一种营养乳剂和菌剂联用在制备海洋浮油污染生物修复材料中的应用
文献发布时间:2023-06-19 11:59:12
技术领域
本发明属于石油污染环境治理技术领域,具体涉及一种营养乳剂和菌剂联用在制备海洋浮油污染生物修复材料中的应用。
背景技术
随着石油工业的迅速发展,石油对环境的破坏也越来越引起人们的重视。尤其对于海洋环境,层出不穷的各类石油泄漏事故对海洋的生态系统造成了严重危害,制约人类社会和环境的可持续发展。石油污染的生物修复技术被认为是石油污染治理最为有效的途径之一,具有高效、经济和无二次污染等优点,其应用前景看好,正受到世界各国的普遍重视,相关研究也十分活跃。生物修复过程一般包括生物促进和生物强化两种途径。生物强化是指通过添加能够降解石油的微生物;生物促进是指通过添加N、P等营养刺激污染环境中的土著石油降解菌的生长以达到降解石油污染物的目的。由于单独使用生物强化和生物促进通常存在各自的局限性,所以两者联合使用往往能取得更好的修复效果,这也是生物修复的发展趋势。
海洋环境中N、P等营养物质的缺乏、石油烃的生物可利用性差及接种至海洋环境中的石油降解菌容易流失和存活时间短是影响海洋石油污染生物修复有效性的三个主要因素。在石油污染的自然条件下,接种的石油降解菌面临与土著微生物的竞争作用,需要适应新的生长环境及经受环境污染物的毒性影响等环境压力,导致添加的石油降解菌容易流失和存活时间短,所以防止接种的石油降解菌的轻易流失和使其长期保持足够活性是生物强化修复有效性的关键。利用载体将石油降解菌固定化后接种到自然环境是解决上述问题的一种有效手段。载体材料能够通过为微生物提供保护性的表面和空隙等,形成微小的生物反应器,从而有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害等,克服环境压力,使其能够长期保持活性,在复杂环境中发挥高效性能。近年来,微生物固定化技术迅速成为生物、环境等领域的一个研究热点。由于石油烃的水溶性差,石油污染物往往漂浮于水面,而水体中的微生物对石油烃的降解需要胞内的各种酶的参与,所以石油烃从油相到胞内的缓慢传质过程是石油烃微生物降解的瓶颈之一。应用于水体石油污染生物修复的固定化载体应具有漂浮性,以增加石油降解菌与石油污染物的接触,减少石油烃从油相到胞内传质距离,同时固定化载体应具有可生物降解、无毒性或抑制性及原料来源广泛,价格低廉等特点。
在石油污染的海洋环境中,由于石油中含有微生物能利用的大量碳源,但是N、P等营养的缺乏往往是影响细菌生长繁殖的主要原因,实验室和现场的研究均表明添加N、P等营养能有效促进石油的生物降解。海洋环境中N、P的添加是一大难题,添加水溶性的一些营养盐往往容易被周围水体迅速稀释,如何制备一种试剂可在油水交界面提供N、P等营养物质供石油降解微生物生长繁殖,是提高生物修复效果的关键。
发明内容
本发明目的在于提供一种营养乳剂和菌剂联用在制备海洋浮油污染生物修复材料中的应用。
本发明另一个目的在于提供一种提高海洋浮油污染生物修复效果的方法,该方法包括制备的营养乳剂和菌剂,菌剂可漂浮于水面,增加石油降解菌与石油污染物的接触,减少石油烃从油相到胞内传质距离,同时可减少石油降解菌的流失和增加存活时间短,而营养乳剂可在油水界面提供石油降解菌繁殖所需的N、P等营养物质,将两者同时应用可提高海洋浮油污染的生物修复效果。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明的第一方面提供了一种营养乳剂和菌剂联用在制备海洋浮油污染生物修复材料中的应用,所述营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1%~3%、无水乙醇20%~35%、油酸6%~23%、尿素水溶液39%~68%;所述菌剂是由海洋石油降解菌和固定化载体制成,所述海洋石油降解菌选自假单胞菌属、弧菌、不动杆菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、肠杆菌科、棒杆菌属、节杆菌属、芽抱杆菌属、葡萄球菌属、微球菌属、乳杆菌属、诺卡氏菌属、假丝酵母属、红酵母菌属、毕赤氏酵母菌属、戈登氏菌属中的至少一种;所述固定化载体是可形成多孔结构且可降解和漂浮于水面的材料;
