一种全过程靶向分子及其在构建递药系统中的应用

技术领域

本发明属药学领域，涉及一种全过程靶向分子及其在递药系统构建中的应用，具体涉及一种全过程靶向分子及其在肿瘤影像诊治和靶向治疗的递药系统构建中的应用，尤其是具有靶向脑毛细血管内皮细胞(跨血-脑屏障)、肿瘤新生血管内皮细胞 (跨血-肿瘤屏障)、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的全过程靶向分子，以及其修饰的药物复合物、载药系统在肿瘤诊断和靶向治疗中的用途。

背景技术

现有技术公开了肿瘤已是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。其中脑原发瘤发病率和死亡率均处于我国肿瘤排行榜的前10位，而脑胶质瘤占了脑原发瘤的45％左右，其患者的中位生存期小于16个月，危害性极大。传统的化疗作为脑肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷。因此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来，主动靶向成为提高脑肿瘤组织靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对脑肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与该受体或转运体具有特异性识别、结合能力的对应配体，将药物或载药系统递送至脑肿瘤组织或细胞中。目前的配体大多数只是针对某一受体或转运体和某一细胞的靶向，然而脑肿瘤组织不只有肿瘤细胞，还有肿瘤干细胞、肿瘤拟态血管、脑毛细血管及其血-脑屏障(BBB)、肿瘤新生血管及其血-肿瘤屏障(BTB)等。在脑肿瘤发生早期，BBB仍然保持完整并限制着药物进入脑部，使约 98％小分子化疗药物和几乎100％蛋白类等大分子药物无法透过BBB进入脑内，导致药物治疗几乎无效；随着肿瘤的发生发展，肿瘤新生血管生成，但脑肿瘤新生血管较外周肿瘤相对致密且通透性差，所形成的BTB成为药物递送的主要障碍，且在脑胶质瘤浸润区依然存在BBB也阻碍药物转运；同时，脑肿瘤干细胞具有自我更新、增殖和高致瘤性的特点，尽管其在肿瘤组织中数量极少，但对药物治疗表现出高度的耐受性，易导致脑胶质瘤复发。鉴于此，选择一种对BBB及BTB具有更好跨越能力、对脑肿瘤细胞具有更好亲和能力的靶向分子至关重要。

基于现有技术现状，本申请发明人进一步将已有靶向分子进行了改造，利用分子融合原理，将脑靶向分子与肿瘤靶向分子共价连接成全过程靶向分子，使其拥有对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤生长发展全过程靶向功能。同时，构建全过程靶向分子修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的载药系统，从而更有效地发挥对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的影像诊断和靶向治疗作用。

发明内容

本发明目的是，基于现有技术现状，提供一种全过程靶向分子及其在递药系统构建中的应用。本发明利用分子融合原理，将脑靶向分子与肿瘤靶向分子共价连接成全过程靶向分子，使其拥有对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤生长发展全过程靶向功能。同时，构建全过程靶向分子修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的载药系统，有效地发挥对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的影像诊断和靶向治疗作用。

本发明的具有靶向脑毛细血管内皮细胞(跨BBB)、肿瘤新生血管内皮细胞(跨BTB)、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的全过程靶向分子，由脑靶向分子与肿瘤靶向分子共价连接形成；进一步用全过程靶向分子修饰影像分子、治疗药物、高分子载体材料，构建靶向分子-药物复合物、靶向分子修饰的纳米载药系统，能提高药物对脑、脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊疗效果。

具体的，本发明利用分子融合原理，将脑靶向分子与肿瘤靶向分子通过共价连接制备了全过程靶向多肽分子，使其同时具有两种分子的靶向能力，可发挥靶向脑毛细血管内皮细胞(跨BBB)、肿瘤新生血管内皮细胞(跨BTB)、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的肿瘤尤其是脑部肿瘤生长发展全过程靶向作用。

本发明所涉及的跨血-脑屏障的小分子、多肽分子或蛋白分子等靶向分子包括：对羟基苯甲酸(pHA)及其衍生物，脂肪酸特别是肉豆蔻酸(MC)及其衍生物，D8多肽、WSW多肽、

