一种具有肿瘤抑制作用的外泌体及其应用

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤抑制作用的外泌体及其应用。

背景技术

髓源性抑制细胞(MDSC)是一群存在于肿瘤患者体内的具有强大免疫抑制功能的异质性细胞群。MDSC来源于骨髓，在正常情况下，MDSC可分化为成熟粒细胞、单核细胞以及巨噬细胞。而在某些病理情况下，尤其是在肿瘤中，MDSCs的分化成熟过程被肿瘤基质细胞、活化免疫细胞分泌的多种因子阻断，从而导致MDSCs在肿瘤患者体内大量聚集。转移到肿瘤病灶的MDSCs大量产生S100A9与S100A8，这两种蛋白可以招募更多的MDSCs到达肿瘤局部，并通过促进Arg1和ROS的表达上调MDSCs的免疫抑制功能。除此之外，S100A8和S100A9可通过激活肿瘤细胞中MAPK和NF-κB途径促进肿瘤发展。

外泌体（Exosomes）是来源于细胞的直径为30-150nm、包裹细胞质成分的脂质双层膜结构囊泡，在细胞间信息传递中发挥重要作用。近年来，外泌体被证实可参与肿瘤发生发展的多个环节，包括抑制抗肿瘤免疫应答、参与肿瘤微环境构建及转移等。研究表明，MDSC来源exosomes（M-Exo）包含大量的促炎性S100蛋白以及组蛋白，占M-Exo总包含物的56％。虽然S100A9蛋白与结直肠癌细胞的干性及发生发展相关，但是其能否通过抑制S100A9的表达实现降低肿瘤干性，减缓肿瘤进展一直以来都没有相关的研究报道出现。

发明内容

有鉴于此，为了弥补现有技术中的一些不足，本发明的目的在于提供一种具有肿瘤抑制作用的外泌体及其应用。本发明通过S100A9干扰RNA对MDSC来源的外泌体进行S100A9蛋白敲除，发现其可以降低肿瘤细胞的干性，尤其对结肠癌细胞的增长具有明显的抑制作用，为抗肿瘤药物的研发提供了新思路。

为了实现上述目的，本发明提供了一种具有肿瘤抑制作用的外泌体，所述的外泌体为MDSC来源的敲除S100A9蛋白的外泌体。

进一步地，所述的肿瘤为结直肠癌。所述的敲除S100A9蛋白为在转录水平上抑制S100A9蛋白表达。

进一步地，本发明还提供了上述具有肿瘤抑制作用的外泌体在制备肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为结直肠癌。

本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药物，所述的药物包括治疗肿瘤的有效剂量的活性成分，所述的活性成分为含有MDSC来源的敲除S100A9蛋白的外泌体载体。

所述的肿瘤为结直肠癌。

本发明还提供了一种体外非治疗目的抑制肿瘤细胞的方法，所述方法为在上述用于治疗肿瘤的外泌体存在的情况下培养肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用S100A9 干扰RNA制备了一种敲除S100A9蛋白的外泌体hM-Exo

附图说明

图1是MDSC的蛋白含量测定图；；

图2是各处理组MDSC对促进SW480移植瘤体积的柱状图；

图3是成球实验中细胞集落的电镜视野对比图；

图4是对SW480细胞表面的CD44表达影响的散点图及对应的柱状图；

图5是对SW480细胞蛋白表达影响图；

图6是肿瘤发生发展模型情况图；图中，A是不同处理组肿瘤发生率的折线图；B是不同处理组小鼠肿瘤生长情况的记录照片。

具体实施方式

下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围；实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，实施例中所使用的试剂盒试剂的量仅是示例性的，本领域技术人员可以根据实际情况作相应调整；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

（1）肿瘤组织来源MDSC的制备

①收集10例结直肠癌患者的肿瘤组织，取材后称重，无菌条件下，双抗（青霉素和链霉素）浸泡5min，无菌PBS清洗组织2遍，剪成1mm

②将其研磨至无肉眼可见的组织块悬液，转移至PBS中，经75μm筛网过滤；

③收集滤液于50ml离心管中，每克组织加入5ml胶原消化液，37℃消化1h，每10min震荡混匀1次；

④将消化液500g、5min离心，弃上清，PBS洗涤2次，计数，将细胞重悬于PBS，并分装于EP管中，1×10

⑤每支各加入2μg抗人FITC-HLA-DR、PE-Cy5.5-CD11b和PE-CD33单克隆抗体，4℃孵育30 min，PBS洗涤两遍；

⑥流式细胞仪分选出HLA-DR

（2）转染Rab27a siRNA的MDSC的制备

①将步骤（1）中所制备的MDSC按2×10

②向无血清RPMI-1640培养液（22.5 μl/孔）中加入Rab27a siRNA（序列5'-AGAACUUGAUGAGGUAAUCGUGAUUACCUCAUCAAGUUCUUG5'-3'；2.5 μl/孔）制成终浓度为100 nM的稀释液25 μl，稀释液混匀后室温静置5 min；另向无血清RPMI-1640培养液（23 μl /孔）中加入转染试剂（2 μl /孔）配成25 μl工作液；轻轻混匀后室温静置5 min；将工作液加入稀释液中，混匀，室温静置30 min，为转染复合物；

