1(P1中提前加入RNase A)，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；

S3)向离心管中加入500μL溶液P2，缓慢地上下颠倒10s，使菌体基本裂解；

S4)加入700μL溶液P3，立刻缓慢地上下翻转10s，充分混匀，4℃离心10min；

S5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，4℃离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，4℃离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S7)将步骤S6)重复操作一次；

S8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心2min；

S9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置5min，4℃离心2min；

S10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度；

6)猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存

S1)细胞复苏

S1.1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；

S1.2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，离心10min；

S2细胞传代

S2.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

S2.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；

S2.3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO

S3细胞冻存

S3.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

S3.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL 10％细胞完全培养基终止消化；

S3.3)将培养瓶中悬液移至离心管中，1500rpm/min离心10min，移弃培养基上清；

S3.4)在上述离心管中加入100μL DMSO和900μL胎牛血清，吹打制成细胞悬液；

S3.5)将细胞悬液转移至1.5mL的细胞冻存管中，梯度温度冻存，先4℃保存2h，再移至-20℃保存2h，最后置于液氮或-80℃冰箱保存；

S4)细胞转染及诱导分化

S4.1)细胞转染

以6孔板为例，将细胞悬液接种于6孔板中，当细胞完全汇合2d后进行转染。

S4.1.1)6孔板中每孔转染试剂配制：

试剂A：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

试剂B：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

S4.1.2)将试剂B加入A中，室温孵育20min，形成DNA-脂质体复合物。

S4.1.3)移弃6孔板中培养基，用无双抗PBS清洗2次，将上述混合试剂加入6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；

S4.2)诱导分化

S5)细胞总RNA的提取及cDNA的合成

S5.2)加入0.2mL氯仿，混匀，静置5min，4℃离心15min；

S5.3)将上清液转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，静置10min，4℃离心15min；

S5.4)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入75％乙醇，混合均匀，4℃离心5min；

S5.5)将步骤S5)重复一次；

S5.6)移去上清液后静置3分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-80℃保存；

S5.7)RNA完整性检测：将5μL RNA与1μL RNA Loading buffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 5min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S5.8)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存；

S5.9)cDNA的合成：对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

S6)实时荧光定量PCR反应

S7)油红O染色、萃取及甘油三酯的检测

诱导分化第8d时进行以下操作：

S7.1)用PBS将需要染色的细胞清洗3次，再用4％多聚甲醛固定20～30min；

S7.2)弃多聚甲醛并用PBS清洗3次，加入现配且已过滤除菌的油红O工作液，染色试剂加入量以刚好能覆盖细胞培养板底部为最佳，染色30min；

S7.3)移弃油红O工作液，用PBS清洗3次，显微镜下拍照；

S7.4)往各孔细胞中加入等量异丙醇，置入37℃恒温摇床，100rpm/min，20min后用酶标仪检测510mm波长的吸光值；

S8)数据统计与分析

有益效果：

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1、本发明首次筛选出显著差异表达LncRNA，再对LncRNA的co-expression靶基因和co-location靶基因进行预测及功能分析，在两个层面均挖掘了TCONS_00161198这个差异表达LncR NA，通过功能鉴定，明确了LncRNATCONS_00161198在调控猪脂肪沉积中的作用，并且新LncRN A还可以在预测猪肉胴体品质中的应用以及在选育不同胴体品质猪中的应用。

2、从筛选鉴定新关键LncRNA角度，挖掘调控猪脂肪沉积LncRNA，并加以应用，可降低猪背膘厚性状，提高地方猪瘦肉率和养殖经济效益，具有明显实用价值及意义。

3、本发明利用普通PCR方法进行目的基因片段和内参基因片段进行扩增，并经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。TCONS_00161198引物PCR扩增产物长度与目的片段与预期片段大小相符，电泳条带清晰、无拖尾、拖带现象。

4、本发明通过对高低背膘厚组皮下脂肪组织进行RT-qPCR，并对LncRNA在皮下脂肪组织中的表达量与生产数据进行相关性分析RT-qPCR的结果与RNA-seq结果一致，表示RNA-seq数据可靠，相关性分析发现TCONS_00161198的表达与背膘厚呈极显著正相关(r＝0.946)，与眼肌面积呈显著负相关(r＝-0.942)。试验结果显示，TCONS_00161198LncRNA可能对柯乐猪脂肪沉积具有影响作用。

5、TCONS_00161198与RNA-seq中的序列完全一致。

附图说明

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果(M：DM2000 DNA Marker；1：TCONS_00161198扩增产物)。

图2 LncRNA的qRT-PCR验证(注：*表示两组间差异显著(P＜0.05)，**表示两组间差异极显著(P＜0.01)。

图3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果(M：DM2000 DNA Marker；6～10：PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH基因的扩增产物。11～12：MOGAT2、CSF3R基因的扩增引物)。

图4 pEGFP-TCONS_00161198序列的PCR扩增。

图5各重组质粒转染猪皮下脂肪前体细胞镜检结果(100x)。

图6 LncRNA及其靶基因、脂肪沉积相关基因mRNA表达量。

图7猪皮下脂肪细胞油红O染色。

图8 OD510与甘油三酯含量对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。

1、RNA的提取与检测方法为：

S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取1～2g；

S2)将组织粉末移至有1mL Trizol的离心管中，混匀，室温静置5min；

S3)加入0.2mL氯仿，混匀，静置5min，4℃离心15min；

S4)将上清液转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，静置10min，4℃离心15min；

S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入75％乙醇，混合均匀，4℃离心5min；

S6)将步骤S5)重复一次；

S7)移去上清液后静置3分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-80℃保存；

S8)RNA完整性检测：将5μL RNA与1μL RNA Loading buffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 5min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存；

2、cDNA的合成方法为：从总RNA中去除核糖体RNA，随后将RNA打断成250～300bp的短片段，以片段化的RNA为模板，随机寡核苷酸为引物合成cDNA第一条链，随后用RNase H降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链，纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，筛选350～400bp的cDNA；

3、RNA-seq的方法为：使用USER酶降解含U的cDNA第二链，最后进行PCR扩增并获得文库；初步定量，稀释文库至1ng/ul；再检测对文库的插入片段长度insert size进行检测，insert size分布在250～300bp符合预期；库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求pooling后进行Illumina PE150测序；

4、LncRNA序列对比及分析方法为：获得原始数据后，对原始数据进行过滤：去除带接头序列；去除无法确定碱基信息大于0.2％序列；去除单端序列含50％以上低质量碱基序列，分析可用序列，筛选出与参考基因组对比后有效数据，对对比率进行统计；

