提高母牛双胎率的方法

技术领域

本发明涉及哺乳动物胚胎移植技术领域，特别涉及一种提高母牛双胎率的方法。

背景技术

胚胎移植，又称受精卵移植，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。相关技术中，多胎的妊娠母牛容易流产且产下的犊牛弱小而难与养活，繁殖效率和效果都较差。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种提高母牛双胎率的方法，旨在提高母牛胚胎移植的成功率和效率。

为实现上述目的，本发明提出的提高母牛双胎率的方法的步骤包括：

授精：对供体牛进行超数排卵处理，并进行人工授精；

采卵：对所述供体牛进行消毒灭菌处理，采用灌流法提取受精卵，将提取的所述受精卵静置培养；

胚胎选择：静置培养的所述受精卵培养得到胚胎，按预设条件挑选两个所述胚胎，并将挑选的两个所述胚胎进行鲜胚移植；

受体牛预处理；对所述受体牛进行移植前护理、预埋孕酮栓以及同期发情处理，以使所述受体牛和所述供体牛的发情日差小于等于1天；

移植：挑选两枚所述胚胎，并将所述胚胎移植于所述受体牛的子宫内，观察妊娠反应；

生产：对妊娠的所述受体牛进行饲养管理直至生产。

优选地，在所述授精的步骤中，所述超数排卵处理的步骤包括：

在所述供体牛预埋孕酮栓后的9天至13天后以预设频率肌肉注射促卵泡激素，并在所述供体牛肌肉注射促卵泡激素后的第3天后同时肌肉注射前列腺素，所述前列腺素的质量范围为2.0mg～2.4mg。

优选地，在所述超数排卵处理的步骤中，所述预设频率为，早晚各一次，时间间隔12h-14h。

优选地，在将提取的所述受精卵静置培养的步骤之前还包括：

将同一供体牛的受精卵置于同一培养皿内，并对所述受精卵清洗除杂。

优选地，在所述胚胎选择的步骤中，所述预设条件包括形态、色调、分裂球大小、均匀度、细胞密度、透明带间障以及变性情况。

优选地，在胚胎选择步骤之后还包括胚胎封存步骤，所述胚胎封存步骤包括：

使用吸管依次吸入保存液、气泡、含有所述胚胎的冷冻液、气泡、保存液，对吸管加热封口。

优选地，在所述受体牛预处理的步骤中；

所述受体牛的年龄在3岁～8岁、繁殖性能正常，产后60天以上并有2次以上的正常自然发情记录，无两次以上人工受精未孕的记录。

优选地，在所述受体牛预处理的步骤中，所述受体牛的配对数量和所述供体牛的配对数量为3：1。

优选地，在所述移植的步骤中，所述受体牛发情时的卵泡直径范围值为10mm～20mm，发情后36小时内出现排卵状况。

优选地，在将挑选的所述胚胎移植于所述受体牛的子宫内的步骤包括：

将所述受体牛保定，肌肉注射2％静松灵，使用移植器进行胚胎移植。

本发明技术方案中提高母牛双胎率的方法的步骤包括：授精、采卵、胚胎选择、受体牛预处理、移植、生产等步骤，本发明中使用优良种牛作为供体牛，通过超数排卵处理的方法获取多枚胚胎，再利用其他母牛作为受体牛，生产良种牛的后代，可以数倍的提高优良种牛的后代，加快优良种牛的扩繁速度，同时通过采用双胚胎移植的方法提高母牛的双胎率，增加了母牛一年生产两头牛犊的概率，提高母牛的繁殖率，保证牛犊产出的健康程度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明提高母牛双胎率的方法一实施例的流程图；

图2为授精步骤的流程时间分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参照图1，本发明提出一种提高母牛双胎率的方法。

在本发明实施例中，该提高母牛双胎率的方法，所述提高母牛双胎率的方法的步骤包括：

S10：授精：对供体牛进行超数排卵处理，并进行人工授精；

授精的具体步骤包括：

S11：供体牛的选择。可以根据选择需要繁殖的牛品种的母牛作为供体牛，供体牛应当具有较高的生产性能，供体牛的年龄一般为3～8岁，青年供体母牛在18月龄左右，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常，发情周期正常，膘情良好。

S12：供体牛的饲养管理：供体牛在进行超数排卵处理前，要保证给供体牛足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及维生素和矿物质，并供给清洁的饮水和盐，做到合理饲养，精心管理。

