用于除皱的细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞制剂技术领域，尤其涉及用于除皱的细胞制剂及其制备方法。

背景技术

目前除皱的办法有多种，局部外用的化妆品效果不明显、玻尿酸等医用注射物填充效果短暂。近年来，皮肤成纤维细胞注射除皱技术在美容医学界取得极大的成功。该技术优点在于使皮肤真皮层的厚度和密度增加，舒展皱纹，填平凹陷，恢复皮肤的弹性和光泽，形态自然，效果长久。但该技术所用的皮肤成纤维细胞为成体细胞，在培养过程中容易老化，导致治疗效果不佳。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了用于除皱的细胞制剂及其制备方法，该细胞制剂具有提高真皮层细胞厚度、改善局部细胞活力、修复表皮损伤细胞、去除皱纹色斑、作用长久等功效。

本发明提出的用于除皱的细胞制剂的制备方法，方法步骤如下：

S1：干细胞的制备；

S2：皮肤成纤维细胞的制备；

S3：将S1制备的干细胞与S2制备的皮肤成纤维细胞按细胞数比1:5-15比例混合，用无酚红的DMEM培养基配成注射液，用于面部除皱。

优选地，所述S1中干细胞制备的方法步骤如下：

S11：将分娩时得到的胎盘用含有抗生素的生理盐水进行清洗，并剪取母胎交接面底蜕膜部位组织；

S12：将S11中剪取的组织用含有抗生素的生理盐水漂洗干净后剪碎，加入含胰酶浓度0.1％的D-Hank's液10mL消化；

S13：向S12的消化混合液中加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

S14：将终止消化后的混合液离心，弃去上清液，并用含10％胎牛血清的 DMEM培养基重悬细胞，放入培养箱培养，并将培养完成的干细胞冻存。

优选地，所述S12中消化的温度为37℃，时间4-6h。

优选地，所述S13中离心时间8-12min，转速1200-1800rpm。

优选地，所述S2中皮肤成纤维细胞制备的方法步骤如下：

S21：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10-20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；

S22：将剪碎后的组织加入37℃预热的含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

S23：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，重悬至3-15ml作为原代细胞，后转移至培养皿培养，得到P

S24：将P

优选地，所述S22中复合酶包含如下重量份原料：dispase酶0.1-5份、DNA 酶0.2-2份、胶原酶Ⅱ0.1-3份、胶原酶Ⅳ0.1-3份、透明质酸酶0.1-3份。

优选地，所述S23中离心的条件为：时间3-5min、转速1200-1800rpm。

优选地，所述S23中培养的条件为：温度37℃、5％CO

优选地，所述S23中细胞培养液为包含B-27、bFGF和EGF的DMEM/F12 培养基；所述B-27、bFGF和EGF的质量比为0.3-0.7:1:1-1.5。

本发明提出的上述方法制备的用于除皱的细胞制剂。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

(1)本发明的细胞制剂具有提高真皮层细胞厚度、改善局部细胞活力、修复表皮损伤细胞、去除皱纹色斑、作用长久等功效。

(2)本发明利用自体干细胞和自体成纤维细胞混合注射的方法，提高细胞注射后存活和增殖效率，使美容效果得到提升。此外，采用上述方法能够减缓皮肤成纤维细胞的老化，从而提高治疗效果。

(3)本发明的皮肤成纤维细胞通过采用混合酶(其中包括dispase酶、DNA 酶、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶)消化的方式，在摇床37℃、80rpm震荡仅30分钟后，即可实现目标细胞之间、目标细胞与杂细胞或纤维等等之间的分离。此外采用本申请的复合酶能够完全将组织消化，节省了过滤步骤。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1

本发明提出的用于除皱的细胞制剂的制备方法，方法步骤如下：

S1：干细胞的制备

S11：将分娩时得到的胎盘用含有抗生素的生理盐水进行清洗，并剪取母胎交接面底蜕膜部位组织；

S12：将S11中剪取的组织用含有抗生素的生理盐水漂洗干净后剪碎，加入含胰酶浓度0.1％的D-Hank's液10mL消化，温度为37℃，时间4h；

S13：向S12的消化混合液中加入3ml含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

S14：将终止消化后的混合液离心，离心时间8min，转速1200rpm，弃去上清液，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，放入培养箱培养，细胞铺满80％后传代培养，细胞数达到1×10^8时，将细胞冻存，5×10^6/支。

S2：皮肤成纤维细胞的制备

S21：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.1mm

S22：取0.5ml dispase酶、1.0ml DNA酶、0.5ml胶原酶Ⅱ、0.5ml胶原酶Ⅳ、 1.0ml透明质酸酶混合，加入Hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；