5、筛选差异表达LncRNA的方法为：RNA-seq的基因表达水平用FPKM表示，计算各样本所有基因或转录本的表达值后，通过盒形图展示不同样本基因或转录本表达水平的分布情况，通过所有样本的表达矩阵，进行基因或转录本水平的表达差异显著性分析，寻找与处理组相关的功能基因或转录本，使用p value＜0.05且|log2FoldChange|＞1作为差异显著性标准；

6、LncRNA靶基因功能预测及分析方法为：对比蛋白编码基因与LncRNA的位置关系和表达相关性预测LncRNA靶基因，对差异表达LncRNA的靶基因进行功能富集分析GO/KEGG预测LncRNA主要功能。

1、RNA的提取与检测方法为：

S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取0.5g；

S2)将组织粉末移至有0.5mL Trizol的离心管中，混匀，室温静置2min；

S3)加入0.1mL氯仿，混匀，静置2min，2℃离心10min；

S4)将上清液转移至离心管中，加入0.2mL异丙醇，混匀，静置5min，2℃离心10min；

S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65％乙醇，混合均匀，2℃离心2min；

S6)将步骤S5)重复一次；

S7)移去上清液后静置1分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70℃保存；

S8)RNA完整性检测：将2μL RNA与0.5μL RNA Loading buffer混匀，取3μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 2min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70℃保存；

1、RNA的提取与检测方法为：

S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取5g；

S2)将组织粉末移至有3mL Trizol的离心管中，混匀，室温静置8min；

S3)加入0.5mL氯仿，混匀，静置8min，6℃离心20min；

S4)将上清液转移至离心管中，加入0.8mL异丙醇，混匀，静置15min，6℃离心20min；

S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入80％乙醇，混合均匀，6℃离心8min；

S6)将步骤S5)重复一次；

S7)移去上清液后静置5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-85℃保存；

S8)RNA完整性检测：将8μL RNA与1.5μL RNA Loading buffer混匀，取8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-85℃保存；

1)引物设计与合成

根据测序数据原始序列，设计LncRNA荧光定量引物；以猪的GAPDH基因作为LncRNA内参，各基因号及引物序列见表4；

表4 LncRNA和GAPDH基因引物序列

2)RNA提取与检测

使用实施例1-3任一RNA提取与检测方法

3)cDNA合成

对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

表5逆转录反应体系和条件

4)差异表达LncRNA的验证

从筛选出的差异表达LncRNA中随机选择出LncRNA，利用qRT-PCR对测序结果进行验证，将合成的引物稀释至10nM，以逆转录的cDNA为模板，反应体系采用10μL，包含SYBR Green qPCR Master Mix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-free H

5)数据统计与分析

在Excel 2016软件中，运用2-

1)LncRNA真核表达载体的构建

S1)引物设计及PCR扩增

设计其克隆引物，先以柯乐猪皮下脂肪组织cDNA为模板，通过普通PCR反应，扩增出长度为810bp目的片段全长；设计基因引物，扩增引物、反应体系和程序分别见表7、表8和表9；

表7 pEGFP-TCONS_00161198、pEGFP-TCONS_00185937的扩增引物

注：引物下划线部分为酶切位点

表8引物PCR反应体系

表9引物PCR反应程序

S2)产物纯化及载体连接

S2.1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；

S2.2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入1.5mL的离心管中；

S2.3)向离心管中加入300μL BufferDE-A，将离心管放置于65℃水浴锅中加热，摇晃，直到凝胶完全融化；

S2.4)完全融化后向离心管中加入150μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,室温离心20s，弃掉离心管中的滤液；

S2.5)制备管中加入400μL的BufferW1，室温离心20s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；

S2.6)向制备管中加入600μL的BufferW2，室温离心20s，弃掉滤液，然后再重复一次；

S2.7)室温离心1min，去掉离心管中的残留液体，室温放置1min；

S2.8)将制备管放入新的0.5～2.0mL离心管中，向制备膜的中间加放入50℃的水浴锅加热的洗涤液25μL，室温静止放置1min，离心0.5min，滤液即为纯化后的产物，将离心管取出，放于-15℃冰箱备用；

S2.9)载体连接，连接方法如表10：

表10目的片段与载体连接反应体系

以上连接液在52℃恒温环境下连接30

3)产物转化

S1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1ul加入到80μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置2min；

S2)38℃水浴70s；

S3)冰浴中放置1min；

S4)每管中加入500μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡35～45mi n；

4)菌液PCR鉴定

S1)制备含相应抗性的琼脂平板；

S2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养10min；

S3)倒置平板于37℃培养12h可出现菌落；

S4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌10h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3ul，ddH2O14μL，循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min，将阳性克隆菌液送测序；测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切；

5)无内毒素质粒提取

在25mL LB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜，步骤如下：

S1)吸取6mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃离心0.5min，移去上清，保留沉淀；

S2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1,P1中提前加入RNase A，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；

S3)向离心管中加入500μL溶液P2，摇晃7s，使菌体基本裂解；

S4)加入700μL溶液P3，翻转7s，充分混匀，4℃离心8min；

S5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，4℃离心0.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，4℃离心0.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S7)将步骤S6)重复操作一次；

S8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心1min；

S9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，4℃离心1min；

S10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度；

6)猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存

S1)细胞复苏

S1.1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；

S1.2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，离心8min；

S2细胞传代

S2.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗2次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2min；

S2.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；

S2.3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO

S3细胞冻存

S3.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗2次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2min；

S3.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；

S3.3)将培养瓶中悬液移至离心管中，离心5min，移弃培养基上清；

S3.4)在上述离心管中加入100μL DMSO和900μL胎牛血清，吹打制成细胞悬液；

S3.5)将细胞悬液转移至1.5mL的细胞冻存管中，梯度温度冻存，先4℃保存2h，再移至-20℃保存2h，最后置于液氮或-80℃冰箱保存；

S4)细胞转染及诱导分化

S4.1)细胞转染

以6孔板为例，将细胞悬液接种于6孔板中，当细胞完全汇合2d后进行转染。

S4.1.1)6孔板中每孔转染试剂配制：

试剂A：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

试剂B：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

S4.1.2)将试剂B加入A中，室温孵育15min，形成DNA-脂质体复合物。

S4.1.3)移弃6孔板中培养基，用无双抗PBS清洗2次，将上述混合试剂加入6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；

S4.2)诱导分化

S5)细胞总RNA的提取及cDNA的合成

S5.2)加入0.1mL氯仿，混匀，静置2min，2℃离心10min；

S5.3)将上清液转移至离心管中，加入0.2mL异丙醇，混匀，静置5min，2℃离心10min；

S5.4)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65％乙醇，混合均匀，2℃离心2min；

S5.5)将步骤S5)重复一次；

S5.6)移去上清液后静置1分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70℃保存；

S5.7)RNA完整性检测：将2μL RNA与0.5μL RNA Loading buffer混匀，取3μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 2min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S5.8)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70℃保存；

