紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

红曲菌是一种嗜酸性丝状腐生真菌，在许多亚洲国家特别是东亚地区作为传统食品加工的微生物。它的次级代谢产物主要包括MonacolinK、红曲色素、桔霉素、麦角固醇、γ-氨基丁酸等。Monacolin K是红曲菌产生的一种聚酮类次级代谢产物，具有降血压的功效，可以治疗心血管疾病且疗效显著。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法。

本发明通过研究发现，紫色红曲菌中comp52324_c4基因可以抑制和降低紫色红曲菌的 monacolin K产量。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

利用基因过表达技术对comp52324_c4基因进行过表达，通过电击转化方式将重组质粒导入红曲菌原生质体，并成功筛选出重组菌株。

comp52324_c4基因序列如下：

GAGTCGCTGGAGGGGTAATTTCCATCGGAGGACGAGGCAGTTGACCAGGGCTGCCTGTACTCGGAGTAAGTAGAGA TAAGTGAATCGGTGGCTGTCTCACAGCCATGACTCGGGAGCGCACGCAGAGGTGCGGTTCTTGCAGCAGGAATGAGAATT CTTGATTCTTGAGAGCAGTAGGGTATTCGCAAAAAAGACGGGATCGTAGACTCTTTTCAGGTCGAGAAGCGCAGCGATAA GGACTTTTGCCACGCGAAGGTTCTTCTAAGAGGTACCGGAAATGGTCAGAATTCAGCCAATCGAGGCTGGAGAAGCATAG TAGTCAATGCTGTATATATGACGACACGAAGGAGCGTTGGAAATAGAAGTATCATCGACTAGAGAACCGTGGTCGAAGAG AAACGAATGTTGCGGAAGTCTGGATGAAAAATCACAGCAGAGGGACAGAGATAGATAGAAGACGTGCGGGACGATAAAAG CAGCAGCGTCGAAGACATGGCGAAGGGAAGATAGATGAACAGCGTCGGATAAAGCACAGAAGAAAGAGAAGAAGCTGAAG GAAGGCGAAAAAGAAACGGCGACGCGAGGAAAAGGAAAAGCAACCGGCGATGACTTCATCCTGCATCCGTTTTTGGCAAT GCAGCAACTCTAACCAACTCCTTCTCTTGCCTTCTCTTTCTCTTCTCCTCCTCTTTCTCTATCTTCGTCTCTTCGCACTG ATTGACTTCACAATGGCAGCTGCAACGGGCATTTCCTCTCATTTTCCCCTTCCTCCTCCCCTTCAGCCCTTCTCTTCTTC CTCTTCCTCCGCTTCATCTTGACTCGCCGGTCTTTCGTTTGATTATTCGCTCGTTATTTTGATCAGCCCATTCGTTTGGC CCTTCAGGCGCTGTCTTATCCTTGTATGCCATATTTCAGCAATCCTACATACCCGTATCCT

本发明还提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

(1)菌株培养

由北京工商大学食品添加剂工程技术中心保存的紫色红曲菌M1(菌种号：CGMCC.30568)，将M1菌株在固体培养基(g/L)上活化2代，取菌液接种到种子培养基(g/L)中，30℃、200r/min 培养2d，按10％的接种量将种子液接种到发酵养基(g/L)中，30℃、150r/min培养2d，再25℃、150r/min培养13d。

(2)comp52324_c4基因过表达菌株的构建

设计引物序列如下：

C4-F：GAGTCGCTGGAGGGGTAATTTC；

C4-R：AGGATACGGGTATGTAGGATTG。

利用上述引物进行comp52324_c4目的基因扩增，

以pBARGPE-Hygro(武汉淼灵生物公司)为过表达载体，通过DNAman软件选出该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp52324_c4目的基因进行连接，构建过表达 pBARGPE-Hygro-c4重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并进行重组质粒的提取和验证。

