一种快速无创的基因型鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种基因型鉴定方法。

背景技术

随着基因编辑技术的发展，敲除或插入的基因片段越来越大、人为改造的基因结构越来越复杂，因此对小鼠基因组DNA模板的质量要求也随之提高。过去为了快速得到基因型结果，采用简单的碱变性快速抽提DNA方法，可以应付一些短片段的PCR鉴定。但这样获得的DNA比较“脏”，很容易发生鉴定不出结果的情况。当前常用的基因型鉴定方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)+凝胶电泳，PCR+酶切或测序，它们具有如下缺点：

1.需要对模式生物组织进行取样，对生物会造成创伤。

2.鉴定周期较长，步骤较多较为繁琐，前期还要设计制备生物例如小鼠基因型鉴定引物。

3.操作时易发生样品污染现象，通常需要专业人员来操作。

4.需要购买相关试剂盒，有较高的经济消耗。

拉曼光谱技术是一种分子散射光谱技术，具有快速、灵敏和无损检验的特点，近些年来在许多领域得到了广泛的应用。拉曼光谱技术主要是借助物质分子的振动谱峰来识别物质的不同成分，因为不同的物质其分子结构不同，因此其振动谱峰也会有所不同，而振动谱峰的位置可以非常灵敏地反映出不同物质的成分变化。应用拉曼光谱技术还可以对被检客体的物质成分进行定量分析，即通过测定振动谱峰所涵盖的曲线积分面积大小来分析被检客体中所含物质组分的含量多少。因此，应用拉曼光谱技术可以实现对物质成分的识别及定量的分析。

釉质是牙冠最表层的硬组织，其主要成分为碳酸钙、磷酸钙，还含有氟和一些有机质，釉质形成相关基因在釉质的发育中起着重要作用，釉质的脱矿与基因缺陷发生直接相关。基于这些理论基础，本发明研究基因型与釉质矿化程度之间的关系，并进一步延伸到骨头等生物体内会发生矿化的其他结构，提出一种新的基因型鉴定方法。

发明内容

本发明的发明目的是，提供一种快速无创的基因型鉴定方法。

本发明的发明目的通过如下技术方案实现：一种快速无创的基因型鉴定方法，所述基因指缺陷会导致生物体的矿化程度变化的基因，该方法包括如下步骤：

1)利用拉曼光谱技术对不同基因型生物体某结构的矿化程度进行测定，通过主成分分析(PCA)对拉曼光谱结果进行分类画群；

2)采集待鉴定生物体相应结构的拉曼光谱，利用主成分分析(PCA)对其拉曼光谱结果进行分类，根据所属类别确定待鉴定生物体的基因型。

所述基因包括Dlx2，amelogenin，enamelin，laminin 5α3，cytokeratin 5，Dspp，Dlx1，DLx2，Msx2，Msx1，MMP20，Wdr72，Runx2，Bmp，Pitx2，FGFs等。

所述结构为釉质、骨头等生物体内会发生矿化的结构。

检测的为牙龈覆盖区域的釉质，以减少误差。

进行主成分分析选取的波段范围为400-1550cm

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

相比现有常用的基因型鉴定方法，本发明基因型鉴定方法，首先，快捷，不需要繁琐的步骤，其次，不需要对生物体进行取样等操作，不会造成生物体损伤，再次，不需要购买试剂盒，有利于节省经济开销，另外，还不存在样品易受污染等问题，对操作人员要求低。

附图说明

图1为牙釉质拉曼光谱扫描结果显示图；

图2为利用主成分分析(PCA)对釉质拉曼光谱结果进行分类判别的结果显示图；

图3、4、5分别为小鼠头骨、股骨、胫骨拉曼光谱扫描结果显示图。

具体实施方式

试验1

1.使用生理盐水或清洗液对生物体的矿化部分——牙齿釉质表面清洗三遍，使之不存在其他异物，然后使用纯净水进一步清洗三遍。

2.使用拉曼光谱仪对不同Dlx2基因型(主要包括野生型：Dlx2+/+，杂合子：Dlx2+/-，纯合子：Dlx2-/-)的小鼠牙齿侧面釉质进行检测，每个样本采集三次，拉曼光谱仪激发光源采用785nm激光，曝光时间为1秒。

3.扫描结果如图1所示，结果显示：在搪瓷的光谱线上，430、585、960、1070和1300cm

本实施例选取的波段范围为400-1550cm

另外，需要注意的是，检测的釉质应该尽量选择牙龈覆盖区域，以减少误差。

4.对不同基因型釉质的拉曼光谱扩大群体判别分类分析。

5.利用主成分分析方法进行判别(选取的波段范围为400-1550cm

由上可见，采集相对应的拉曼光谱(不同基因型釉质拉曼光谱)，进行PCA数据分类画群后，即可根据未知釉质的拉曼光谱的PCA分类结果，鉴定其基因型。

除试验1里的基因Dlx2外，本发明方法同样适用于amelogenin，enamelin，laminin5α3，cytokeratin 5，Dspp，Dlx1，DLx2，Msx2，Msx1，MMP20，Wdr72，Runx2，Bmp，Pitx2，FGFs等其他缺陷会对生物体矿化程度产生影响的基因的基因型鉴定。

本发明检测对象不限于牙釉质，采集生物体内会发生矿化的其他结构如骨头等的数据，也可以进行基因型鉴定。图3-5为Dlx2小鼠各个骨组织的拉曼光谱，可以看到，在搪瓷的光谱线上，不同基因型小鼠波段范围400-1550cm