S5.9)cDNA的合成：对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

S6)实时荧光定量PCR反应

S7)油红O染色、萃取及甘油三酯的检测

诱导分化第8d时进行以下操作：

S7.1)用PBS将需要染色的细胞清洗2次，再用4％多聚甲醛固定20min；

S7.2)弃多聚甲醛并用PBS清洗3次，加入现配且已过滤除菌的油红O工作液，染色试剂加入量以刚好能覆盖细胞培养板底部为最佳，染色20min；

S7.3)移弃油红O工作液，用PBS清洗2次，显微镜下拍照；

S7.4)往各孔细胞中加入等量异丙醇，置入37℃恒温摇床，100rpm/min，20min后用酶标仪检测510mm波长的吸光值；

S8)数据统计与分析

1)LncRNA真核表达载体的构建

S1)引物设计及PCR扩增

设计其克隆引物，先以柯乐猪皮下脂肪组织cDNA为模板，通过普通PCR反应，扩增出长度为810bp目的片段全长；设计基因引物，扩增引物、反应体系和程序分别见实施例5的表7、表8和表9；

S2)产物纯化及载体连接

S2.1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；

S2.2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入1.5mL的离心管中；

S2.3)向离心管中加入500μL BufferDE-A，将离心管放置于85℃水浴锅中加热，摇晃，直到凝胶完全融化；

S2.4)完全融化后向离心管中加入250μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,室温离心40s，弃掉离心管中的滤液；

S2.5)制备管中加入600μL的BufferW1，室温离心40s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；

S2.6)向制备管中加入800μL的BufferW2，室温离心40s，弃掉滤液，然后再重复一次；

S2.7)室温离心3min，去掉离心管中的残留液体，室温放置3min；

S2.8)将制备管放入新的0.5～2.0mL离心管中，向制备膜的中间加放入70℃的水浴锅加热的洗涤液35μL，室温静止放置3min，离心2min，滤液即为纯化后的产物，将离心管取出，放于-25℃冰箱备用；

S2.9)载体连接，连接方法如实施例5的表10：

3)产物转化

S1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取3ul加入到120μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置4min；

S2)43℃水浴110s；

S3)冰浴中放置5min；

S4)每管中加入800μl37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡35～45min；

4)菌液PCR鉴定

S1)制备含相应抗性的琼脂平板；

S2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15min；

S3)倒置平板于37℃培养16h可出现菌落；

S4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌16h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3ul，ddH2O 14μL，循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min，将阳性克隆菌液送测序；测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切；

5)无内毒素质粒提取

在25mL LB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜，步骤如下：

S1)吸取10mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃离心1.5min，移去上清，保留沉淀；

S2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1,P1中提前加入RNase A，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；

S3)向离心管中加入500μL溶液P2，摇晃15s，使菌体基本裂解；

S4)加入700μL溶液P3，翻转15s，充分混匀，4℃离心8～12min；

S5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，4℃离心1.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，4℃离心1.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S7)将步骤S6)重复操作一次；

S8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心4min；

S9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置8min，4℃离心3min；

S10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度；

6)猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存

S1)细胞复苏

S1.1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；

S1.2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，离心12min；

S2细胞传代

S2.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗4次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化3min；

S2.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；

S2.3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO

S3细胞冻存

S3.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗4次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化3min；

S3.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL 10％细胞完全培养基终止消化；

S3.3)将培养瓶中悬液移至离心管中，离心15min，移弃培养基上清；

S3.4)在上述离心管中加入100μL DMSO和900μL胎牛血清，吹打制成细胞悬液；

S3.5)将细胞悬液转移至1.5mL的细胞冻存管中，梯度温度冻存，先4℃保存2h，再移至-20℃保存2h，最后置于液氮或-80℃冰箱保存；

S4)细胞转染及诱导分化

S4.1)细胞转染

以6孔板为例，将细胞悬液接种于6孔板中，当细胞完全汇合2d后进行转染。

S4.1.1)6孔板中每孔转染试剂配制：

试剂A：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

试剂B：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

S4.1.2)将试剂B加入A中，室温孵育25min，形成DNA-脂质体复合物。

S4.1.3)移弃6孔板中培养基，用无双抗PBS清洗2次，将上述混合试剂加入6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；

S4.2)诱导分化

S5)细胞总RNA的提取及cDNA的合成

S5.2)加入0.5mL氯仿，混匀，静置8min，6℃离心20min；

S5.3)将上清液转移至离心管中，加入0.8mL异丙醇，混匀，静置15min，6℃离心20mi n；

S5.4)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入80％乙醇，混合均匀，6℃离心8min；

S5.5)将步骤S5)重复一次；

S5.6)移去上清液后静置5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-85℃保存；

S5.7)RNA完整性检测：将8μL RNA与1.5μL RNA Loading buffer混匀，取8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S5.8)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-85℃保存；

S5.9)cDNA的合成：对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

S6)实时荧光定量PCR反应

S7)油红O染色、萃取及甘油三酯的检测

诱导分化第8d时进行以下操作：

S7.1)用PBS将需要染色的细胞清洗4次，再用4％多聚甲醛固定30min；

S7.2)弃多聚甲醛并用PBS清洗3次，加入现配且已过滤除菌的油红O工作液，染色试剂加入量以刚好能覆盖细胞培养板底部为最佳，染色40min；

S7.3)移弃油红O工作液，用PBS清洗4次，显微镜下拍照；

S7.4)往各孔细胞中加入等量异丙醇，置入37℃恒温摇床，100rpm/min，20min后用酶标仪检测510mm波长的吸光值；

S8)数据统计与分析

实施例7

1)LncRNA真核表达载体的构建

S1)引物设计及PCR扩增

S2)产物纯化及载体连接

S2.1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；

S2.2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入1.5mL的离心管中；

S2.3)向离心管中加入400μL BufferDE-A，将离心管放置于75℃水浴锅中加热，摇晃，直到凝胶完全融化；

S2.4)完全融化后向离心管中加入200μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,室温离心30s，弃掉离心管中的滤液；

S2.5)制备管中加入500μL的BufferW1，室温离心30s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；

S2.6)向制备管中加入700μL的BufferW2，室温离心30s，弃掉滤液，然后再重复一次；

S2.7)室温离心2min，去掉离心管中的残留液体，室温放置2min；

S2.9)载体连接，连接方法如实施例5的表10：

3)产物转化

S1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1-3ul加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3min；

S2)42℃水浴90s；

S3)冰浴中放置3min左右；

S4)每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡40min；

4)菌液PCR鉴定

S1)制备含相应抗性的琼脂平板；

S2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15min；

S3)倒置平板于37℃培养12-16h可出现菌落；

S4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌14h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3ul，dd H2O 14μL，循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min，将阳性克隆菌液送测序；测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切；