本发明所涉及的跨血-肿瘤屏障的多肽分子或蛋白分子等靶向分子包括：VAP多肽、cVAP多肽、

本发明所设计的全过程靶向分子可通过在分子中引入活性官能团，构建其修饰的影像分子复合物、治疗药物复合物、高分子载体材料复合物。

本发明所设计的全过程靶向分子引入半胱氨酸后，利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化光学影像分子(如荧光探针分子FITC、FAM、6-TET、5-TAMRA、HEX、6- JOE等，近红外染料如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、IR783、IR820、DiR、DiD、 BIDIPY630/650-X、BIDIPY650/665-X、BIDIPY665/676、TO-PRO-3、TO-PRO-5等，化学发光物质分子luminol、isoluminol、AMPPD、CSPD、CDP-star、光泽精等，拉曼探针分子等)反应而形成复合物。

本发明所设计的全过程靶向分子，与磁共振影像剂(如Gd等磁共振影像用核素的螯合物)、或与放射性核素影像剂(如

本发明所设计的全过程靶向分子修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱和长春瑞滨等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽和抗菌肽等等多肽药物)、或通过共价或非共价连接(涉及利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕妥珠单抗、伊匹单抗、纳武单抗、PD-L1单抗等抗体类药物及其通过基因工程手段改造的抗体片段组合，包括Fab片段、单域抗体、Fv片段、单链抗体、双价小分子抗体、微抗体、纳米抗体等)合成的全过程靶向分子-药物复合物。

本发明所设计的全过程靶向分子引入半胱氨酸后，修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，用于全过程靶向分子修饰的脂质体、胶束、圆盘、纳米粒等纳米载药系统的构建。

本发明所设计的全过程靶向分子引入半胱氨酸后，修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-生物素(PEG-Biotin)等靶向材料上，用于全过程靶向分子修饰的生物膜包被纳米载药系统的构建。

本发明所设计的全过程靶向分子修饰的纳米载药系统，用于包载阿霉素、表阿霉素等蒽环类药物，包载紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛等紫杉烷类药物，包载喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康等喜树碱类药物，包载长春新碱、长春瑞滨等长春碱类药物，包载顺铂、卡铂、奥沙利铂、米铂等铂类药物，包载硼替佐米和卡非佐米等蛋白酶体抑制剂，包载小白菊内酯等内酯类药物，包载曲美替尼、伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、依维莫司、厄洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼、依鲁替尼、瑞戈非尼、威罗非尼、奥拉帕尼等分子靶向药物，包载p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽、抗菌肽等多肽药物，包载利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕妥珠单抗、伊匹单抗、纳武单抗、PD-L1单抗等抗体类药物及其通过基因工程手段改造的抗体片段组合(包括Fab片段、单域抗体、Fv片段、单链抗体、双价小分子抗体、微抗体和纳米抗体等)，包载

本发明所设计的全过程靶向分子修饰的纳米载药系统，用于包载光学影像分子(如荧光探针分子FITC、FAM、6-TET、5-TAMRA、HEX、6-JOE等，近红外染料 Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、IR783、IR820、DiR、DiD、BIDIPY630/650-X、 BIDIPY650/665-X、BIDIPY665/676、TO-PRO-3、TO-PRO-5等，化学发光物质 luminol、isoluminol、AMPPD、CSPD、CDP-star、光泽精等，拉曼探针分子)，包载磁共振影像剂(如Gd等磁共振物质的螯合物)，包载放射性核素影像剂(如

本发明所设计的全过程靶向分子，用于介导药物或纳米载药系统跨越BBB和 BTB，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞，用于脑、脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊断和治疗。

利用本发明提供的方法设计制备了全过程靶向分子pHA-VAP及其修饰的药物复合物和纳米载药系统，其包括：

1、pHA-VAP及其荧光标记物(pHA-VAP-Cy7)的制备

采用固相合成方法制备pHA-VAP；通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成pHA-VAP-Cy7；HPLC、MS表征其结构。