S13：超数排卵处理：在所述供体牛预埋孕酮栓后的9天至13天后取出预埋的孕酮栓，并以预设频率通过肌肉注射的方式注射促卵泡激素(FSH follicle-stimulatinghormone)，该预设频率为早晚各一次，时间间隔12h-14h，分4天减量注射，并在所述供体牛肌肉注射促卵泡激素的第3天后以所述预设频率同时肌肉注射前列腺素(PGprostaglandin)，所述前列腺素的质量范围为2.0mg～2.4mg。

S14：发情观察和人工授精：PGF2α处理后40h～48h，大部分处理过的供体牛开始发情，此时要求从肌肉注射PGF2α第2天傍晚开始观察供体牛的发情情况，至少早晚各观察一次，在观察到供体牛接受爬跨后4h～6h进行第一次人工授精，间隔12h后第二次人工授精，人工授精的用加倍量，注意人工授精时还得触摸供体牛的卵巢。

请参见图2，在本发明的一实施例中，供体牛在预埋孕酮栓后的第9天开始注射FSH，则在第11天取出预埋的孕酮栓，并开始注射PGF2α，直至第12天后停止注射FSH，并在第13天后对供体牛进行发情观察，在第14天后开始进行人工授精处理，在第20天开始采集胚胎。

S20：采卵，对所述供体牛进行消毒灭菌处理，采用灌流法提取受精卵，将提取的所述受精卵静置培养，其中采卵具体包括如下步骤：

S21：采卵时间，以供体牛发情日为第0天，在第5天～6天检查卵巢确定黄体数，以便于安排受体牛头数，第7天非手术回收卵。

S22：器械和冲卵液的准备：灭菌处理过的冲卵管用磷酸缓冲盐溶液(PBSphosphate buffer saline)液冲洗2～3次，插入钢芯，检查气球。将PBS液置于37℃水浴中预温待用，准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉和冲洗消毒剂等。

S23：供体牛的保定和麻醉供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间用酒精消毒，用3ml～5ml的2％普鲁卡因作硬膜外麻醉。

S24：供体牛消毒灭菌处理：麻醉后将供体牛的牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。

S25：灌流法提取受精卵，冲卵管的插入和冲卵部位：将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手食指和拇指扒开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持30ml注射器一次推入10ml空气，然后按术者要求，以1ml计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年供体牛充气约14ml～16ml，经产供体牛约18ml～25ml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。用50ml注射器，每次注入30ml～50ml的PBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖集卵杯。另一侧子宫角的冲洗是由术者右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲洗。

S26：术后处理两侧子宫角冲卵完成后，将冲卵管抽出来，用输精枪将土霉素溶液，该土霉素溶液由3g土霉素粉溶于100ml灭菌双蒸水或生理盐水配比而成，或是将10ml青霉素和链霉素注入子宫，最后肌肉注射PGF2α亦可。

S30：胚胎选择：静置培养的所述受精卵培养得到胚胎，按预设条件挑选两个所述胚胎，并将挑选的两个所述胚胎进行鲜胚移植；其中，在该步骤中，具体包括：

S31：过滤集卵杯法，回收结束后，用注射器冲洗滤网2～3次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜下检查。

S32：在静置培养之前，将同一供体牛的受精卵置于同一培养皿内，并对所述受精卵清洗除杂。其中，清洗除杂的具体步骤为：用玻璃棒清除受精卵外围的粘液、杂质。用吸管将受精卵移至培养皿的液滴内，同一供体牛的受精卵放于同一液滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的PBS保存液到第一液滴，吸入全部受精卵，防止吸入黏液、杂质，移到第二液滴，依次冲洗受精卵3～5次。

S33：胚胎的鉴定和选择：在40～50倍实体解剖镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间障以及变性情况等，在本实施例中将胚胎的分级分为A、B、C三个等级。

具体地，设定A级胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。B级轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占10％～30％。C级轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30％～50％。胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。发情后第7天回收的受精卵在正常发育时应入于致密桑椹胚到囊胚阶段。凡在16细胞以下受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外，A、B等级的胚胎可用于鲜胚移植。即可以挑选两个A、B等级的胚胎可用于鲜胚移植。

