一种通过构建固液两相可分离再生体系验证抗氧化剂间再生作用的方法

技术领域

本发明涉及一种通过构建固液两相可分离再生体系验证抗氧化剂间再生作用的方法，属于抗氧化剂再生作用领域。

背景技术

抗氧化剂按照来源分类，抗氧化剂可以分为工业合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。常见的合成抗氧化剂主要是叔丁基对苯二酚(TBHQ)，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，丁基羟基茴香醚(BHA)这三种。长期以来因为价格低廉、工艺简单、抗氧化效果强的优点在工业生产中被广泛使用。天然抗氧化剂作为天然绿色安全抗氧化剂，种类繁多，如维生素C、E等已经广泛应用于油脂和化妆品等领域。但天然抗氧化剂相比来说因为提取成本高、抗氧化效果不够理想，食品企业多选择合成抗氧化剂作为含油脂类食品的主要抗氧化剂。

按照溶解性分类，抗氧化剂可以分为水溶性抗氧化剂和油溶性抗氧化剂以及兼容性抗氧化剂。脂溶性抗氧化剂如TBHQ和α-生育酚，常被用于含油脂类食品中来延缓脂肪的氧化导致食品风味变化；水溶性抗氧化剂如茶多酚，维生素C、异抗坏血酸钠和植酸等，多用于水果蔬菜的加工和储藏中减缓氧化来保障食品品质。

食物变质主要是由氧化引起，尤其是脂质氧化。添加抗氧化剂是目前最常用的延缓脂质氧化并且延长食物保质期的方法。考虑到合成抗氧化剂的潜在毒性和致癌性，寻找可替代品对人类健康和经济利益必不可少。天然抗氧化剂因为其资源丰富和健康高效，受到广泛关注。将天然抗氧化剂与合成抗氧化剂结合使用产生协同抗氧化作用，降低合成抗氧化剂的使用量，且抗氧化效果不受影响甚至更好。

在实际应用过程中，单一抗氧化剂的使用往往不能满足实际生产的需要，故而有很多研究将不同种类的抗氧化剂之间进行两种及两种以上的复配，以期实现更好的抗氧化效果。不同抗氧化剂间复配后，其抗氧化能力显著优于仅添加一种抗氧化剂时的抗氧化能力时，我们将上述这种现象称为抗氧化剂间的协同作用。目前关于抗氧化剂间的协同作用主要归因于三种作用机制：抗氧化剂间的再生作用、减少过氧化物自由基的形成、螯合金属离子。其中，再生作用被认为是抗氧化剂发生协同作用的主要原因。近几年的研究表明，同一溶解性的抗氧化剂间存在再生，不同溶解性的抗氧化剂之间，也可以存在再生作用。对不同溶解性抗氧化剂间的再生作用的有效验证，可在两相以及多相食品体系中良好应用；对不同溶解性的抗氧化剂的再生作用进行验证，为后续食品体系中的应用提供有效理论依据。

目前最常见的对不同溶解性的抗氧化剂的再生作用进行验证的方法，是研究复配抗氧化剂对所在体系的氧化程度与单一抗氧化剂对体系的氧化抑制情况进行分析，通过分析氧化过程中的氢过氧化物生成规律或者耗氧量变化情况来分析再生作用。该类方法虽然可以用来验证抗氧化剂之间是否存在再生作用，但是操作复杂，影响因素较多。

发明内容

为了解决现有技术当中验证抗氧化剂之间是否勋在再生作用的方法操作复杂，成本高的问题，对不同溶解性的抗氧化剂有无再生作用进行验证，提供一种操作简单、直观且高效的抗氧化剂之间有无再生作用的验证方法，从而为后期实现不同溶解性的抗氧化剂在不同食品体系中的良好应用。