2、pHA-VAP-影像剂的制备

通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了pHA-VAP-DTPA，螯合Gd或

3、pHA-VAP体内外靶向能力的评价

考察pHA-VAP-Cy7对脑毛细血管内皮细胞(BCEC)、脐静脉内皮细胞 (HUVEC)和模型肿瘤细胞(如：脑胶质瘤细胞U87)的体外亲和性。

通过正常小鼠和荷U87皮下移植瘤、U87颅内原位瘤模型裸鼠的尾静脉注射 pHA-VAP-Cy7，考察其在各时间点的动物体内分布。

4、pHA-VAP-药物复合物的制备

引入半胱氨酸后的pHA-VAP与药物上马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物。

引入半胱氨酸后的pHA-VAP与药物上3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨等含羟基或氨基的药物。

pHA-VAP通过修饰上多巴胺进而与药物上硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物。

pHA-VAP通过固相合成直接与多肽药物缩合，其中所涉及药物包括p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物。

pHA-VAP通过随机位点修饰(将抗体中游离氨基活化后与pHA-VAP共价连接) 或定点位点修饰(通过亲和偶联作用将靶向分子与抗体非共价连接)得到靶向功能分子修饰的抗体复合物，其中所涉及药物包括利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕妥珠单抗、伊匹单抗、纳武单抗、PD-L1单抗等抗体类药物及其通过基因工程手段改造的抗体片段组合(包括Fab片段、单域抗体、Fv片段、单链抗体、双价小分子抗体、微抗体、纳米抗体等)。

5、pHA-VAP-阿霉素复合物体内外抗肿瘤效果的评价

连接半胱氨酸后的pHA-VAP与阿霉素上马来酰亚胺己肼衍生物(MAL-DOX)缩合得的pHA-VAP-阿霉素复合物(pHA-VAP-DOX)，以MTT法考察的pHA-VAP- DOX对U87细胞和HUVEC细胞的体外生长抑制效果；通过荷U87颅内原位瘤模型裸鼠的尾静脉给药，以中位生存时间为指标评价其体内抗肿瘤效果。

6、pHA-VAP修饰纳米载药系统的构建与表征

首先制备pHA-VAP修饰高分子材料pHA-VAP-PEG-DSPE、pHA-VAP-PEG- PLA、pHA-VAP-PEG-PLGA、pHA-VAP-PEG-PCL、pHA-VAP-PEG-生物素等。通过 pHA-VAP上引入半胱氨酸，其游离巯基与Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG- PLGA、Mal-PEG-PCL、Mal-PEG-生物素等所含马来酰亚胺反应而实现上述靶向高分子材料制备，即：将Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-PLGA、Mal-PEG- PCL、Mal-PEG-生物素等分别溶解在乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入含巯基pHA-VAP 的PBS(pH8.0)反应制备得到pHA-VAP修饰的高分子材料。

然后构建pHA-VAP修饰的纳米载药系统。一定量的pHA-VAP-PEG-DSPE、 mPEG-DSPE、磷脂和胆固醇，或pHA-VAP-PEG-DSPE和mPEG-DSPE，或pHA-VAP- PEG-PLA和mPEG-PLA，或pHA-VAP-PEG-PLGA和mPEG-PLGA，或pHA-VAP- PEG-PCL和mPEG-PCL，以及一定量上述药物，采用成膜水化等方法，分别构建相应的pHA-VAP修饰脂质体、胶束、圆盘、纳米粒等纳米载药系统；一定量的pHA-VAP- PEG-生物素和预先修饰亲和素的生物膜孵育后，包被载有上述药物的聚合物纳米粒、硅纳米粒、纳米凝胶、纳米晶等纳米载药系统，构建生物膜包被纳米载药系统。激光散射粒度仪表征纳米载药系统粒径及电势，透射电镜表征其形貌特征。

7、pHA-VAP修饰纳米载药系统体内外靶向能力的评价

考察BCEC细胞、肿瘤细胞(U87细胞、4T1细胞)、HUVEC细胞对包载肿瘤治疗药物的pHA-VAP修饰纳米载药系统的摄取情况。

通过荷U87颅内原位瘤模型裸鼠或荷4T1乳腺癌原位模型balb/c小鼠的尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的pHA-VAP修饰纳米载药系统，考察其在各时间点的肿瘤内分布。

8、pHA-VAP修饰纳米载药系统体内外抗肿瘤效果的评价

以MTT法考察包载肿瘤治疗药物的pHA-VAP修饰纳米载药系统对肿瘤细胞 (U87细胞、4T1细胞)和HUVEC细胞的体外生长抑制效果；通过荷U87颅内原位瘤模型裸鼠或荷4T1乳腺癌原位模型balb/c小鼠的尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的pHA-VAP修饰纳米载药系统，以生存时间、肿瘤抑制曲线、肿瘤组织细胞凋亡、新生血管和干细胞数量等为指标评价其体内抗肿瘤效果。