(3)过表达质粒转化

将红曲霉M1接种于PDA培养基平板上，在30℃恒温培养箱中培养4d。在每个培养皿中加入10ml灭菌水，用接种环轻轻刮擦细菌表面以释放孢子，制备孢子悬浮液。将孢子悬液(200μL)涂在置于PDA板上的灭菌玻璃纸盘上，涂布至干燥，在30℃下培养30-40h。将生长在玻璃纸盘上的淡粉色菌丝体用接种环刮除，置于单层mira布上，过滤并用50ml硫酸镁溶液洗涤。过滤灭菌后的菌丝体转移到50ml的溶解酶溶液中，在30℃和60rpm下消化2.5-3 h，然后通过单层mira布再次过滤。滤液在4℃下以7000转/分离心5分钟，并丢弃上清液。然后用1.2mol L-1山梨醇溶液过滤样品两次(随后离心，并去除上清液)。原生质体在山梨醇溶液中重新悬浮，并保存在冰上以备将来使用。将红曲霉M1活性细胞悬液(100μL)涂在 PDA平板上。采用电击转化法，将成功构建的高表达质粒导入红曲原生质体中，根据潮霉素B 浓度筛选结果筛选转化子。

(4)过表达菌株的筛选和验证

将在潮霉素B抗性平板上筛选得到的阳性红曲菌转化子连续传5代，旨在筛选稳定遗传的转化子。对红曲菌阳性转化子中的Monacolin K产量进行检测，初步证明过表达菌株构建成功。利用阳性转化子的RNA，将其反转录为cDNA为模板，用Hygro-F、Hygro-R引物来扩增潮霉素基因。如果目的菌株能扩增出潮霉素基因，而对照菌株未能扩增出潮霉素基因，则证明过表达质粒在红曲菌中表达，进而证明过表达菌株构建成功。

Hygro-F、Hygro-R引物如下：

Hygro-F：ATGAAAAAGCCTGAACTC；

Hygro-R：TCTTTGCCCTCGGACG。

在申请人前期的研究中，实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析，发现comp52324_c4基因对降低红曲菌Monacolin K产量具有明显作用。

本发明的有益效果：

本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp52324_c4基因，验证其存在，并成功构建了过表达质粒pBARGPE-Hygro-c4，导入红曲菌M1菌株中，成功构建了过表达工程菌株。结果显示，与野生型M1相比，过表达comp52324_c4菌株第15天monacolin K产量降低了36.66％。

附图说明

图1是过表达comp52324_c4菌株和野生型M1的monacolin K产量比较。

图2是重组质粒电泳图谱。

图3.潮霉素B对紫色红曲菌M1耐受浓度的筛选。

图4过表达菌株Monacolin K及其生物量的检测。

图5过表达菌株和M1菌株产色素检测。

图6过表达菌株和M1菌株在不同放大倍数下的扫描电镜照片。

图7-图15分别是mok A,mok B,mok C,mok D,mok E,mok F，mok G，mok H,mok I基因表达量变化。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株，该菌株可以显著降低红曲 monacolin K产量。结果见图1，与野生型M1相比，过表达comp52324_c4菌株第15天monacolin K产量降低了36.66％。

实施例2

本实施例具体提供一种紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法，并按照下列实验方法进行。

具体过程和步骤如下：

2.1 菌株及培养条件

由北京工商大学食品添加剂工程技术中心保存的紫色红曲菌M1(菌种号：CGMCC.3.0568)，将M1菌株在固体培养基(g/L)(葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母浸粉4g，麦芽浸粉20g，琼脂20g，KH

2.2 comp52338基因过表达菌株的构建

根据已获得的红曲菌中comp52324_c4的基因序列设计引物，利用Primer Premier5.0 软件，设计引物(表1)。

本实验以pBARGPE-Hygro(武汉淼灵生物公司)为过表达载体，通过DNAman软件选出该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp52324_c4目的基因进行连接，构建过表达pBARGPE-Hygro-c4重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并进行重组质粒的提取和验证。