所述营养乳剂和菌剂的质量比为(0.2~5):1,优选为(0.95~4.75):1,更优选为0.95:1、1.9:1、2.85:1、3.8:1、2.4:1、4.75:1。
所述营养乳剂与海洋浮油的体积比为(1~3):1,优选为1.6:1。
所述海洋浮油可以是原油、柴油、汽油、机油等。
所述菌剂载菌量高于10
所述营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.5%~3%、无水乙醇25%~35%、油酸15%~22%、尿素水溶液40%~50%。
最优选的,所述营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.7%、无水乙醇32.8%、油酸20.7%、尿素水溶液44.8%。
所述营养乳剂的制备方法包括如下步骤:将大豆卵磷脂、无水乙醇、油酸及尿素水溶液混合,高速搅拌混合均匀,形成水包油型乳剂,获得所述营养乳剂。
所述尿素水溶液的浓度为0.3~0.5g/ml,优选为0.4g/ml。
所述菌剂的制备方法包括如下步骤:
将载体材料加入浓度为3%的海藻酸钠溶液中,载体材料与海藻酸钠溶液的体积比为1:2~2:1,搅拌均匀,将上述包裹有海藻酸钠的载体材料滴入含有浓度为0.5%的壳聚糖和2%的CaCl
将上述固定化载体加入海洋石油降解菌的菌液中,固定化载体与海洋石油降解菌液的体积比为1:1,培养进行菌体固定化,取出作为湿菌剂;
将上述湿菌剂置于保护剂中,保护剂完全浸没湿菌剂,在温度为-70℃的条件下预冻,在冻干机中冷冻干燥(温度为-45℃,时间为1~72h),4℃保藏,获得所述菌剂。
所述载体材料选自膨化的大黄米或小黄米、木质纤维、玉米芯、麦麸、经过前处理的壳聚糖中的至少一种。
所述经过前处理的壳聚糖的制备:将体积比为1:1的浓度为3%的壳聚糖醋酸溶液滴入至浓度为2mol/L的NaOH溶液中,固化5min,将固化小球取出后,用纯水冲洗至中性,获得所述经过前处理的壳聚糖。
所述培养进行菌体固定化是在摇床中30℃,120rpm培养约4h。
所述保护剂为甘露醇(浓度为1%)。
所述海洋石油降解菌的菌液的制备:分别将海洋石油降解菌中的几种活化后接种至LB液体培养基中,在摇床中30℃,180rpm培养约12h,当菌液OD
所述海洋石油降解菌为Acinetobacter sp.Y9、W3、F9、Gordonia sp.X1。
本发明的第二方面提供了一种提高海洋浮油污染生物修复效果的方法,在海洋浮油处,加入营养乳剂和菌剂,所述营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1%~3%、无水乙醇20%~35%、油酸6%~23%、尿素水溶液39%~68%;所述菌剂是由海洋石油降解菌和固定化载体制成,所述海洋石油降解菌选自假单胞菌属、弧菌、不动杆菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、肠杆菌科、棒杆菌属、节杆菌属、芽抱杆菌属、葡萄球菌属、微球菌属、乳杆菌属、诺卡氏菌属、假丝酵母属、红酵母菌属、毕赤氏酵母菌属、戈登氏菌属中的至少一种;所述固定化载体是可形成多孔结构且可降解和漂浮于水面的材料;
所述营养乳剂和菌剂的质量比为(0.2~5):1,优选为(0.95~4.75):1,更优选为0.95:1、1.9:1、2.85:1、3.8:1、2.4:1、4.75:1。
所述营养乳剂与海洋浮油的体积比为(1~3):1,优选为1.6:1。
所述海洋浮油可以是原油、柴油、汽油、机油等。
所述菌剂载菌量高于10
所述营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.5%~3%、无水乙醇25%~35%、油酸15%~22%、尿素水溶液40%~50%。
