一种头孢硫脒及其制剂中的硫代乙酸类杂质的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及医药制备检测技术领域，具体来说，涉及一种头孢硫脒及其制剂中的硫代乙酸类杂质的HPLC检测方法。

背景技术

头孢硫脒系第一代头孢菌素，其对革兰阳性菌及部分革兰阴性菌均有抗菌活性，对革兰阳性球菌的作用尤强。临床上主要用于用于敏感菌所引起呼吸系统、肝胆系统、五官、尿路感染及心内膜炎、败血症。本品通过抑制敏感菌的细胞壁合成产生作用，主要作用于细菌的中隔细胞壁，抑制细菌粘肽合成第三步，阻止粘肽的交叉联结，使完整的细胞壁无法形成，而产生杀菌作用；是一种繁殖期杀菌剂。头孢硫脒化学结构如下图1所示，图2为头孢硫脒的合成路线及硫代乙酸类杂质(杂质H)的产生途径；由图中可以看出，整个合成过程是7-ACA与溴乙酰溴反应生产溴乙酰7-ACA，然后与1,3-二异丙基-2-硫脲反应生成头孢硫脒粗品，然后经精制得到目标产物。而头孢硫脒7-位酰胺键断裂则会产生硫代乙酸类杂质(杂质H)。

现行的注射用头孢硫脒和头孢硫脒中国药典质量标准中规定了特定杂质C和杂质D，但硫代乙酸类杂质(杂质H)作为潜在的降解杂质并未进行控制。头孢硫脒及其制剂中硫代乙酸类杂质(杂质H)的含量水平的高低直接决定了产品的质量及后续临床用药的安全。

因此，根据杂质需从源头控制的理念考虑，有必要建立一种新的用于头孢硫脒原料药及其制剂的硫代乙酸类杂质(杂质H)的HPLC(高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等，高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用)分析方法，使杂质能得到有效控制，保证后续产品的质量。

该方法有利于加强头孢硫脒原料药及其制剂产品内控质量，为工艺条件的优化提供必要的理论和实践依据。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提出一种头孢硫脒及其制剂中的硫代乙酸类杂质的HPLC检测方法，以对头孢硫脒的硫代乙酸类杂质降解杂质进行质量控制，保证产品质量和用药安全。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

一种头孢硫脒及其制剂中的硫代乙酸类杂质的HPLC检测方法，包括步骤使用高效液相色谱仪采用梯度洗脱方法对头孢硫脒及其制剂中的硫代乙酸类杂质进行分离测定，其中检测波长为254±5nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，并以体积百分比85-95％的磷酸盐缓冲液和体积百分比5-15％的有机相组成的混合溶液为流动相A，以质量份数比为7:3的磷酸盐缓冲液、有机相组成的混合溶液为流动相B。

优选的，所述梯度洗脱方法按下表进行，

。

优选的，所述磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml。

优选的，有机相为乙腈、甲醇中的一种。

优选的，所述有机相为乙腈。

优选的，流动相A中缓冲盐溶液体积占比90％，乙腈体积占比10％。

优选的，所述高效液相色谱仪色谱柱的柱温为30-40℃。

优选的，色谱柱的柱温为35℃。

优选的，所述流动相A、B的流速为0.8-1.2mL/min。

优选的，所述流动相A、B的流速为1.0mL/min。

本发明的有益效果为：

本发明的建立的一种用于头孢硫脒及其制剂中硫代乙酸类杂质(杂质H)的HPLC的检测方法，该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高，能够对头孢硫脒的硫代乙酸类杂质降解杂质进行质量控制，保证产品质量和用药安全，本发明的检测方法可以作为头孢硫脒原料药及其制剂中的硫代乙酸类杂质的监测手段。

其中，在洗脱步骤方面，本发明采用梯度洗脱方法，是由于各物质的极性相差较大，相比等度洗脱方法，采用梯度条件更易实现目标杂质与其相关主成分和杂质的有效分离，空白无干扰，杂质之间的分离度均在1.5以上，由于梯度洗脱改善了峰形，杂质的灵敏度和分离度得到显著提高。