本发明的试验结果表明：制得的pHA-VAP同时具备pHA靶向脑毛细血管而跨 BBB能力，VAP靶向肿瘤新生血管内皮细胞而跨BTB、靶向肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞能力，在模型动物体内具有良好的脑和肿瘤组织靶向能力和影像效果，并表现出更优脑部肿瘤靶向能力；pHA-VAP修饰的药物复合物及纳米载药系统显示出了良好的肿瘤靶向性能和更强的抗脑部肿瘤效果。

表1-多肽靶向分子的氨基酸序列表

附图说明

图1、pHA-VAP-Cys的HPLC和ESI-MS图谱

色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45min5％B-65％B；流速： 0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV214nm，保留时间：16min。ESI-MS：1080.4，与理论分子量相符合。

图2、pHA-VAP-Cy7的HPLC和ESI-MS图谱

色谱方法同上，保留时间：25min。ESI-MS：1750.6，与理论分子量相符合。

图3、原代脑毛细血管内皮细胞BCEC对Cy7标记pHA-VAP的摄取

图为Cy7标记的VAP和pHA-VAP与BCEC细胞孵育4h后流式细胞荧光检测定量(左)和定性(右)结果。可见BCEC细胞对pHA-VAP的摄取明显高于VAP和游离荧光素。

图4、脐静脉内皮细胞HUVEC对Cy7标记pHA-VAP的摄取

图为Cy7标记的VAP和pHA-VAP与HUVEC细胞孵育4h后流式细胞荧光检测定量(左)和定性(右)结果，可见U87细胞对pHA-VAP的摄取明显高于VAP和游离荧光素。

图5、脑胶质瘤细胞U87对Cy7标记pHA-VAP的摄取

图为Cy7标记的VAP和pHA-VAP与U87细胞孵育4h后流式细胞荧光检测定量 (左)和定性(右)结果，可见U87细胞对pHA-VAP的摄取明显高于VAP和游离荧光素。

图6、Cy7标记pHA-VAP在荷U87皮下移植瘤模型小鼠体内组织分布图

由图可见，与游离荧光素和VAP-Cy7相比，4h内pHA-VAP-Cy7在皮下肿瘤中分布提高，24h后蓄积量降低。

图7、Cy7标记pHA-VAP在荷U87脑内原位瘤模型小鼠体内组织分布图

由图可见，与游离荧光素和VAP-Cy7相比，24h内pHA-VAP-Cy7在原位肿瘤中分布提高，说明靶向分子能跨越血-脑屏障及血-脑肿瘤屏障并显著增加药物在脑肿瘤部位的蓄积量。

图8、pHA-VAP-DOX的HPLC和ESI-MS图谱

色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.01％甲酸)，流动相B：纯乙腈；洗脱程序：0-45min5％B-65％B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV214nm，保留时间：17min。ESI-MS：1832.2，与理论分子量相符合。

图9、pHA-VAP-DOX体外抗U87细胞活性曲线

由图可见，U87细胞分别与DOX、MAL-DOX、VAP-DOX或pHA-VAP-DOX孵育72小时后，其IC

图10、pHA-VAP-DOX体外抗HUVEC细胞活性曲线

由图可见，HUVEC细胞分别与DOX、MAL-DOX、VAP-DOX或pHA-VAP-DOX 孵育72小时后，其IC

图11、pHA-VAP-DOX抗U87原位脑胶质瘤生存曲线

图为U87原位脑胶质瘤模型裸鼠的生存曲线。以模型动物中位生存期为指标，与生理盐水(中位生存期26天)、DOX(10mg、20mg、40mg中位生存期分别27、 17、13天，中剂量和高剂量阿霉素毒性大而导致模型裸鼠生存期更短)、pHA-VAP (中位生存期28天)，pHA-VAP-DOX(10mg、20mg、40mg中位生存期分别29、 32、40天)延长模型动物的生存时间，且剂量存在依赖性。

图12、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的纳米递药系统电镜照片

由图可见，卡巴他赛纳米晶(左)呈球形，粒径在80nm左右；pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶(中、右)呈球形，具有明显的核-膜结构，粒径在100nm左右。