S34：胚胎封存：使用吸管依次吸入保存液、气泡、含有所述胚胎的保存液、气泡，对吸管加热封口。即，将A、B等级的胚胎用0.25ml塑料吸管按以下顺序吸入，保存液、气泡、含有胚胎的保存液、气泡，加热封口，每枚胚胎装一支吸管。

S35：胚胎观察：用特制塑料吸管观察镜或显微镜的目镜，通过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的形态和位置，确认后用70％酒精棉球消毒并切除吸管上层1cm，切口要平整，可直接用于鲜胚移植。

S40：受体牛预处理；对所述受体牛进行移植前护理、预埋孕酮栓以及同期发情处理，以使所述受体牛和所述供体牛的发情日差小于等于1天，具体地，该步骤包括：

S41：受体牛的选择，选择年龄在3岁～8岁，健康，无疾病，体格较大，膘情好，繁殖性能正常，产后60天以上，并有两次以上的正常自然发情记录，泌乳性能好，无难产史，不使用两次人工受精未孕的牛。

S42：受体牛的饲养管理，做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。组成一定数量的牛群，圈舍内防止过挤，以便于发情观察。长期舍饲的受体牛要注意加强运动。防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应激反应。

S43：受体牛的同期发情处理，受体牛的数量和供体牛的数量按3：1的比例配对，即对一头供体牛进行超数超卵，同进要对3头的受体牛进行同期发情处理。受体牛与供体牛同一天埋孕酮栓，埋孕酮栓后的第11天注射2.0mg～2.4mgPGF2α，撤出孕酮栓。受体牛的超数排卵处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。

S44：发情观察，原则上根据受体牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察30min发情情况。对发情的受体牛需做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。若在发情后36小时以后排卵的牛不能用作受体牛。

S45：供体牛、受体牛的发情日差，移植胚胎时，如果供体牛和受体牛的发情周期不一致，则难以受胎。要求两者的子宫环境一致。受体牛与供体牛发情日差小于等于1天。

S50：移植：将挑选的所述胚胎移植于所述受体牛的子宫内，观察妊娠反应；该步骤具体包括：

S51：待移植受体牛的检查，要求受体牛发情时直检的卵泡直径在10mm～20mm左右，发情后36小时内出现排卵。移植前一天直检黄体，其径在11mm～15mm以上，黄体的手感弹性好，质地软而充实。

S52：按胚胎发育情况选受体牛的发情日差，将致密桑椹胚移植给发情6天的受体牛，将早期囊胚移植给发情7天的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情8天的受体牛。如生产的胚胎多于受体牛的数量，多出来的胚胎可用于冷冻保存；如生产出来的胚胎数量不够，可用部分保存的冷冻胚胎用于移植受体牛。

S53：器械准备，先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用锡纸包扎好，高压消毒。移植时，先用70％酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套，即可用于移植。

S54：受体牛的准备，将受体牛保定，清除粪便，肌注2％静松灵或用2％的普鲁卡因3ml在受体牛第一、二尾椎间硬膜破外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。

S55：移植方法，术者用左手扒开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手无名指和中指夹住移植枪，拇指和食指将软外套往外拉，用移植枪捅破外套，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。用同样的方法移植另一枚胚胎移植到另一侧的子宫角。

S60：生产，对妊娠的所述受体牛进行饲养管理直至生产。

S61：妊娠诊断，通常在移植后三个月开始检查。妊娠90天时，子宫继续增大，落入腹腔，可感觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁可触到子叶，即可确定有胎。

S62：供体牛生产，供体牛按妊娠母牛进行饲养管理，到产犊期后根据产犊情况统计双胎率。

采用本发明的提高母牛双胎率的方法可提高母牛的双胎率，增加了母牛一年生产两头牛犊的概率，提高母牛的繁殖率，并且由于采用的是胚胎移植的方法，用优良种牛作为供体，通过超数排卵的方法获取多枚胚胎，再利用其他母牛作为受体，生产良种牛的后代，可以数倍的提高优良种牛的后代，加快优良种牛的扩繁速度，再者本方法将性控冻精对供体牛进行人工授精，可根据生产需要控制犊牛后代的性别，例如，育肥牛场需要公牛犊，可用Y精子进行人工授精，用于生产公牛犊，奶牛场需要的母牛犊，可用X精子进行人工授精，用于生产母牛犊，以此提高生产效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。