5)无内毒素质粒提取

在25mL LB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜，步骤如下：

S1)吸取8mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃离心1min，移去上清，保留沉淀；

S2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1(P1中提前加入RNase A)，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；

S3)向离心管中加入500μL溶液P2，缓慢地上下颠倒10s，使菌体基本裂解；

S4)加入700μL溶液P3，立刻缓慢地上下翻转10s，充分混匀，4℃离心10min；

S5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，4℃离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，4℃离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

S7)将步骤S6)重复操作一次；

S8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心2min；

S9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置5min，4℃离心2min；

S10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度；

6)猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存

S1)细胞复苏

S1.1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；

S1.2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，离心10min；

S2细胞传代

S2.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

S2.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；

S2.3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％ CO

S3细胞冻存

S3.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

S3.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL 10％细胞完全培养基终止消化；

S3.3)将培养瓶中悬液移至离心管中，1500rpm/min离心10min，移弃培养基上清；

S3.4)在上述离心管中加入100μL DMSO和900μL胎牛血清，吹打制成细胞悬液；

S3.5)将细胞悬液转移至1.5mL的细胞冻存管中，梯度温度冻存，先4℃保存2h，再移至-20℃保存2h，最后置于液氮或-80℃冰箱保存；

S4)细胞转染及诱导分化

S4.1)细胞转染

以6孔板为例，将细胞悬液接种于6孔板中，当细胞完全汇合2d后进行转染。

S4.1.1)6孔板中每孔转染试剂配制：

试剂A：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

试剂B：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

S4.1.2)将试剂B加入A中，室温孵育20min，形成DNA-脂质体复合物。

S4.1.3)移弃6孔板中培养基，用无双抗PBS清洗2次，将上述混合试剂加入6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；

S4.2)诱导分化

S5)细胞总RNA的提取及cDNA的合成

S5.2)加入0.2mL氯仿，混匀，静置5min，4℃离心15min；

S5.3)将上清液转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，静置10min，4℃离心15mi n；

S5.4)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入75％乙醇，混合均匀，4℃离心5min；

S5.5)将步骤S5)重复一次；

S5.6)移去上清液后静置3分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-80℃保存；

S5.7)RNA完整性检测：将5μL RNA与1μL RNA Loading buffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 5min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S5.8)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存；

S5.9)cDNA的合成：对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

S6)实时荧光定量PCR反应

样品为猪皮下脂肪前体细胞，使用CFX96实时定量PCR仪对基因表达量进行定量分析，以GAPDH基因作为内参，对单个样品设置3个重复,实时荧光定量体系采用10μL，包含SYBR Green qPCR Master Mix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-free H

S7)油红O染色、萃取及甘油三酯的检测

诱导分化第8d时进行以下操作：

S7.1)用PBS将需要染色的细胞清洗3次，再用4％多聚甲醛固定20～30min；

S7.2)弃多聚甲醛并用PBS清洗3次，加入现配且已过滤除菌的油红O工作液，染色试剂加入量以刚好能覆盖细胞培养板底部为最佳，染色30min；

S7.3)移弃油红O工作液，用PBS清洗3次，显微镜下拍照；

S7.4)往各孔细胞中加入等量异丙醇，置入37℃恒温摇床，100rpm/min，20min后用酶标仪检测510mm波长的吸光值；

S8)数据统计与分析

为得出本发明的最佳方案，发明人进行了以下实验：

一、转录组测序

为筛选出对柯乐猪脂肪沉积相关LncRNA，本试验对高低背膘厚组柯乐猪皮下脂肪组织进行RNA-seq，筛选差异表达LncRNA；利用LncRNA与蛋白编码基因的位置关系(co-locatio n)和表达相关性(co-expression)预测LncRNA靶基因，对LncRNA靶基因进行功能富集分析(GO/KEGG)以预测LncRNA功能。为后续脂肪沉积相关LncRNA的鉴定提供数据支撑。

1试验材料

1.1试验动物

试验动物为柯乐猪屠宰测定后将其分为H组(高背膘厚组)和L组(低背膘厚组)，每组随机选取3头(分别将高背膘厚组标记为H1、H2、H3，将低背膘厚组标记为L1、L2、L3)，采集皮下脂肪组织，-80℃保存备用。

2试验方法

2.1 RNA的提取

取冻存的皮下脂肪组织置于研钵中研磨成粉末，用Trizol试剂提取总RNA(Invitrogen

2.2 cDNA的合成

从总RNA中去除核糖体RNA，随后将RNA打断成250～300bp的短片段，以片段化的RNA为模板，随机寡核苷酸为引物合成cDNA第一条链，随后用RNase H降解RNA链，并在DNApolymerase I体系下，以dNTPs(dUTP、dATP、dGTP和dCTP)为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选350～400bp左右的cDNA。

2.3 RNA-seq

使用USER酶降解含U的cDNA第二链，最后进行PCR扩增并获得文库；先用Qubit初步定量，稀释文库至1ng/ul；再用Agilent 2100bioanalyzer检测对文库的插入片段长度(insert size)进行检测，insert size大约分布在250～300bp左右符合预期；库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求pooling后进行Illumina PE150测序。PE150(Pairend 150bp)指高通量双端测序，每端各测150bp。整个流程委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

2.4 LncRNA序列对比及分析

为保证数据分析的质量及可靠性，需对原始数据进行过滤：去除带接头(adapter)的reads；去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于0.002的reads；当单端read中含有的低质量碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired reads。经过原始数据过滤、测序错误率检查及GC含量分布检查，获得后续分析使用的clean reads。采用Hisat2软件将测序得到的clean reads比对到到参考基因组上，统计其可以mapping到参考基因组的的有效数据，进一步统计mapping率。根据比对结果，分别统计reads在基因组外显子区域，内含子区域以及基因间区所占的比例。使用Cuffmerge软件对各样本拼接得到的转录本进行合并，去掉其中链方向不确定和转录本长度不超过200nt的转录本，接下来利用Cuff compare软件跟已知数据库进行比较，过滤掉数据库已知的转录本，最后对筛选到的新转录本进行编码潜能预测等，最终得到Novel_LncRNA；将上述比对、拼接、筛选后的已知转录本和预测得到的Novel_LncRNA、Unclassified转录本全部进行表达水平定量。

2.5筛选差异表达LncRNA

RNA-seq的基因表达水平用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcriptsequence per Millions base pairs sequenced)表示，计算各样本所有基因或转录本的表达值后，通过盒形图展示不同样本基因或转录本表达水平的分布情况。通过所有样本的表达矩阵，采用edgeR软件进行基因或转录本水平的表达差异显著性分析，寻找与处理组相关的功能基因或转录本，使用p value＜0.05且|log2FoldChange|＞1作为差异显著性标准。