图13、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的纳米递药系统粒径表征

由图可见，多西他赛/小白菊内酯纳米共晶粒径在130nm左右，电势为-20mV；经红细胞膜包被后粒径为140nm左右，电势为-25mV；pHA-VAP修饰对所构建的纳米递药系统粒径无明显影响，但因分子本身带正电荷，所修饰纳米递药系统电势升至- 15mV。

图14、脐静脉内皮细胞HUVEC、乳腺癌细胞4T1对pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的摄取

由图可见，HUVEC细胞(左)和4T1细胞(右)对pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的摄取量明显高于游离药组、纳米晶组及无靶脂质膜包被卡巴他赛纳米晶组。

图15、原代脑毛细血管内皮细胞BCEC、脐静脉内皮细胞HUVEC和脑胶质瘤细胞 U87对pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的摄取

由图可见，BCEC细胞(A，B)、HUVEC细胞(C，D)和U87细胞(E，F)对 pHA-VAP修饰红细胞膜包被药物纳米共晶(多西他赛和小白菊内酯)的摄取量明显高于纳米共晶组及无靶红细胞膜包被药物纳米共晶组，与游离药组相当。

图16、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的体外抗HUVEC、4T1细胞活性曲线

由图可见，两种细胞分别与游离卡巴他赛、卡巴他赛纳米晶、脂质膜包被卡巴他赛纳米晶、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶孵育48小时后，显示其对 HUVEC细胞的IC

图17、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的体外抗HUVEC、U87细胞活性曲线

由图可见，两种细胞分别与游离多西他赛/小白菊内酯、多西他赛/小白菊内酯纳米共晶、红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶孵育48小时后，显示其对HUVEC细胞的IC

图18、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶在荷4T1乳腺癌原位瘤模型小鼠体内组织分布图

由图可知，pHA-VAP修饰可显著提升不同时间点脂质膜包被卡巴他赛纳米晶在4T1肿瘤部位的蓄积量，更好地靶向至肿瘤部位。

图19、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶在荷U87原位脑胶质瘤模型小鼠体内组织分布图

由图可知，pHA-VAP修饰可显著提升不同时间点红细胞膜包被药物纳米共晶(多西他赛(上图)和小白菊内酯(下图))在脑胶质瘤部位的蓄积量，更好地靶向至肿瘤部位。

图20、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的抗4T1乳腺癌原位瘤体积变化曲线

图为各组balb/c小鼠肿瘤体积随时间变化的曲线。与PBS组相比，各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。无靶脂质膜包被卡巴他赛纳米晶和pHA-VAP修饰后相比具有显著性差异(n＝6)，pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的体内药效最佳。

图21、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的抗4T1乳腺癌原位瘤瘤重比较图

将balb/c小鼠处死取出肿瘤组织后称重并进行统计分析，pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶组瘤重显著低于其余各组(n＝6)。

图22、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的抗U87原位脑胶质瘤生存曲线

图为各组U87原位脑胶质瘤裸鼠的生存曲线。采用单次尾静脉给药，以模型动物生存期为评价指标(n＝10)。与PBS(中位生存期38天)、游离多西他赛/小白菊内酯(中位生存期40.5天)、红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶(中位生存期 41.5天)相比，pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶小鼠生存时间(中位生存期77天)极显著延长(***p<0.001)。

图23、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶对4T1乳腺癌原位瘤内肿瘤细胞凋亡及新生血管抑制的效果

图为两种细胞分别与游离卡巴他赛、卡巴他赛纳米晶、脂质膜包被卡巴他赛纳米晶、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶的抑制4T1原位瘤新生血管(上图)和促进肿瘤细胞凋亡(下图)的染色照片，其中血管(CD31染色)呈棕红色或棕褐色、凋亡细胞(TUNEL染色)呈绿色。

图24、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶对U87原位脑胶质瘤内肿瘤细胞凋亡、新生血管抑制及肿瘤干细胞杀伤的效果

图为U87原位瘤部位凋亡肿瘤细胞的TUNEL染色(绿)、新生血管的CD31染色 (红)及肿瘤干细胞的CD133染色(红)照片，其中蓝色为细胞核DAPI染色。由图可见，相比于其余三组，pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶可显著促进肿瘤凋亡、抑制新生血管生成并杀伤肿瘤干细胞。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