最优选的,所述营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.7%、无水乙醇32.8%、油酸20.7%、尿素水溶液44.8%。
所述营养乳剂的制备方法包括如下步骤:将大豆卵磷脂、无水乙醇、油酸及尿素水溶液混合,高速搅拌混合均匀,形成水包油型乳剂,获得所述营养乳剂。
所述尿素水溶液的浓度为0.3~0.5g/ml,优选为0.4g/ml。
所述菌剂的制备方法包括如下步骤:
将载体材料加入浓度为3%的海藻酸钠溶液中,载体材料与海藻酸钠溶液的体积比为1:2~2:1,搅拌均匀,将上述包裹有海藻酸钠的载体材料滴入含有浓度为0.5%的壳聚糖和2%的CaCl
将上述固定化载体加入海洋石油降解菌的菌液中,固定化载体与海洋石油降解菌液的体积比为1:1,培养进行菌体固定化,取出作为湿菌剂;
将上述湿菌剂置于保护剂中,保护剂完全浸没湿菌剂,在温度为-70℃的条件下预冻,在冻干机中冷冻干燥(温度为-45℃,时间为1~72h),4℃保藏,获得所述菌剂。
所述载体材料选自膨化的大黄米或小黄米、木质纤维、玉米芯、麦麸、经过前处理的壳聚糖中的至少一种。
所述经过前处理的壳聚糖的制备:将体积比为1:1的浓度为3%的壳聚糖醋酸溶液滴入至浓度为2mol/L的NaOH溶液中,固化5min,将固化小球取出后,用纯水冲洗至中性,获得所述经过前处理的壳聚糖。
所述培养进行菌体固定化是在摇床中30℃,120rpm培养约4h。
所述保护剂为甘露醇(浓度为1%)。
所述海洋石油降解菌的菌液的制备:分别将海洋石油降解菌中的几种活化后接种至LB液体培养基中,在摇床中30℃,180rpm培养约12h,当菌液OD
所述海洋石油降解菌为Acinetobacter sp.Y9、W3、F9、Gordonia sp.X1。
菌剂可漂浮于水面,增加石油降解菌与石油污染物的接触,减少石油烃从油相到胞内传质距离,同时可减少石油降解菌的流失和增加存活时间,而营养乳剂可在油水界面提供石油降解菌繁殖所需的N、P等营养物质,将两者同时应用可提高海洋浮油的污染的生物修复效果。
由于采用上述技术方案,本发明具有以下优点和有益效果:
本发明通过将石油降解菌繁殖所需的N、P等营养物质制备成乳剂,其密度小于海水而大于油污,可在油水界面提供N、P等营养物质,同时,乳剂具有低表面张力,增加了其与油污的接触面积。
本发明制备的菌剂具有漂浮性和可生物降解性,可在海水表面与石油污染物接触,从而减少石油烃从油相到胞内传质距离,提高了石油污染物的生物可利用性,同时固定化载体的生物可降解性,不会对环境造成二次污染,应用时不用回收。
本发明将营养乳剂和菌剂同时应用于海洋浮油污染生物修复,同时解决了海洋环境中N、P等营养物质的缺乏、石油烃的生物可利用性差及接种至海洋环境中的石油降解菌容易流失和存活时间短的问题,可显著提高生物修复效果。
附图说明
图1是营养乳剂与柴油在海水中的性状的示意图。
图2是营养乳剂在海水中的分布(200×)示意图。
图3是菌剂的载菌量测试中载体的示意图。
图4是菌剂的载菌量测试中菌剂漂浮于海水中的示意图。
图5是菌剂的载菌量测试中菌剂的微观结构示意图。
图6是菌剂的载菌量测试中菌体附着于复合膜上的示意图。
图7为实施例3制备的菌剂的形状示意图。
图8是实施例3制备的菌剂的漂浮性示意图。
图9是未固定菌群的固定化载体的超微结构示意图。
图10是固定菌群的菌剂的超微结构示意图。
图11是营养乳剂和实施例2制备的菌剂联用对于柴油的降解率的示意图。
图12是营养乳剂和实施例3制备的菌剂联用对于柴油的降解率的示意图。
图13是玻璃池在摇床模拟海洋环境中的一种示意图。
图14是玻璃池在摇床模拟海洋环境中的另一种示意图。
图15是海水池中取样点分布示意图。
图16是各组表层海水油浓度的变化示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
营养乳液的配方优化及制备
一、方法