③将50 μl转染复合物加入到已种细胞的各孔中；转染6 h后观察细胞，细胞状态好不必更换培养基，继续培养；培养72 h后，收集得到转染Rab27a siRNA的MDSC。

（3）分别收集步骤（1）中得到的MDSC及步骤（2）中得到的转染Rab27a siRNA的MDSC的培养上清液。将上清4 ℃、300 g离心20 min，收集上清； 4 ℃1000 g离心30 min，收集上清；4 ℃、10 000 g离心30 min；将上清转移至MWCO 100 kDa的超滤离心管中，1000 g离心30 min，收集内管中的浓缩液。用ExoQuick-TCTM Exosome试剂盒制备hM-Exo（人源MDSC来源的外泌体），同时制备对照组（NControl），区别在于步骤（2）中②加入的是si-NC（5'-UUGAACGAUAAGGUGAAUCAGUUUGUUCAAGAUCCUGAUCUAC-3'）。使用BCA Protein Assay Kit通过BCA微量蛋白定量进行总蛋白含量的定量检测。图1是MDSC的蛋白含量测定图；由1可见，转染Rab27a siRNA后可以抑制MDSC分泌外泌体。

实施例2

取12只6～8周龄、雌性BALB/C裸鼠随机均分成4组，具体分为RPMI-1640组、MDSC组、si-Rab27a组和si-NC组；其中RPMI-1640组小鼠皮下注射100μL的RPMI-1640培养基+ 1×10

图2是各处理组MDSC对促进SW480移植瘤体积的柱状图。如图2所示，Rab27a siRNA可以抑制MDSC分泌外泌体，MDSC可明显促进SW480移植瘤的生长，但在Rab27a siRNA抑制外泌体分泌后，MDSC促进肿瘤生长的能力明显降低。

实施例3

在本实施例中利用S100A9 siRNA制备hM-Exo

采用与实施例1中步骤（2）所述转染Rab27a siRNA的MDSC相同方法制备转染S100A9 siRNA的MDSC，收集培养上清液；将上清4 ℃、300 g离心20 min，收集上清； 4 ℃1000 g离心30 min，收集上清；4 ℃、10 000 g离心30 min；将上清转移至MWCO 100 kDa的超滤离心管中，1000 g离心30 min，收集内管中的浓缩液。用ExoQuick-TCTM Exosome试剂盒制备hM-Exo

分别用hM-Exo和hM-Exo

通过流式细胞术检测肿瘤细胞CD44的表达情况。收集培养6 d的SW480细胞1×10

图4是对SW480细胞表面的CD44表达影响的散点图及对应的柱状图；如图4可见，hM-Exo处理组中SW480细胞集落数量显著多于空白组，但抑制S100A9表达后的hM-Exo

通过Western Blot测定不同处理组SW480细胞Oct4与ALDH1A1的表达量。收集培养6 d的SW480细胞于EP管，1 ml PBS清洗，重复1次；SW480细胞悬液50 ml与等体积的裂解液（RIPA : PMSF = 250 : 1）混匀冰上放置1 h，每10 min震荡一次；4 ℃、12 000g离心15min，收集上清；按照BCA Protein Assay Kit说明书测定裂解上清中蛋白浓度；加入5×SDS-PAGE上样缓冲液于蛋白样品中，沸水浴中放置10 min，14 000 g离心10 min，收集上清；SDS-PAGE电泳后，转膜，将PVDF膜置于5 %脱脂奶粉中，4 ℃封闭过夜。用5 % 脱脂奶粉1 :2000稀释一抗（兔抗人Oct4、ALDH1A1和β-actin单克隆抗体)， 将PVDF膜浸泡在稀释的一抗中4℃孵育过夜后。用5 %脱脂奶粉1: 10 000稀释羊抗兔HRP-IgG抗体，室温孵育2 h。1×TBS/T洗涤3次，每次15 min。ECL检测显色，LAS 4000凝胶成像系统成像、保存。

图5是对SW480细胞蛋白表达影响图；由图5可见，hM-Exo处理组中SW480细胞中Oct4与ALDH1A1的表达较空白组有很大的增加，但hM-Exo

实施例4

在本实施例中分别利用hM-Exo和hM-Exo

图6是肿瘤发生发展模型情况图；图中，A是不同处理组肿瘤发生率的折线图；B是不同处理组小鼠肿瘤生长情况的记录照片；如图6所示，较PBS处理组，M-Exo处理的SW480细胞组小鼠肿瘤发生早且进展快，在一周内发生率最高可达到PBS处理组的2倍以上，而hM-Exo

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。