2.3 过表达质粒转化

将红曲霉M1接种于PDA培养基平板上，在30℃恒温培养箱中培养4d。在每个培养皿中加入10ml灭菌水，用接种环轻轻刮擦细菌表面以释放孢子，制备孢子悬浮液。将孢子悬液(200μL)涂在置于PDA板上的灭菌玻璃纸盘上，涂布至干燥，在30℃下培养30-40h。将生长在玻璃纸盘上的淡粉色菌丝体用接种环刮除，置于单层mira布上，过滤并用50ml硫酸镁溶液洗涤。过滤灭菌后的菌丝体转移到50ml的溶解酶溶液中，在30℃和60rpm下消化2.5-3 h，然后通过单层mira布再次过滤。滤液在4℃下以7000转/分离心5分钟，并丢弃上清液。然后用1.2mol L-1山梨醇溶液过滤样品两次(随后离心，并去除上清液)。原生质体在山梨醇溶液中重新悬浮，并保存在冰上以备将来使用。将红曲霉M1活性细胞悬液(100μL)涂在 PDA平板上。采用电击转化法，将成功构建的高表达质粒导入红曲原生质体中，根据潮霉素B 浓度筛选结果筛选转化子。

2.4 过表达菌株的筛选和验证

将在潮霉素B抗性平板上筛选得到的阳性红曲菌转化子连续传5代，旨在筛选稳定遗传的转化子。对红曲菌阳性转化子中的Monacolin K产量进行检测，初步证明过表达菌株构建成功。利用阳性转化子的RNA，将其反转录为cDNA为模板，用Hygro-F、Hygro-R引物来扩增潮霉素基因。如果目的菌株能扩增出潮霉素基因，而对照菌株未能扩增出潮霉素基因，则证明过表达质粒在红曲菌中表达，进而证明过表达菌株构建成功。

2.5 色价检测

发酵液的预处理：取发酵液5mL，加入15mL 70％的乙醇溶液，于恒温水浴锅60℃浸提1h，静置。用分光光度计测定410、448、505nm处吸光值。利用公式：红曲色素色价(U/mL)＝吸光值×稀释倍数，计算得出。

2.6 干重测定

采用干重法测菌丝体生物量。取5mL发酵液用3层纱布过滤，再用蒸馏水洗涤2-3次，拧干水分，在60℃烘箱中烘干至恒重，即为菌丝体干重。

2.7 扫描电镜处理

培养8d的红曲菌菌体，12000r/min离心5min收集菌体细胞，将细胞重悬(用枪头吹打，吹打时注意不要将细胞吸入枪头造成细胞损失)于2.5％戊二醛溶液(PBS缓冲溶液稀释)固定12h。用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)漂洗细胞两次(两次重悬离心)弃去上清液。依次用不同浓度的乙醇溶液(30％，50％，70％，80％，90％，100％)对细胞进行脱水，每种浓度静置10min，12000r/min离心5min(每种浓度重复两次)，弃去上清液。先把菌体重悬于醋酸异戊酯与乙醇(v：v＝1:1)中，再重悬与醋酸异戊酯溶液中，以对细胞进行乙醇置换。将细胞重悬于每种溶剂中静置10min，12000r/min离心5min，弃去上清液。加入溶剂六甲基二硅胺(Hexamethyl Disilazane，HMDS)，用量没过样品即可，用脱脂棉将离心管口塞上，置于60℃烘箱干燥直至样品成粉末状，留待观察。

2.8 Monacolin K合成相关基因的转录量分析

1.菌体的收集及处理

分别取不同培养天数的红曲菌发酵液置于2mL离心管中，用无菌水洗涤离心直至上清液不再呈红色，吸除离心管中残余水分。首先进行红曲菌RNA的提取，再将其反转录成cDNA以用于荧光定量分析。

2.引物的设计与合成

用Olige7.37软件，根据NCBI网站公开的红曲菌合成Monacolin K关键基因组序列，选取 mok A、mok B、mok C、mok D、mok E、mok F、mok G、mok H、mok I九段基因组、内参基因 GAPDH以及c3基因序列，表1为设计得到的RT-qPCR的引物序列，由华大基因科技有限公司制备合成。

表1关键基因的引物序列

1.荧光定量分析

根据天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBRGreen) 试剂盒说明书设计反应体系并进行扩增。操作方法如下：