2.6 LncRNA靶基因功能预测及分析

对比蛋白编码基因与LncRNA的位置关系(co-location)和表达相关性(co-expressio n)预测LncRNA靶基因。对差异表达LncRNA的靶基因进行功能富集分析(GO/KEGG)预测Ln cRNA主要功能。

3结果与分析

3.1试验动物胴体肉质测定

由表1可知，高低背膘厚组的背膘厚、眼肌面积、肌内脂肪含量和皮厚均达到了差异显著(P<0.05)。

表1柯乐猪的胴体性状

注：同行数据右上角标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母表示差异显著(P＜0.05)

3.2转录组数据质量分析

对原始数据进行过滤、检查测序错误率和GC含量分布后，获得高低背膘厚组共6个样品的可用序列，见表2。

表2 RNA-seq结果汇总

注：Sample name:样品名称；Raw reads:原始数据中的序列数；Clean reads:原始数据过滤后的序列数；Total mapped reads：比对到基因组上的序列数；Q20：碱基质量值大于20的碱基占总碱基的百分比；Q30：碱基质量值大于30的碱基占总碱基的百分比；GCcontent：可用序列中G与C占四种碱基的百分比

3.3高低背膘厚组皮下脂肪组织中LncRNA表达水平

为检验试验的可靠性和样本选择的合理性，开展样本间表达水平的相关检验，经分析可知，各组中3个样本表达相似，样本重复性好。共筛选出14 280个差异表达LncRNA，共有sense overlapping(41.42％)，lincRNA(35.88％)和antisense(22.70％)3种类型；新发现4911条LncRNA，在外显子数目、长度及开放阅读框均较为集中，LncRNA外显子区多数集中在5个以内，新发现LncRNA长度多集中在2 000bp以内。

3.4差异表达LncRNA

493个表达差异显著LncRNA中(P＜0.05)，171个表达差异极显著LncRNA(P＜0.01)(表3中展示了7个具有极显著差异的LncRNA(P＜0.01))，其中277个LncRNA在低背膘厚组显著上调(P＜0.05)，216个LncRNA在高背膘厚组显著上调(P＜0.05)。

表3差异表达LncRNA

注:Transcript_id：转录本名称；H_FPKM：高背膘厚组中每百万fragments中来自某一基因/转录本每千碱基长度的序列数目；L_FPKM：低背膘厚组中每百万fragments中来自某一基因/转录本每千碱基长度的序列数目；Log2FoldChange：Log2差异倍数；P-value：P值

5小结

本试验通过对背膘厚显著差异极显著(P＜0.01)的高低背膘厚组柯乐猪皮下脂肪组织RNA-seq，对表达差异显著LncRNA靶基因进行生物信息学分析，发现493个表达差异显著LncRNA(P＜0.05)，在co-location和co-expression均有极显著表达的2个LncRNA；在co-location层面和co-expression层面，分别筛选出5个/7个在多个信号通路中均有富集的LncRNA；并对富集在脂肪沉积相关信号通路中的LncRNA进行了筛选。试验认为，通过对LncRNA在高低背膘厚组皮下脂肪组织中的表达差异进行详细而全面的研究分析对找出与柯乐猪脂肪沉积相关机制的调控具有重要意义。

二、LncRNA与胴体肉质性状指标的相关性

为对第一项中筛选出的LncRNA进行进一步的筛选，本试验对高低背膘厚组柯乐猪的生产数据与LncRNA在高低背膘厚组柯乐猪皮下脂肪组织中的表达量进行相关性分析，以期找到对柯乐猪脂肪沉积具有影响作用的LncRNA，用于LncRNA在脂肪前体细胞中的功能研究。

1试验材料

1.1试验动物与样品采集

试验动物同第一条中的1.1。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂

Trizol试剂、无酶水、无水乙醇、DL2000 DNA Marker、2×Es Taq MasterMix、核酸染料、Tris碱均由康为世纪生物有限公司代购；SYBR Green qPCR Master Mix(No ROX)购自美国MCE公司；逆转录试剂盒逆转录试剂盒(Thermo Scientific RevertAidTM FirstStrand cDNA Synthesis)由西宝生物代购；乙醚、氯仿均由本实验室提供。

1.2.2主要试剂配制

(1)75％乙醇：量取75mL无水乙醇，加入25mL无酶水混匀，置于4℃保存。

(2)5×TAE：取12g Tris碱，2.855mL冰乙酸，5mL的0.5MEDTA，用双蒸水定容至500mL，置于室温保存。

(3)1×TAE：量取100mL 5×TAE，用双蒸水定容至500mL，置于室温保存。

(4)琼脂糖电泳凝胶：取1.5g琼脂糖，100mL 1×TAE，用微波炉加热溶解，室温冷却30s后加入3～4μL Glod ViewⅠ型核酸染色剂，现用现配。

1.2.3主要仪器

Ultrospec 2100pro型超微量紫外分光光度计购自美国赛默飞世尔公司；DYY-2C型电泳仪购自北京六一仪器厂；Bio-Rad Universal Hood II型凝胶成像系统、PTC200型PCR扩增仪、CFX96实时定量PCR仪均购自美国Bio-rad公司。

2试验方法

2.1引物设计与合成

根据测序数据原始序列，利用Primer 3.0和NCBI的BLAST软件设计LncRNA荧光定量引物；以猪的GAPDH基因作为LncRNA内参，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，各基因号及引物序列见表4。

表4 LncRNA和GAPDH基因引物序列

2.2 RNA提取与检测

利用Trizol法提取柯乐猪皮下脂肪组织RNA。提前用酒精棉球擦拭超净工作台台面，风干5分钟后将酒精灯、酒精棉球、手套、无酶枪头、微量移液器、剪刀、镊子、口罩、手套等放入超净工作台中，用紫外灯灭菌30min后通风20min，根据以下步骤提取RNA。

(1)利用少量液氮提前将需要使用的研钵预冷，迅速用剪刀分离适量组织至研钵中将其研磨成粉末状；

(2)立即将组织粉末移至有1mL Trizol的1.5mL无酶离心管中，充分震荡混匀，做好标记后室温静置5min；

(3)加入0.2mL氯仿，上下颠倒混匀15s，冰上静置5min，随后12 000rpm 4℃离心15min；

(4)用微量移液器将上清液转移至新的无酶离心管中，加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min，随后12000rpm 4℃离心15min；

(5)移去上清，保留无酶离心管白色沉淀，加入事先预冷的75％乙醇，充分混合均匀，7500rpm 4℃离心5min；

(6)将步骤(5)重复一次；

(7)用微量移液器小心移去上清液后室温静置数分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或立即存于-80℃保存。

RNA完整性检测：将5μL RNA与1μL RNA Loading buffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 5min后紫外凝胶成像系统观察拍照。

RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存。

2.3 cDNA合成

参照逆转录试剂盒对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存。反应体系和条件见表5。

表5逆转录反应体系和条件

2.4差异表达LncRNA进一步筛选

从筛选出的TCONS_00161198这一差异表达LncRNA，利用qRT-PCR方法，计算表达量与背膘厚指标相关性，完成进行进一步筛选。将合成的引物稀释至10nM，以逆转录的cDNA为模板，反应体系采用10μL，包含SYBR Green qPCR Master Mix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-free H

2.5数据统计与分析

在Excel 2016软件中，运用2-

3结果与分析

3.1常规PCR扩增结果

利用普通PCR方法进行目的基因片段和内参基因片段进行扩增，并经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。由图1可知，TCONS_00161198引物PCR扩增产物长度与目的片段与预期片段大小相符，电泳条带清晰、无拖尾、拖带现象，cDNA和引物可用作后续实验。

3.2实时荧光定量结果

由图2可知，TCONS_00161198在高背膘厚组中表达显著高于低背膘厚组(P＜0.05)，表达趋势与RNA-seq数据一致。

3.3 LncRNA与背膘厚间的相关性

由表10可知，在高低背膘厚组柯乐猪皮下脂肪组织中TCONS_00161198的表达与背膘厚呈极显著正相关(r＝0.946)，与眼肌面积呈显著负相关(r＝-0.942)；因此选择TCONS_00161198LncRNA进行后续功能验证。表10。

表6 LncRNA与性状指标相关性

5小结

本试验通过对高低背膘厚组皮下脂肪组织进行RT-qPCR，并对LncRNA在皮下脂肪组织中的表达量与生产数据进行相关性分析，发现RT-qPCR的结果与RNA-seq结果一致，表示RNA-seq数据可靠，相关性分析发现TCONS_00161198的表达与背膘厚呈极显著正相关(r＝0.946)，与眼肌面积呈显著负相关(r＝-0.942)。试验认为，TCONS_00161198LncRNA可能对柯乐猪脂肪沉积具有影响作用。

三、LncRNA在脂肪细胞中的功能研究

为鉴定第四章筛选出的LncRNA在脂肪细胞中的生物学功能，本试验对LncRNA进行过表达，构建真核表达载体，用于脂肪前体细胞的转染，并对转染后的细胞进行诱导分化，利用RT-qPCR、油红O染色、萃取及细胞中甘油三酯检测技术分析LncRNA在脂肪细胞中的生物学功能。

1试验材料

1.1细胞

本试验所需皮下脂肪前体细胞由贵州大学高原山地动物遗传育种教育部重点实验室保存。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂

LB液体培养基干粉、NaCl、胰蛋白粉、酵母粉均由贵阳西宝生物科技有限公司代购；T4DNA连接酶自美国Invitrogen公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶XhoI--HindIII聚合酶，重组酶、感受态细胞TOP10、PCR凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒由宏达尔公司代购；PBS、Ⅰ型胶原酶、DMEM/F12培养基、青链霉素、胰岛素、地塞米松、油红O染料、胰蛋白酶、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胎牛血清均由贵阳西宝生物科技有限公司代购。Lipofectamine

1.2.2主要试剂配制

(1)LB液体培养基：以1g LB液体培养基干粉：40mL蒸馏水的比例配制LB液体培养基，高温高压灭菌，冷却至室温后4℃保存。

(2)LB固体培养基：将2g NaCl、2g胰蛋白粉、1g酵母粉和3g琼脂糖溶于200mLddH2O中，高温高压灭菌，无菌条件下冷却至50～60℃，加适量抗生素后倒入灭菌的培养皿中，待凝固用封口膜封口，4℃保存。

(3)0.25％胰酶：100mL PBS中加入0.25g胰酶和100μL双抗，滤膜过滤除菌，分装后-40℃保存。

(4)1％双抗PBS：取5mL双抗加入500mL的PBS中，轻微震荡混匀。

(5)10％完全培养基：500mL DMEM/F12培养基中加入50mL胎牛血清和5mL双抗，轻微震荡混匀。

(6)胰岛素储存液：25mL ddH2O中加入25mg胰岛素和43μL浓盐酸，配制成1mg/mL的储存液，室温放置24h后过滤分装，-80℃保存，使用时与10％完全培养基按1:200稀释。

(7)IBMX储存液：称取50mg IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)粉末溶于4.5mL0.06mol/L的氢氧化钾溶液中，配制成50mM的储存液，过滤分装，-80℃保存，使用时与10％完全培养基按1:100稀释。

(8)DEX储存液：将100mg DEX粉末溶于25.48mL无水乙醇中，配制成10mM的储存液，过滤分装，-80℃保存，使用时与10％完全培养基按1:10 000稀释。

(9)诱导分化培养基：50mL 10％完全培养基中加入5μL DEX储存液、500μL IBMX储存液、250μL胰岛素储存液，混匀后4℃保存。

(10)维持分化培养基：100mL 10％完全培养基中加入500μL胰岛素储存液，混匀后4℃保存。

(11)油红O原液：称取110mg油红O粉末溶于50mL异丙醇中，60℃搅拌过夜，用滤纸过滤后常温保存。

(12)油红O工作液：将油红O原液与ddH

1.2.3主要仪器

Heracell VIOS 160i型二氧化碳培养箱购自德国Thermo公司；T1-DH荧光倒置显微操作系统购自日本Nikon公司；PMT 49984型多功能酶标仪购自美国BioTek公司。其余仪器同第2项。

2试验方法

2.1 LncRNA真核表达载体的构建

2.1.1引物设计及PCR扩增

为确定用于构建载体的序列，利用Primer 5.0软件设计其克隆引物，先以柯乐猪皮下脂肪组织cDNA为模板，以下表7引物信息，通过普通PCR反应，扩增目的序列(反应体系见表8，反应程序见表9)。为探究转染真核表达载体后皮下脂肪前体细胞内脂肪沉积相关酶的表达，利用实时荧光定量PCR方法，反应体系采用10μL，包含SYBR Green qPCR MasterMix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-free H

表7 pEGFP-TCONS_00161198扩增引物

注：引物下划线部分为酶切位点

表8引物PCR反应体系

表9引物PCR反应程序

2.1.2产物纯化及载体连接

(1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；

(2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入1.5mL的离心管中；

(3)向离心管中加入400μL BufferDE-A，将离心管放置于75℃水浴锅中加热，期间不断摇晃，直到凝胶完全融化；

(4)完全融化后向离心管中加入200μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,12 000rpm/min室温离心30s，弃掉离心管中的滤液；

(5)用移液枪向制备管中加入500μL的BufferW1，12000rpm/min室温离心30s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；