(1)制备工艺
大豆卵磷脂与无水乙醇按照一定质量比(Km)混合,加入油酸,涡旋混合,再加入尿素水溶液,以10000rpm搅拌1min,获得营养乳剂。采用染色法判断乳液类型。
(2)稳定性考察
营养乳剂的分散液滴一般为0.1-100μm。微小液滴表面积大,表面自由能大,因而具有热力学不稳定性,乳剂的破坏是其必然结果,只是方式和时间上的差异而已。乳剂的物理不稳定性表现为分散液滴可自动由小变大或分层等,其每种形式都是乳剂稳定性发生变化的表征。本实验采用离心法加速乳剂的分层,由于不同处方组成的乳剂在相同离心条件下液滴合成或分层速度不同,因而表现出乳剂的浊度或对光的吸收程度不同,因此,通过测定样品被离心前后在一定波长下对光吸收大小的改变,可计算乳剂的稳定性参数(K
营养乳剂的稳定性参数(K
乳剂的稳定性参数(K
K
式中:K
二、结果
称取0.1g大豆卵磷脂,再按大豆卵磷脂与无水乙醇质量比(Km)为:1:14、1:19和1:24称取无水乙醇,并混合形成乙醇与大豆卵磷脂的混合物,该混合物与油酸的质量比称为K值,当Km值为1:14时,按K值分别为15:5、15:7.5和15:10称取油酸,当Km值为1:19时,按K值分别为20:8、20:10和20:12称取油酸,当Km值为1:19时,按K值分别为25:5、25:10和25:15称取油酸,将油酸与乙醇和大豆卵磷脂的混合物涡旋混匀,再分别加入不同量的尿素水溶液(浓度为0.4g/ml),当体系由澄清变为乳白色时,再分别加入不同量的尿素水溶液(浓度为0.4g/ml),形成的不同乳剂,测得稳定性常数如表1所示,选取K
通过乳液的稳定性优化,确定营养乳剂的制备方法如下:按大豆卵磷脂与无水乙醇质量比(Km)为1:19,混合大豆卵磷脂与无水乙醇,再按K值为20:12混合油酸,再按大豆卵磷脂与尿素水溶液的比例(m/V)为1/26混合尿素水溶液(尿素水溶液浓度为0.4g/ml),以10000rpm搅拌1min,即为营养乳剂。最佳的营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.7%、无水乙醇32.8%、油酸20.7%、尿素水溶液44.8%。
表1乳剂稳定性常数
营养乳剂的理化性质:
营养乳剂的理化性质如表2所示,其密度为0.95g/L,小于海水密度,所以营养乳剂在海水中以极微小的球形颗粒分散地漂浮于水面(如图1所示,图1是营养乳剂与柴油在海水中的性状的示意图。),而柴油的密度为0.83g/L,漂浮于亲油肥料的上层(如图2所示,图2是营养乳剂在海水中的分布(200×)示意图。)。因此营养乳剂能在油水交界面提供营养物质供石油降解菌利用,而无需增加整个水相中的营养物质浓度。
表2营养乳剂理化性质
实施例2
菌剂的制备:
将膨化大黄米20g(体积约为200mL)加入至浓度为3%的海藻酸钠溶液200mL中,搅拌均匀,将包裹有海藻酸钠的载体材料滴入含有浓度为0.5%的壳聚糖和2%的CaCl
分别将海洋石油降解菌Acinetobacter sp.Y9、W3、F9(不动杆菌属)、Gordoniasp.X1(戈登氏菌属)活化后接种至LB液体培养基中,在摇床中30℃,180rpm培养约12h,当菌液OD
菌剂的载菌量测定及电镜观察:
取0.1g菌剂,碾碎后加入5ml LB培养基中,涡旋剧烈震荡10min,使菌体解吸附。取悬浮液1ml,进行10倍倍比稀释,稀释至10
将菌剂压碎后进行喷金,置于扫描电镜下进行观察。膨化后的大黄米表面覆盖了一层海藻酸钙(海藻酸钠与氯化钙反应形成海藻酸钙)-壳聚糖复合膜,膜为无色透明状。固定化降解菌群后,经冻干,载体为浅黄色(图3是菌剂的载菌量测试中载体的示意图。),由于膨化大黄米密度远小于海水,所以菌剂在海水中具有良好的漂浮性,可保持漂浮状态达数周(图4是菌剂的载菌量测试中菌剂漂浮于海水中的示意图。)。扫描电子显微镜下,生物载体呈多孔状结构(图5是菌剂的载菌量测试中菌剂的微观结构示意图。),固定石油降解菌群后,可见大量菌体附着于复合膜上(图6是菌剂的载菌量测试中菌体附着于复合膜上的示意图。)。
