一种检测发酵液中己二酸含量的气相色谱方法

技术领域

本发明涉及一种发酵液中己二酸含量的测定方法，特别是涉及一种通过气相色谱仪对发酵液中己二酸含量进行检测的方法，属于痕量测定领域。

背景技术

己二酸(adipic acid)，又称肥酸，是一种工业上重要的大宗化学品，是尼龙66的重要单体，还可用于聚酯的生产，以及食品添加剂、高级润滑油、涂料、染料、医药中间体等，其在现代工业中应用十分广泛。目前己二酸的生产方法主要是依赖不可再生的石化前体经硝酸催化氧化KA油实现，过程中会排放大量温室气体一氧化二氮，随着化石燃料的逐年减少，以及愈演愈烈的温室效应，利用生物法直接合成己二酸具有重大社会意义。

目前报导的发酵液中己二酸的检测方法多为高效液相色谱法(HPLC)，此方法样品处理简单，但由于己二酸是二元羧酸，紫外吸收弱，而用示差折光检测容易漂移，导致HPLC法检出限较高，在构建己二酸合成途径时往往己二酸产量较低，HPLC法难以检测到事实上已经生成的己二酸，使得己二酸合成途径的构建结果判定有误，影响研究进展。另外发酵液成分复杂，经发酵培养有多种羧酸类物质生成会对己二酸浓度测定造成影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，克服己二酸在其他仪器中响应值不高导致检出限偏高的缺陷，通过摸索寻找最佳萃取方法、衍生化条件而提供一种使用气相色谱检测发酵液中己二酸含量的方法，能够在其他羧酸不干扰的条件下精确测试己二酸含量，本发明采用使用N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺作为衍生化衍生试剂。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

本发明的一种检测发酵液中己二酸含量的气相色谱方法，包括如下步骤：

(1)发酵液离心后取上清液，加入上清液体积10％的HCl溶液进行酸化，混匀；再加入乙酸乙酯，剧烈震荡5min，静置，待分层后，取有机相于试管中，水相再次用乙酸乙酯萃取；合并有机相，30℃下氮气吹干；用乙酸乙酯定容，加入N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺混匀，50-60℃300rpm下衍生1小时，过0.45μm滤膜，待气相色谱分析；

(2)称取己二酸标准品，加入N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺进行衍生化后，用乙酸乙酯定容后作为质量浓度储备液，然后进一步用乙酸乙酯稀释为具有浓度梯度的标准使用液；

(3)利用气相色谱仪对步骤(2)标准使用液和步骤(1)试样处理液进行检测；根据标准使用液的己二酸峰位置对应找到试样处理液中己二酸峰位置，然后测定试样处理液中己二酸峰位置对应的峰面积，采用步骤(2)标准使用液得到对应的己二酸色谱峰面积与其浓度之间的关系，然后将试样处理液己二酸峰位置对应的峰面积与上述关系对照得到浓度。

优选地，所述步骤(1)HCl溶液浓度为2mol/L。

优选地，步骤(1)中乙酸乙酯作为有机萃取剂选，第一次加入时，每500ml上清液对应0.5mL乙酸乙酯；每500ml上清液对应500μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺。

步骤(2)中己二酸标与N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺的对应关系为N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺绝对过量。

优选地，步骤(3)所述利用气相色谱仪对试样处理液进行检测的条件为：

色谱柱：DB-1，30m×0.25mm(内径)，0.25μm(膜厚)

进样口温度：250℃；

氮气流量：1.0mL/min；

吹扫流量：3.0mL/min；

辅助气氢气流量：40.0mL/min；

空气流量：400.0mL/min；

进样体积：1.0μL；

柱温：100℃(保持0.2min)，以5℃/min升温至120℃(保持5min)，以30℃/min升温至180℃(保持3.8min)，合计15min。

检测器：氢火焰离子化检测器；

检测器温度：300℃。

并根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

本发明的优点是：采用本发明的方法检测发酵液中己二酸的含量，快速有效，检出限低，可到0.309mg/L。由此可见，本发明的方法，为发酵液中己二酸含量的检测，提供了一种可靠有效的方法。

附图说明

图1是实施例1中不同浓度己二酸的标准溶液色谱图。

图2是实施例1中己二酸的标准曲线。

图3是实施例5中发酵液中的羧酸类物质。

图4是实施例5发酵液及标品的气相图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

称取己二酸标准品(纯度99.5％，阿拉丁)50.00mg，用去离子水溶解并定容至10.00mL，浓度为5g/L的己二酸标准水溶液，各取0.5mL分别加入0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL乙酸乙酯，剧烈震荡5min，静置，待分层后，取有机相于试管中，水相再次用乙酸乙酯萃取一次。合并有机相，30℃下氮气吹干。加入500μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，混匀，60℃衍生1小时，使用1mL乙酸乙酯定容，过0.45um滤膜，待气相色谱分析。