本发明提供了一种通过构建固液两相可分离再生体系验证抗氧化剂间再生作用的方法，所述方法的步骤如下：

(1)可分离再生体系液相的制备：

将脂溶性抗氧化剂溶解在甲醇中，得到脂溶性抗氧化剂溶液，即为可分离体系再生体系液相。

(2)含水溶性抗氧化剂的β-环糊精包合物的制备：

(2.1)制备β-环糊精溶液和水溶性抗氧化剂水溶液：称取β-环糊精于去离子水中，水浴下加热充分溶解，得到β-环糊精溶液；将水溶性抗氧化剂溶解于去离子水中制备水溶性抗氧化剂水溶液；

(2.2)制备含水溶性抗氧化剂的β-环糊精溶液：恒速向β-环糊精溶液中滴加水溶性抗氧化剂水溶液，磁力水浴搅拌锅中磁力搅拌；

(2.3)保藏与备用：将步骤(2.2)制备的溶液冷却后置于4℃结晶，待不再有晶体析出后，过滤收集晶体，漂洗、真空干燥得到固体。

(3)固液两相可分离再生体系中抗氧化剂间有无再生作用的验证

(3.1)再生组的设置：

将步骤(2)中制备的含水溶性抗氧化剂的β-环糊精包合物固体放入步骤(1)制备的可分离再生体系液相中，获得固液两相可分离体系，为再生组。

(3.2)对照组的设置：

将同等质量的不含水溶性抗氧化剂的β-环糊精包合物放入步骤(1)制备的可分离再生体系液相中，为对照组。

(3.3)再生作用的验证：再生组和对照组密封暗处摇床振荡反应，控制反应时间相同，利用DPPH清除自由基法测定再生组和对照组中溶液的抗氧化能力。当再生组溶液的抗氧化能力高于对照组时，则表明所添加的水溶性抗氧化剂能够再生液相中的抗氧化剂；若两者无明显差异，则说明两种抗氧化剂之间不存在再生作用。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2.1)中β-环糊精水浴加热温度为60℃。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2.2)中磁力水浴搅拌锅温度为60℃，搅拌时间为6h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3.3)中，DPPH清除自由基法的具体步骤为：配置0.1mmol/L DPPH-甲醇溶液。需要使用时将抗氧化剂与DPPH于室温下避光反应30min，待反应稳定后，于517nm处紫外检测记录吸光度。

在本发明的一种实施方式中，所述脂溶性抗氧化剂为TBHQ特丁基对苯二酚。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2.1)为，称取30gβ-环糊精于420g去离子水中，60℃水浴下加热充分溶解，得到β-环糊精溶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2.2)中，磁力水浴搅拌锅中60℃磁力搅拌6h。

在本发明的一种实施方式中，所述脂溶性抗氧化剂溶液的浓度为1mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述使水溶性抗氧化剂结合到β-环糊精形成固体的方法为结晶法。

在本发明的一种实施方式中，所述的一种固液两相可分离再生体系中抗氧化剂间有无再生作用的验证方法，所述的固液两相可分离体系，由于结合在β-环糊精上的水溶性抗氧化剂不溶于有机溶剂，而是与有机相接触，通过测定有机相中的抗氧化能力即可表征有机相中脂溶性抗氧化剂含量的变化，使得研究不同溶解性抗氧化剂之间有无再生作用操作更加简便，验证结果更加直观。