实施例3
菌剂的制备:
将100mL 3%的壳聚糖醋酸溶液滴入至100mL 2mol/L的NaOH溶液中,固化5min,将固化小球取出后,用纯水冲洗至中性,即为载体材料,再将其加入至200mL 3%的海藻酸钠溶液中,搅拌均匀,将包裹有海藻酸钠的壳聚糖小球滴入至500mL含有浓度为0.5%的壳聚糖和2%的CaCl
石油降解菌群的固定化:分别将海洋石油降解菌Acinetobacter sp.Y9、W3、F9、Gordonia sp.X1活化后接种至LB液体培养基中,在摇床中30℃,180rpm培养约12h,当菌液OD
菌剂的载菌量测定及电镜观察:
取0.1g菌剂,碾碎后加入5ml LB培养基中,涡旋剧烈震荡10min,使菌体解吸附。取悬浮液1ml,进行10倍倍比稀释,稀释至10
实施例4
分别取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml实施例1制备的营养乳剂(最佳的营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.7%、无水乙醇32.8%、油酸20.7%、尿素水溶液44.8%。)加入至装有含有浓度为1%(V/V)的柴油的50ml海水中,再加入0.2g实施例2制备的菌剂,置于30℃,180rpm条件下培养6d后,测量降解率。所有降解实验做三个平行,以未接菌的作对照。在不同营养乳剂用量情况下与菌剂作用下,柴油6d后的降解率如图11所示,图11是营养乳剂和实施例2制备的菌剂联用对于柴油的降解率的示意图。在营养乳剂用量为0.8ml时(营养乳剂与柴油的体积比为:8:5),降解率达到最大(78%),而低于0.8ml时降解率都有所下降。
实施例5
分别取0.2、0.4、0.6和0.8ml实施例1制备的营养乳剂(最佳的营养乳剂是由以下质量百分含量的组分制成:大豆卵磷脂1.7%、无水乙醇32.8%、油酸20.7%、尿素水溶液44.8%。)加入至装有含有浓度为1%(V/V)的柴油的50ml海水中,再加入0.2g实施例3制备的菌剂,置于30℃,180rpm条件下培养6d后,测量降解率。所有降解实验做三个平行,以未接菌的作对照。在不同营养乳剂用量情况下与菌剂作用下,柴油6d后的降解率如图12所示,图12是营养乳剂和实施例3制备的菌剂联用对于柴油的降解率的示意图。在营养乳剂用量为0.8ml时(营养乳剂与柴油的体积比为:8:5),柴油降解率(61%)略高于其余用量。
实施例6
营养乳剂与菌剂联合降解浮油的室内模拟实验:
模拟低搅动情况下的海洋环境,分别将8L海水和10ml柴油置于4个玻璃池中(0.5m(L)×0.3m(W)×0.4m(H)),如图13所示,图13是玻璃池在摇床模拟海洋环境中的一种示意图。其中一个作为空白对照(未加菌剂和营养乳剂),两个作为阴性对照(只加菌剂和只加营养乳剂),另一个作为实验组,添加菌剂和营养乳剂,菌剂(实施例2制备)添加量为4g和营养乳剂(实施例1制备)加入量为10ml。将玻璃池置于摇床中,在40r/min,30℃条件下培养,如图14所示,图14是玻璃池在摇床模拟海洋环境中的另一种示意图。采用五点法(见图15所示,图15是海水池中取样点分布示意图。)取海水表面水样进行残油含量分析,每点取30ml,共150ml。用50ml石油醚萃取3次后,采用紫外分光光度法测定柴油的残留量。表层海水油浓度的变化如图16所示,图16是各组表层海水油浓度的变化示意图。同时添加菌剂和营养乳剂的实验组油浓度下降显著快于空白对照以及单独添加菌剂和营养乳剂组,可见营养乳剂与菌剂联合应用可提高生物修复效果。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明方案的范围内。
- 一种营养乳剂和菌剂联用在制备海洋浮油污染生物修复材料中的应用
- 一种适用于海洋环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂及其制备方法和应用