称取己二酸标准品(纯度99.5％，阿拉丁)5.00mg，加入500μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，混匀，60℃衍生30min，用乙酸乙酯溶解并定容至10.00mL，浓度为500mg/L的标准储备液，然后进一步用乙酸乙酯稀释为浓度1mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的标准溶液，待气相色谱分析。

检测仪器为岛津GC2010气相色谱仪。检测条件为：

色谱柱：DB-1，30m×0.25mm(内径)，0.25μm(膜厚)

进样口温度：250℃；

氮气流量：1.0mL/min；

吹扫流量：3.0mL/min；

辅助气氢气流量：40.0mL/min；

空气流量：400.0mL/min；

进样体积：1.0μL；

柱温：100℃(保持0.2min)，以5℃/min升温至120℃(保持5min)，以30℃/min升温至180℃(保持3.8min)，合计15min。

检测器：氢火焰离子化检测器；

检测器温度：300℃。

根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

采用气相色谱仪分别对待测样品溶液和不同浓度的己二酸标准溶液进行检测分析得到色谱峰面积，以己二酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标Y轴，己二酸标准溶液的浓度为横坐标X轴绘制标准曲线，如图2所示，得出斜率和截距，以及相应的线性回归方程：Y＝443.413X，R

采用不同体积乙酸乙酯对己二酸水溶液进行萃取，己二酸回收率分别为84.31％、96.2％、95.89％、96.14％、96.23％。结果证实，以2倍体积乙酸乙酯进行萃取效果较好。

实施例2

取实施例1中浓度为5g/L的己二酸标准水溶液各0.5mL加入1mL乙酸乙酯后，分别剧烈震荡2min、5min、8min、10min，静置，待分层后，取有机相于试管中，水相再次用乙酸乙酯萃取一次。合并有机相，30℃下氮气吹干。其余操作同实施例1。

利用乙酸乙酯对己二酸水溶液进行萃取，不同萃取时间下己二酸回收率分别为92.21％、96.08％、96.1％、95.92％。结果证实，以单次萃取时间为5min时萃取效果较好。

实施例3

准确称取0.500mg己二酸标准品，加入100μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，混匀，分别于25℃、30℃、40℃、50℃、60℃下进行衍生化，每隔30min取样一次，取样至2h。其他操作同实施例1，得到本实施例中待测样品。结果证实衍生化反应温度为以50℃、60℃时，反应1h能达到>99.95％的己二酸回收率，50℃、反应时间1h为最佳衍生化条件。

实施例4

准确称取0.500mg己二酸标准品，分别加入50μL、100μL、200μL、400μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，混匀，于50℃下衍生化1小时。其他操作同实施例1，得到本实施例中待测样品。结果证实衍生化试剂添加量为200μL及400μL时能达到>99.95％的己二酸回收率，即200μL为衍生化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺最佳添加量。

实施例5

以SOB培养基对己二酸基因工程菌进行发酵，SOB培养基成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素，将发酵液于13000g离心10min后，取上清液500μL，加入50μL浓度为2mol/L的盐酸溶液进行酸化后，加入1mL乙酸乙酯，剧烈震荡5min，静置，待分层后，取有机相于试管中，水相重复萃取一次。合并有机相，30℃下氮气吹干。使用1mL乙酸乙酯定容，加入200μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，混匀，50℃衍生1小时，过0.45um滤膜，待气相色谱分析。

其他操作同实施例1，得到本实施例中待测样品溶液。

发酵液上清液包括乳酸、己酸、苯甲酸、琥珀酸、癸酸、己二酸等羧酸类物质生成。图谱如图3显示，其中测定已知己二酸浓度为0.809mg/L，采用本方法检测，图谱如图4显示，出峰位置与己二酸标品出峰位置相同，测定己二酸浓度为0.813mg/L，误差小于0.5％。

根据信噪比(S/N)＝3计算最小检出限为0.309mg/L。

根据信噪比(S/N)＝10计算定量限为1.030mg/L。

实施例6

以M9培养基对己二酸基因工程菌进行发酵，M9培养基成分为2.5g/L葡萄糖+20g/L甘油+0.5％酵母粉+2g/L MOPS+0.05％NaCl+6g/L Na

其他操作同实施例1，得到本实施例中待测样品溶液。

待测样品经气相色谱-质谱联用测定浓度为1.859mg/L，采用本方法测定浓度为1.842mg/L，误差0.91％。

显而易见，本领域的技术人员，可以按照本发明步骤使用气相色谱仪对发酵液中己二酸的含量进行测定。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。