(1)RT-qPCR反应体系：

本研究反应体系如下表2所示。

表2荧光定量PCR反应体系

(2)RT-qPCR反应条件：

1)95℃ for 15min；

2)95℃ for 10sec；

3)52℃ for 20sec；

4)72℃ for 30sec；

5)GOTO2，40more times；

6)Melt Curve 65℃ to 95℃:Increment 0.5℃ 5sec；

(3)提前设置好反应程序，荧光定量PCR仪中放入样品，开始反应。

3结果

3.1 重组质粒的验证

为了验证重组质粒是否构建成功，首先进行双酶切验证，并以原质粒做对照。对重组质粒 pBARGPE1-Hygro-c4进行双酶切后，得到两段大小分别在6000bp左右和900bp左右的清晰条带，与目标条带大小一致。(图2b)再对重组质粒pBARGPE1-Hygro-c4进行电泳验证，发现长度在6900bp左右，均符合目的基因片段与原质粒长度之和。(图2d)

3.2 过表达菌株潮霉素基因的PCR验证

通过HPLC初步筛选出高产Monacolin K的转化子后，对c4-9菌株进行潮霉素基因的PCR 验证。分别提取红曲菌M1菌株和c4-9菌株的RNA，再将其反转录成cDNA。以cDNA为模板， Hygro-F和Hygro-R为引物进行扩增潮霉素基因。结果显示，对照菌株红曲菌M1菌株未能扩增出明显条带，而c4-9菌株能扩增出1000bp左右条带，与预期结果一致。证明c4-9过表达菌株构建成功。(图2f)

3.3 重组质粒转化子的筛选

选取100μL红曲菌孢子悬液分别涂布于不同浓度梯度的潮霉素B抗性平板上。潮霉素浓度增长的同时，M1菌株的菌落数减少，最终选择潮霉素B的最佳筛选抑制浓度为10 μg/mL。在随后的过表达质粒的转化子的筛选过程中，实验发现当潮霉素B浓度为10μg/mL 时，加入质粒的红曲菌菌株有菌落生长，而未加入质粒的红曲菌M1菌株则无菌落生长。因此，挑取潮霉素B浓度为10μg/mL抗性板上的菌落，从而成功获得具有潮霉素B抗性的转化子。 (图3)将分别获得的11株转化子在具有潮霉素B抗性的平板上传5代，再进行发酵培养。将c4的11株转化子与M1进行发酵培养后，取菌液处理，利用HPLC测定monacolin K产量。结果发现在c4的11株菌株中，第9株(编号为c4-9)产量最低，达到51mg/L(图4b)。因此实验选择c4-9分别作为目标菌株。

3.4 生物量

通过比较c4-9和M1菌株在不同发酵天数下菌丝干重的差异，研究了comp52324_c4基因过表达对红曲霉菌丝生长的影响。结果显示c4-9和M1菌株的菌丝体生长趋势相似，差异不显著。

(图4d)

3.5 过表达菌株红曲色素产量检测

通过紫外分光光度计分别检测2，5，8，12，15d的c4-9菌株和M1菌株的红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素。

三种色素的产量变化总体呈现上升趋势，在第15d时产量达到最高。c4-9和M1菌株对比，三种色素在第15d时产量达到最高，在第15d时，c4-9菌株三种色素产量与M1相比分别提高了16％，19.76％，23.05％。(图5)

3.6 过表达菌株微观菌体形态的检测

扫描电镜观察c4-9和M1菌株菌丝体的形态差异。对比相同倍数下的C4-9菌株和M1菌株的菌丝体，发现在凹陷程度和颗粒数上没有显著变化，但c4-9菌株的褶皱程度比M1菌株更多(图6b)

3.7 Monacolin K生物合成基因转录水平检测

利用RT-qPCR技术检测过表达菌株c4-9和野生型菌株中Monacolin K生物合成基因簇上mok A-mok I九段基因的表达量。结果如图7-15所示，mok A基因的表达量在发酵第12天较 M1菌株下降了71.24％，在第15天下降了94.14％。在发酵第12天，c4-9菌株的大多数基因的表达量较M1菌株下调，包括mok A,mok B,mok C,mok D,mok E,mok F，mok G，mokH, mok I基因等，其中mok C基因表达量下降了86.26％。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 紫色红曲菌comp52324_c4基因过表达菌株的构建方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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