有益效果

1、本发明通过构建固液两相可分离再生体系，避免了抗氧化剂在相互反应后不能直接对某一种抗氧化剂的抗氧化能力进行测定，本发明方法更加简便直观，受其他因素影响较少。

2、本发明采用的DPPH清除自由基法测定液相溶液中的抗氧化能力变化，能够间接表示脂溶性抗氧化剂含量的变化，不需要使用大型仪器设备，成本较低。

3、可以根据实际应用要求，对可分离体系中的变量进行修改调整，使得在特定条件下证明抗氧化剂之间是否存在再生作用。

4、经过固液两相可分离再生体系验证得到的存在再生作用的抗氧化剂组合，可以考虑利用应用在食品体系中来延长产品的货架期。

附图说明

图1：固液两相可分离再生体系的构建示意图。

图2：奶油泡芙不同样品组在不同温度下过氧化值随时间的变化。

具体实施方式

为了更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不仅仅局限于实施例表述的范围。

实施例1：抗坏血酸对TBHQ再生作用的验证

(1)含抗坏血酸的β-环糊精包合物的制备

称取30gβ-环糊精于420g去离子水中，60℃水浴下加热充分溶解，得到β-环糊精溶液。

将15g抗坏血酸溶解于150mL去离子水中制备抗坏血酸溶液。

恒速向β-环糊精溶液中滴加抗坏血酸溶液，磁力水浴搅拌锅中60℃磁力搅拌6h。溶液冷却后置于4℃冰箱结晶，待不再有晶体析出后，过滤收集晶体，漂洗、真空干燥得到固体。

(2)固液两相可分离再生体系的构建

制备1mmol/L的TBHQ甲醇溶液，等量取两份10mL于离心管中。称取1g抗坏血酸与β-环糊精包合物添加于离心管中，此为再生组。另一份添加1gβ-环糊精作为对照组。两份样品置于摇床上300rpm运行2、4、6、8天，设置温度为25℃进行反应。

(3)再生性验证

不同时间点取再生组和对照组的0.5mL TBHQ甲醇溶液，加入3mL DPPH于室温下避光反应30min，待反应稳定后，于517nm处紫外检测记录吸光度。比较再生组和对照组的抗氧化能力大小来判断抗坏血酸对TBHQ是否有再生作用。实验示意图见附图1。

实施例2：经固液两相可分离体系验证抗坏血酸可再生TBHQ后，二者结合在奶油泡芙中的应用实验

(1)泡芙外壳的制作：

将黄油、糖、水、盐加入锅中，中火加热搅拌，使油脂分布均匀。沸腾后转小火，倒入全部的面粉，快速搅拌使面粉和水完全混合在一起，直至面粉与水完全融合，关火。待面糊冷却至60-65℃，分三组对照实验，两组不添加抗坏血酸，一组添加0.2％的抗坏血酸，混合均匀。再加少量鸡蛋，搅拌直至面糊将鸡蛋全部吸收，面糊挑起呈现倒三角状，尖角到底部距离4cm且不会滑落即可。烤盘垫上锡纸，将面糊等距挤在烤盘上，烤箱210℃预热，烤15min；当面糊膨胀起来，将烤箱温度降低到180℃，继续烤30min，待表面黄褐色即可出炉。

(2)泡芙内馅奶油的制作：

等量称取3份淡奶油，一份不添加TBHQ，两份中添加0.02％的TBHQ，混匀均匀。用打蛋器将淡奶油打发成奶油，供后续实验使用，泡芙中TBHQ和抗坏血酸的添加量如表1所示。

表1泡芙中TBHQ和抗坏血酸的添加量

(3)奶油泡芙加速储藏实验

将三组泡芙在4、15、25、30℃温度储存条件下各放置一份进行加速储存实验。

(4)奶油中油脂的提取

将泡芙置于锥形瓶中，恒温干燥箱中70℃加热至融化，冷却至室温按3倍奶油体积加入石油醚，摇匀后放置12h浸提。滤纸用无水硫酸钠浸湿，样品用漏斗进行过滤收集，将滤液在40℃下用旋转蒸发仪进行旋蒸除去石油醚。收集的样品氮吹，8000rpm离心10min，除去残留的溶剂和杂质。获得的油脂收集备用。

(5)奶油油脂过氧化值的测定

参考GB 5009.227-2016《食品中过氧化值的测定》中的滴定法对奶油的油脂过氧化值进行测定。结果：抗坏血酸-TBHQ结合应用在奶油泡芙中能够有效减缓奶油的油脂抗氧化值的上升。结果见附图2。

附图2为三组样品组泡芙中奶油的过氧化值。

综上所述，本发明所构建的固液两相可分离再生体系，能够对不同溶解性抗氧化剂间再生作用进行有效验证，操作简单，成本低廉；经实验验证可知存在再生作用的抗氧化剂组合在食品体系中有着较好的抗氧化作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。