实施例1

靶向分子、靶向分子-Cys、靶向分子-Cy7的合成与表征

1、靶向分子和靶向分子-Cys的合成与表征

采用固相多肽合成法，设计并合成pHA-VAP多肽(氨基酸序列对羟基苯甲酸- Ahx-Cys-pavrtns；大写字母表示L构型氨基酸，小写字母表示D构型氨基酸)。

具体方法：首先以Fmoc固相多肽合成法合成Cys(Trt)-Acp-4-叔丁基苯甲酸，在PAM-Fmoc树脂上按序列依次接入氨基酸，以HBTU/DIEA为缩合剂、TFA为脱保护剂进行反应。然后用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活侧链羧基，将Boc保护固相肽合成法合成的VAP肽接枝到cys(trt)-acp-4-叔丁基苯甲酸上，95％TFA脱保护得到 pHA-VAP-Cys，多肽粗品用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。HPLC和ESI-MS 表征pHA-VAP-Cys的纯度和分子量(Mw)。pHA-VAP-Cys的HPLC图谱、质谱图见附图1。

2、靶向分子-Cy7的合成与表征

将上述步骤得到的pHA-VAP-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，取Cy7-maleimide溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待pHA-VAP-Cys反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。冷冻干燥得pHA-VAP-Cy7纯品。HPLC图谱、质谱图见附图2。

实施例2

靶向分子的体外细胞靶向性验证

1、靶向分子对原代脑毛细血管内皮细胞BCEC的体外靶向性

4周龄SD大鼠断头后取脑，于预冷D-Hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，滚去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和DNA酶后37℃消化90分钟，1000转/分钟离心8分钟，弃去上清，转移至20％BSA的DMEM溶液中，1000g/分钟4℃离心20 分钟，弃去中上层液体，将底部微血管转移至DMEM培养液中，1000转/分钟离心5 分钟，用含20％胎牛血清的DMEM培养液重悬微血管段，接种于12孔板中，37℃， 5％CO

用含10％FBS的DMEM培养液配制荧光浓度为5μM的荧光标记多肽溶液，将12 孔板中的DMEM培养液吸出，加入药液，37℃孵育4小时，弃去荧光素溶液。用 PBS洗板两次，加入胰蛋白酶消化细胞，用DMEM培养液分散细胞后离心，弃上清， PBS洗涤两次，最后将每孔细胞分散于200μLPBS，流式细胞仪测定。结果见附图 3。

2、靶向分子对脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性

取对数生长期的单层培养的脐静脉内皮细胞细胞(HUVEC细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔 1×10

3、靶向分子对胶质瘤细胞U87的体外靶向性

取对数生长期的单层培养的胶质瘤细胞(U87细胞)，同上实验。流式细胞仪分析结果见附图5。

实施例3

靶向分子的体内靶向性验证

1、pHA-VAP-Cys在荷U87皮下移植瘤模型裸鼠体内组织分布检测

构建U87皮下移植瘤模型。分别尾静脉注射同等剂量的荧光素标记的pHA-VAP 多肽，分别在注射后30min和1、4、24h时处死老鼠，取血、心、肝、脾、肺、肾、脑和肿瘤，称重，加入1mL蒸馏水，组织匀浆，经酶标仪测量，荧光定量。结果见附图6。

2、pHA-VAP-Cys在荷U87原位脑胶质瘤模型裸鼠体内组织分布检测

将对数生长期的U87细胞重悬于适量的PBS溶液中，细胞浓度为1.3×108/mL。用8％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉裸鼠，固定于脑立体定位仪上，于脑纹状体区域注射 5μL的U87细胞悬液，构建成U87原位脑胶质瘤模型。分别尾静脉注射同等剂量的荧光素标记的pHA-VAP多肽，分别在注射后30min和1、4、24h时处死老鼠，取血、心、肝、脾、肺、肾、脑和肿瘤，称重，加入1mL蒸馏水，组织匀浆，经酶标仪测量，荧光定量。结果见附图7。

实施例4

靶向分子-药物复合物的制备

以pHA-VAP-阿霉素复合物制备作为靶向分子连接含酮或醛基药物的实施例。9.4mg巯基化pHA-VAP溶于磷酸盐3mL缓冲液(0.1mM，pH7.4)，加入等摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h。反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得pHA-VAP-阿霉素复合物。HPLC图谱、质谱图见附图8。