S23：将剪碎后的组织加入7ml含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

S24：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1500rpm:，弃上清；

S25：将所得细胞沉淀加入包含有20ng/ml B-27、30ng/ml bFGF和35ng/ml EGF的DMEM/F12培养液，重悬至5ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％CO

S26：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将P

S3：将S1制备的干细胞与S2制备的皮肤成纤维细胞按细胞数比1:5比例混合，用无酚红的DMEM培养基配成注射液5ml，用于面部除皱。

实施例2

本发明提出的用于除皱的细胞制剂的制备方法，方法步骤如下：

S1：干细胞的制备

S11：将分娩时得到的胎盘用含有抗生素的生理盐水进行清洗，并剪取母胎交接面底蜕膜部位组织；

S12：将S11中剪取的组织用含有抗生素的生理盐水漂洗干净后剪碎，加入含胰酶浓度0.1％的D-Hank's液10mL消化，温度为37℃，时间6h；

S13：向S12的消化混合液中加入3ml含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

S14：将终止消化后的混合液离心，离心时间12min，转速1800rpm，弃去上清液，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，放入培养箱培养，细胞铺满80％后传代培养，细胞数达到1×10^8时，将细胞冻存，5×10^6/支。

S2：皮肤成纤维细胞的制备

S21：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.2mm

S22：取1.0ml dispase酶、0.5ml DNA酶、0.7ml胶原酶Ⅱ、1.5ml胶原酶Ⅳ、 0.3ml透明质酸酶混合，加入Hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；

S23：将剪碎后的组织加入10ml含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

S24：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1500rpm (加速度9，减速度5)，弃上清；

S25：将所得细胞沉淀加入包含有15ng/ml B-27、30ng/ml bFGF和40ng/ml EGF的DMEM/F12培养液，重悬至7ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％CO

S26：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将P0代细胞接种至4个T75培养瓶中。培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到80％以上，收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率(得到2.1*10^7数量的成纤维细胞，活性为96.4％)。

S3：将S1制备的干细胞与S2制备的皮肤成纤维细胞按细胞数比1:15比例混合，用无酚红的DMEM培养基配成注射液5ml，用于面部除皱。

实施例3

本发明提出的用于除皱的细胞制剂的制备方法，方法步骤如下：

S1：干细胞的制备

S11：将分娩时得到的胎盘用含有抗生素的生理盐水进行清洗，并剪取母胎交接面底蜕膜部位组织；

S12：将S11中剪取的组织用含有抗生素的生理盐水漂洗干净后剪碎，加入含胰酶浓度0.1％的D-Hank's液10mL消化，温度为37℃，时间5h；

S13：向S12的消化混合液中加入3ml含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

S14：将终止消化后的混合液离心，离心时间10min，转速1500rpm，弃去上清液，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，放入培养箱培养，细胞铺满80％后传代培养，细胞数达到1×10^8时，将细胞冻存，5×10^6/支。

S2：皮肤成纤维细胞的制备

S21：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.3mm

S22：取0.2ml dispase酶、0.8ml DNA酶、1.5ml胶原酶Ⅱ、1.0ml胶原酶Ⅳ、0.5ml透明质酸酶混合，加入Hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；

S23：将剪碎后的组织加入14ml含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

S24：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1800rpm (加速度9，减速度5)，弃上清；

S25：将所得细胞沉淀加入包含有10ng/ml B-27、30ng/ml bFGF和30ng/ml EGF的DMEM/F12培养液，重悬至10ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％CO

S26：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将P0代细胞接种至4个T75培养瓶中。培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到80％以上，收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率(得到2.6*10^7数量的成纤维细胞，活性为96.8％)。

S3：将S1制备的干细胞与S2制备的皮肤成纤维细胞按细胞数比1:9比例混合，用无酚红的DMEM培养基配成注射液5ml，用于面部除皱。

本发明制备的细胞制剂具有以下特点：安全，由于采用自体细胞治疗，不会出现免疫排斥、过敏等不良事件，因而具有良好的安全性；持久，自体的干细胞和成纤维细胞回输至自体皮肤皱纹、凹陷性部位，因形成了自体组织而一直存活，使得效果长久；健康，不破坏或刺激肌肤病理性改变来除皱，也不是异物填充，它是通过自然地增强皮肤功能来达到治疗目的，因而属于生理性除皱；自然，不影响受术者的面部表情肌和韧带，新生的健康皮肤细胞恢复了细胞的弹性，降低了表皮的色素沉积，提高了皮肤的白嫩度、光洁度和细腻度，使皮肤光滑、丰满有弹性，表情形态自然和谐。

以实施例3制备的细胞制剂为例，进行验证性试验，将配成的5ml注射液注射到皮下组织，每15天注射一次，注射三次后即能够将皮肤皱纹基本消除或明显减轻，且效果持久。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。