(6)向制备管中加入700μL的BufferW2，12 000rpm/min室温离心30s，弃掉滤液，然后再重复一次；

(7)12 000rpm/min离心2min，去掉离心管中的残留液体，室温放置2min；

(8)将制备管放入新的1.5mL离心管中，向制备膜的中间Eluent 30μL(提前放入65℃的水浴锅加热，可增加洗脱效率)，室温静止放置2min，12 000rpm/min离心1min，滤液即为纯化后的产物，将离心管取出，放于-20℃冰箱备用。

(9)载体连接，连接方法如表10：

表10目的片段与载体连接反应体系

以上连接液在52℃恒温环境下连接30min

2.1.3产物转化

(1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1-3ul加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3min；

(2)42℃水浴90s；

(3)冰浴中放置3min左右；

(4)每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡40min。

2.1.4菌液PCR鉴定

(1)制备含相应抗性的琼脂平板；

(2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15min；

(3)倒置平板于37℃培养12-16h可出现菌落；

(4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌14h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3ul，ddH2O 14μL。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。将阳性克隆菌液送测序。测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切。

2.2无内毒素质粒提取

在25mL LB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜。无内毒素质粒提取参照天根的无内毒素质粒提取试剂盒说明书，操作步骤如下：

(1)吸取8mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm/min 4℃离心1min，移去上清，保留沉淀；

(2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1(P1中提前加入RNase A)，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；

(3)向离心管中加入500μL溶液P2，缓慢地上下颠倒10s，使菌体基本裂解；

(4)加入700μL溶液P3，立刻缓慢地上下翻转10s，充分混匀(会产生白色絮状沉淀)，12000rpm/min 4℃离心10min；

(5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，12000rpm/min 4℃离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

(6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW(漂洗液PW需提前加入无水乙醇)，12000rpm/min 4℃离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；

(7)将步骤(6)重复操作一次；

(8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心2min；

(9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置5min，再12000rpm/min 4℃离心2min；

(10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度。

2.3猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存

2.3.1细胞复苏

(1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；

(2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，1000rpm/min离心10min；

(3)弃培养基上清，留细胞沉淀，加入适量10％完全培养基吹打成细胞悬液，将离心管中悬液转移至细胞培养瓶中，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养。

2.3.2细胞传代

(1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

(2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL 10％细胞完全培养基终止消化；

(3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养。

2.3.3细胞冻存

(1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗3次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；

(2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL 10％细胞完全培养基终止消化；

(3)将培养瓶中悬液移至离心管中，1 500rpm/min离心10min，移弃培养基上清；

(4)在上述离心管中加入100μL DMSO和900μL胎牛血清，吹打制成细胞悬液。

(5)将细胞悬液转移至1.5mL的细胞冻存管中，梯度温度冻存，先4℃保存2h，再移至-20℃保存2h，最后置于液氮或-80℃冰箱保存。

2.4细胞转染及诱导分化

2.4.1细胞转染

以6孔板为例，将细胞悬液接种于6孔板中，当细胞完全汇合2d后根据Lipofectamin e

(1)6孔板中每孔转染试剂配制：

试剂A：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

试剂B：在无酶PCR管中加入125μL DMEM

(2)将试剂B加入A中，室温孵育20min，形成DNA-脂质体复合物。

(3)移弃6孔板中培养基，用无双抗PBS清洗2次，将上述混合试剂加入6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养。

2.4.2诱导分化

将转染后的细胞悬液接种于6孔板中，细胞完全汇合2d后将培养基更换为诱导分化培养基，并记为0d，更换培养基前先用含双抗的PBS清洗小心清洗细胞2次，诱导至2d后将培养基更换为维持分化培养基，每2d更换一次培养基。

2.5细胞总RNA的提取及cDNA的合成

2.5.1)分别提取转染36h后的细胞RNA，移弃培养板中的培养基，用PBS清洗3次，加入1mL Trizol，室温静置5min，充分裂解细胞，再将培养板中的混液移至离心管中；

S2.5.2)加入0.2mL氯仿，混匀，静置5min，4℃离心15min；

S2.5.3)将上清液转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，静置10min，4℃离心15min；

S2.5.4)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入75％乙醇，混合均匀，4℃离心5min；

S2.5.5)将步骤S5)重复一次；

S2.5.6)移去上清液后静置3分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-80℃保存；

S2.5.7)RNA完整性检测：将5μL RNA与1μL RNA Loading buffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V 5min后紫外凝胶成像系统观察拍照；

S2.5.8)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存；

S2.5.9)cDNA的合成：对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5。

2.6实时荧光定量PCR反应

样品为猪皮下脂肪前体细胞，使用CFX96实时定量PCR仪对基因表达量进行定量分析，以GAPDH基因作为内参，对单个样品设置3个重复,实时荧光定量体系采用10μL，包含SYBR Green qPCR Master Mix 5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-free H

2.7油红O染色、萃取及甘油三酯的检测

诱导分化第8d时进行以下操作：

(1)用PBS将需要染色的细胞清洗3次，再用4％多聚甲醛固定20～30min。

(2)弃多聚甲醛并用PBS清洗3次，加入现配且已过滤除菌的油红O工作液，染色试剂加入量以刚好能覆盖细胞培养板底部为最佳，染色30min。

(3)移弃油红O工作液，用PBS清洗3次，显微镜下拍照。

(4)往各孔细胞中加入等量异丙醇，置入37℃恒温摇床，100rpm/min，20min后用酶标仪检测510mm波长的吸光值。

2.8数据统计与分析

用Excel 2016统计数据，运用2

3结果与分析

3.1常规pcr扩增结果

利用普通PCR方法进行目的基因片段和内参基因片段进行扩增，并经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。由图3可知，PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH、MOGAT2和CSF3R引物PCR扩增产物长度与目的片段与预期片段大小相符，电泳条带清晰、无拖尾、拖带现象，cDNA和引物可用作后续实验。

3.2 pEGFP-TCONS_00161198重组质粒鉴定

为探究TCONS_00161198LncRNA功能。根据TCONS_00161198全序列设计特异性克隆引物，以柯乐猪皮下脂肪组织的cDNA为模板对TCONS_00161198和进行PCR扩增，将PCR扩增的得到的目的基因构建到pEGFP-N3载体，提取质粒，质粒用HindIII-XhoI酶切，pEGFP-TCONS_00161198获得的条带约810bp/4720bp与预期810bp/4720bp的大小一致；结果成功扩增出与预期大小相符的单一条带(图4)。进一步进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌液提取质粒，送公司测序。测序结果显示，TCONS_00161198与RNA-seq中的序列完全一致。

3.3真核表达载体转染猪皮下脂肪前体细胞

为探究将LncRNA过表达后对猪皮下脂肪前体细胞脂肪沉积的影响，将pEGFP-TCONS_00161198和pEGFP-N3瞬时转染后，36h后观察细胞转染情况。结果发现，利用荧光倒置显微镜使用红色激发光照射细胞后，除空白对照组外转染组均发出绿色荧光，且较多呈条状，说明pEGFP-TCONS_00161198、和pEGFP-N3已成功转染至猪皮下脂肪前体细胞且可以正常表达。见图5。