以pHA-VAP-紫杉醇复合物作为靶向分子以二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入39.99mgDCC及 60.4mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50:1-15:1，V/V洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物。紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mLDMF中，1.5倍摩尔量的pHA- VAP-Cys溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至巯基多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得多肽-紫杉醇复合物。

以pHA-VAP-硼替佐米复合物作为靶向分子连接含硼酸基团药物的实施例。依照pHA-VAP的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以 HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h。树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得多肽-多巴胺衍生物。在pH7.4的缓冲液中，pHA-VAP-多巴胺衍生物与硼替佐米以摩尔比1:1混合即得pHA-VAP-硼替佐咪复合物。

以pHA-VAP-PMI融合多肽作为靶向分子连接多肽药物的实施例。直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定pHA-VAP-PMI多肽序列后，按与制备pHA-VAP 相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得pHA-VAP-PMI融合多肽。

实施例5

靶向分子修饰纳米递药系统的体外药效学试验

1、pHA-VAP-DOX对胶质瘤细胞U87的体外药效试验

取对数生长期的U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，细胞悬浮于含10％FBS的DMEM培养液中，以每孔3000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔体积0.2mL，留出三孔加不含细胞的培养液作为空白孔，二氧化碳培养箱内培养24小时。用细胞培养液将各组药物依次六倍稀释。吸去96孔板内细胞培液，各孔加入200μL系列浓度的药液。每个浓度均设三复孔，留出三个仅加入培养液的孔作为对照孔。培养72小时后在实验孔、对照孔和空白孔中加入MTT试剂(5mg/mL) 20μL孵育4小时，弃去孔内培养液，每孔加入二甲亚砜150μL，振荡使生成的蓝紫色结晶充分溶解后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度(A)，按照以下公式计算细胞存活率：

存活率＝(A

用GraphPadPrism软件将存活率对药物浓度对数值做图(附图9)，计算半数抑制浓度(IC

2、pHA-VAP-DOX对脐静脉内皮细胞HUVEC的体外药效试验

取对数生长期的HUVEC细胞，同上试验。结果见附图10.

实施例6

靶向分子修饰药物复合物的体内药效学试验

构建U87原位瘤动物模型后第7天，将鼠随机分为8组，每组10只，每隔两天尾静脉注射DOX、pHA-VAP-DOX、pHA-VAP和生理盐水，阿霉素总剂量分别为 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg，多肽换算成pHA-VAP-DOX40mg/kg复合物中多肽的量。记录各组裸鼠生存时间，绘制生存曲线(附图11)。

实施例7

靶向分子修饰纳米递药系统的制备及表征

1、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶体的制备

pHA-VAP-PEG-DSPE通过pHA-VAP-Cys的游离巯基与Mal-PEG-DSPE所含马来酰亚胺的反应合成。称取4mg的卡巴他赛及适量的表面活性剂TPGS于25ml茄形瓶中，加入适量二氯甲烷溶解后成膜水化，制备得到分散性良好的卡巴他赛纳米晶。将适量脂质体膜材(摩尔量比：HSPC:Chol:DSPE-PEG2000＝50:45:5)旋干，加入纳米晶溶液于65℃条件下水化磷脂膜，探头超声10min(120W)。醋酸铀负染色电镜法观察形态，结果见附图12。

2、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的制备

取雄性ICR小鼠全血，1000g/分钟4℃离心5分钟，弃去上层血清与白细胞层，用1×PBS洗涤下层红细胞后在0.25×PBS中4℃重悬30分钟，15000g/分钟4℃离心7 分钟去除血红蛋白，所得到的浅红色红细胞膜重悬并保存于双蒸水中，以BCA试剂盒检测其膜蛋白浓度；称取4mg的多西他赛、1.2mg小白菊内酯及适量的表面活性剂 F127于25mL茄型瓶中，加入适量甲醇溶解成膜水化，制备得到分散性良好的多西他赛/小白菊内酯纳米共晶；将40μL链霉亲和素-PEG

实施例8

靶向分子修饰纳米递药系统的体外靶向性

1、脐静脉内皮细胞HUVEC、乳腺癌细胞4T1对pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶体的摄取试验

HUVEC、4T1细胞铺板方法如上，用含10％FBS的DMEM培养液配制相应浓度的两种细胞分别与游离卡巴他赛、卡巴他赛纳米晶、脂质膜包被卡巴他赛纳米晶、 pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶，将12孔板中的DMEM培养液吸出，加入药液，37℃孵育4小时，弃去药液。PBS溶液洗板两次，加入胰蛋白酶消化细胞，用 DMEM培养液分散细胞后计数，离心，弃上清，PBS洗涤两次，最后将每孔细胞分散于100μLPBS，超声破碎细胞后加入3倍体积甲醇沉淀蛋白，10000rpm离心10min后取上清，HPLC测定药物含量。结果见附图14。

2、原代脑毛细血管内皮细胞BCEC、脐静脉内皮细胞HUVEC、胶质瘤细胞U87对 pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的摄取试验

BCEC细胞提取方法及HUVEC、U87细胞铺板方法如上，用含10％FBS的 DMEM培养液配制相应浓度的游离多西他赛/小白菊内酯、多西他赛/小白菊内酯纳米共晶、红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶，将12孔板中的DMEM培养液吸出，加入药液，37℃孵育1小时，弃去药液。PBS溶液洗板两次，加入胰蛋白酶消化细胞，用DMEM培养液分散细胞后计数，离心，弃上清，PBS洗涤两次，最后将每孔细胞分散于100μL PBS，超声破碎细胞后加入3倍体积甲醇沉淀蛋白，10000rpm离心10min后取上清， HPLC测定药物含量。结果见附图15。

实施例9

靶向分子修饰纳米递药系统的体内靶向性验证

1、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶体在荷4T1原位乳腺癌模型裸鼠体内组织分布检测

构建4T1原位乳腺癌模型。分别尾静脉注射同等剂量的游离卡巴他赛、卡巴他赛纳米晶、脂质膜包被卡巴他赛纳米晶、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶，分别在注射后2、12及24h时处死老鼠，取血、心、肝、脾、肺、肾、脑和肿瘤，称重，加入1mL蒸馏水，组织匀浆，萃取，HPLC定量(附图16)。

2、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶在荷U87原位脑胶质瘤模型裸鼠体内组织分布检测

构建U87原位脑胶质瘤模型。分别尾静脉注射同等剂量的度的游离多西他赛/小白菊内酯、红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶，分别在注射后2及12h时处死老鼠，取血、心、肝、脾、肺、肾、脑及脑肿瘤，称重，加入1mL蒸馏水，组织匀浆，以甲基叔丁基醚萃取两次，挥干，甲醇复溶后进行HPLC定量(附图17)。

实施例10

靶向分子修饰纳米递药系统的体外药效学试验

1、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶体的体外药效试验

取对数生长期的HUVEC细胞或4T1细胞，同上实验。结果如附图18。

2、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的体外药效试验

取对数生长期的HUVEC细胞或U87细胞，同上实验。结果如附图19。

实施例11

靶向分子修饰纳米递药系统的体内药效学试验

1、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶体的体内药效学试验

构建的4T1原位乳腺癌动物模型。待肿瘤大小为100mm

V

给药20天后，断颈处死所有balb/c小鼠，取下皮下肿瘤称重，并计算各组统计学差异(附图21)。

2、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的体内药效学试验

构建U87原位脑胶质瘤动物模型。种瘤10天后分别尾静脉注射PBS(pH7.4)、度的游离多西他赛/小白菊内酯、红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶、pHA- VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶。多西他赛总给药剂量为 25mg/kg，小白菊内酯给药总剂量为6mg/kg，单次给药。记录裸鼠生存时间(附图 22)。

3、pHA-VAP修饰脂质膜包被卡巴他赛纳米晶体的促凋亡和新生血管抑制检测

荷瘤balb/c小鼠在给药完成后的第2天，处死取出瘤组织进行固定，作石蜡切片或作冰冻切片，通过CD31染色检测新生血管抑制情况，或通过TUNEL染色检测凋亡促进情况。结果见附图23。

4、pHA-VAP修饰红细胞膜包被多西他赛/小白菊内酯纳米共晶的促凋亡、新生血管抑制和肿瘤干细胞杀伤检测

荷瘤裸鼠在给药完成后的第10天，处死取出瘤组织进行固定，作冰冻切片，通过TUNEL染色、CD31及CD133抗体染色检测凋亡促进、新生血管抑制及肿瘤干细胞杀伤情况。结果见附图24。