3.4 pEGFP-TCONS_00161198对脂肪沉积相关基因mRNA表达量的影响

为探究TCONS_00161198在猪皮下脂肪前体细胞中对脂肪沉积相关基因在转录水平的影响，转染重组质粒36h后，RT-qPCR检测LncRNA及其靶基因、脂肪沉积相关基因的表达量。结果表明：TCONS_00161198及其靶基因CSF3R、PPARγ和ACC表达量显著高于对照组(P＜0.05)，LPL表达量高于对照组，但是不显著(P＞0.05)；ATGL表达量低于于对照组，但是不显著(P＞0.05)。见图6。

3.5油红O染色、萃取结果及甘油三酯含量检测

为探究重组质粒pEGFP-TCONS_00161198转染细胞后的脂肪沉积水平，转染重组质粒后，将转染后的细胞培养基更换为诱导分化培养基，诱导培养2d时开始出现椭圆形细胞；4d时椭圆形细胞增多，且脂滴开始出现；诱导培养6d后细胞脂滴增多；诱导培养8d d后进行油红O染色、萃取，并进行甘油三酯检测。结果显示：pEGFP-TCONS_00161198转染组的OD510吸光值显著高于对照组，pEGFP-TCONS_00161198转染组的甘油三酯含量极显著高于对照组(P＜0.01)；见图7、图8。

4、SEQ ID.1：

LncRNA名称：TCONS_00161198

序列长度：804bp

LncRNA序列：

GAAGAGGAGAGCAGAGACCAGCGAGGCCAGGCAGGCGCCCAGCCGGCCAGCCGCAGGCTCCAGCATGGGCACACTGAGGCTCAGAAAGGCGAAGTAACTTGTTCAAGACCACCAAGCTGGTGAGCATCAAGCCGGCACTATGGTGGCGGGGCTGGGAGCCTGGAGCCTGGCGGGAGCTGTTCTGATCATCCTGCTGCTCCCCAGAAGACTATCAGAAGGAATCCCTGAGACGTGCAACCTTTATGGGCAGCAAAGAGATCCGGATGGAAGCCACAGGGAGGGCCTCAGCATTCCCAGCAGCAAAATGGGCTGAAGAACAGCTGGGAAAGGAGAGACGGCATCGTGAGCAAACTGCAGAGCTTACTTGTTTATTCCACACATAGCCACCCTGCTCCGTGCTAGGCGCTGGCTATGCAGACCGTAGATTCTCTGGCCTCACAGAATCTACGGTCTAGCTGTGGTGGGGACAGACAAGCGAATAACCACATGACTGGAAAATCATGAAGGAGAATAAGAGCTTTAGAAAAGTTCAGGAGGGAGTTCCCATTGGGGCTCAGCGGGTTACAAACCCAACTAGTTATCCATGAGGATGCAGGTTCAGTCCCTGGCCTTGCTCACTGGGTTAAGGATCCGGCGCTGCCATGAGCTGTGGTGTAGGTTGCAGATGCAGCTCGGATCCTGAGTTGCTATGGCTGTGGCATAGCCCGGCAGCTCCAGCTTCCATTGAACCCCTAGCCTGGGAAATTCCATTTGCTGCAGGTGTGGCCCTAAAAGGCAAAAAATAAAAATAAAGGAAAAGTTCAG

序列表

<110> 贵州省畜牧兽医研究所

<120> 一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA应用、挖掘及鉴定方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 804

<212> DNA

<213> LncRNA TCONS_00161198(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagaggaga gcagagacca gcgaggccag gcaggcgccc agccggccag ccgcaggctc 60

cagcatgggc acactgaggc tcagaaaggc gaagtaactt gttcaagacc accaagctgg 120

tgagcatcaa gccggcacta tggtggcggg gctgggagcc tggagcctgg cgggagctgt 180

tctgatcatc ctgctgctcc ccagaagact atcagaagga atccctgaga cgtgcaacct 240

ttatgggcag caaagagatc cggatggaag ccacagggag ggcctcagca ttcccagcag 300

caaaatgggc tgaagaacag ctgggaaagg agagacggca tcgtgagcaa actgcagagc 360

ttacttgttt attccacaca tagccaccct gctccgtgct aggcgctggc tatgcagacc 420

gtagattctc tggcctcaca gaatctacgg tctagctgtg gtggggacag acaagcgaat 480

aaccacatga ctggaaaatc atgaaggaga ataagagctt tagaaaagtt caggagggag 540

ttcccattgg ggctcagcgg gttacaaacc caactagtta tccatgagga tgcaggttca 600

gtccctggcc ttgctcactg ggttaaggat ccggcgctgc catgagctgt ggtgtaggtt 660

gcagatgcag ctcggatcct gagttgctat ggctgtggca tagcccggca gctccagctt 720

ccattgaacc cctagcctgg gaaattccat ttgctgcagg tgtggcccta aaaggcaaaa 780

aataaaaata aaggaaaagt tcag 804

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> TCONS_00161198 F序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggacagaca agcgaataac c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> TCONS_00161198 R序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacagccata gcaactcagg at 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH F序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgaaggtc ggagtgaacg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH R序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgggtgga atcatactgg a 21

<210> 6

<211> 70

<212> DNA

<213> pEGFP -TCONS_00161198 F序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagatccgct agcgctaccg gactcagatc tcgaggaaga ggagagcaga gaccagcgag 60

gccaggcagg 70

<210> 7

<211> 70

<212> DNA

<213> pEGFP -TCONS_00161198 R序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccgcggtac cgtcgactgc agaattcgaa gcttctgaac ttttccttta tttttatttt 60

ttgcctttta 70

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> PPARγ F序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctccaagaat accaaagtgc ga 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> PPARγ R序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccacagactc ggcactcaat 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> LPL F序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcaacaagg tcagagccaa ga 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> LPL R序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgccatcctc agtcccagaa 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> ACC F序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtccacatga acaggcttcc a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> ACC R序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccagtccgat tcttgctcca c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> ATGL F序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catccgtggc tgcctggtga a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> ATGL R序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctggcggcg aagtgggtta t 21

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> MOGAT2 F序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaccgcaagg gcttcgtc 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> MOGAT2 R序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccaggagcca ggtaagttct c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> CSF3R F序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cactacctcc gctgcgactc 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> CSF3R R序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttgggactaa gggttctgg 19

完整全部详细技术资料下载

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：张雄;史开志;王婧;张静;杜春林;赵春萍;
专利申请人：贵州省畜牧兽医研究所;

上一篇：一种具有状态监测功能的智能轴承
下一篇：基于SACNN的雷达辐射源信号识别方法