在流动相中添加缓冲盐，其原因是，硫代乙酸类杂质中含氨基和羧基，通过在流动相中添加缓冲盐可使被测物增强离子化，提高溶解度，从而有助于分离。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了现有技术中头孢硫脒的结构分子式；

图2示出了现有技术中头孢硫脒的合成路线及硫代乙酸类杂质(杂质H)的产生途径示意图；

图3示出了本发明实施例一中的检测色谱图；

图4示出了本发明实施例二中的检测色谱图；

图5示出了本发明实施例三中的检测色谱图。

具体实施方式

为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。

实施例一：

本实施例中所采用的仪器以及设置条件如下：

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT；

色谱柱：Kromasil 100-5C18 250mm×4.6mm，5μm；

流动相A、B的流速：1.0mL/min；

检测波长：254nm；

色谱柱柱温：35℃；

稀释剂：流动相A；

进样量：10uL；

其中流动相A：将磷酸盐缓冲液与乙腈按照质量份数比9：1配置为流动相A，其中磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml；

流动相B：将磷酸盐缓冲液与乙腈按照质量份数比7：3配置为流动相A，其中磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml。

按表进行梯度洗脱：

梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为100％，流动相B为0％；9min，流动相A为100％，流动相B为0％；9.01min，流动相A为0％，流动相B为100％；15min，流动相A为0％，流动相B为100％；15.01min，流动相A为100％，流动相B为0％；27min，流动相A为100％，流动相B为0％。

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适应性：取本品和杂质H适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释成每lml中含头孢硫脒0.5mg、含杂质H1μg的溶液。

供试品溶液：取本品约12.5mg，置25ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取头孢硫脒杂质H适量，精密称定，用溶剂稀释成浓度约为1μg/ml的溶液。

步骤二：测定

精密量取供试品溶液、空白溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱条件测试，系统适用性典型图谱见下图3。

实施例2

本实施例中所采用的仪器以及设置条件如下

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT；

色谱柱：Kromasil 100-5C18 250mm×4.6mm，5μm；

流动相A、B的流速：1.0mL/min；

检测波长：254nm；

色谱柱柱温：35℃；

稀释剂：流动相A；

进样量：10uL；

其中流动相A：将磷酸盐缓冲液与乙腈按照质量份数比95：5配置为流动相A，其中磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml；

流动相B：将磷酸盐缓冲液与乙腈按照质量份数比7：3配置为流动相A，其中磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml。

按表进行梯度洗脱：

梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为100％，流动相B为0％；9min，流动相A为100％，流动相B为0％；9.01min，流动相A为0％，流动相B为100％；15min，流动相A为0％，流动相B为100％；15.01min，流动相A为100％，流动相B为0％；27min，流动相A为100％，流动相B为0％。

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适应性：取本品和杂质H适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释成每lml中含头孢硫脒0.5mg、含杂质H1μg的溶液。

供试品溶液：取本品约12.5mg，置25ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取头孢硫脒杂质H适量，精密称定，用溶剂稀释成浓度约为1μg/ml的溶液。

步骤二：测定

精密量取供试品溶液、空白溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱条件测试，系统适用性典型图谱见下图4。

实施例3

本实施例中所采用的的仪器以及设置条件：

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT

色谱柱：Kromasil 100-5C18 250mm×4.6mm，5μm

流动相A、B的流速：1.0mL/min

检测波长：254nm

色谱柱柱温：35℃

稀释剂：流动相A

进样量：10uL

流动相A：将磷酸盐缓冲液与乙腈按照质量份数比85：15配置为流动相A，其中磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml；

流动相B：将磷酸盐缓冲液与乙腈按照质量份数比7：3配置为流动相A，其中磷酸盐缓冲液由以下方式配制：取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml。

按表进行梯度洗脱：

梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为100％，流动相B为0％；9min，流动相A为100％，流动相B为0％；9.01min，流动相A为0％，流动相B为100％；15min，流动相A为0％，流动相B为100％；15.01min，流动相A为100％，流动相B为0％；27min，流动相A为100％，流动相B为0％。

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适应性：取本品和杂质H适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释成每lml中含头孢硫脒0.5mg、含杂质H1μg的溶液。

供试品溶液：取本品约12.5mg，置25ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取头孢硫脒杂质H适量，精密称定，用溶剂稀释成浓度约为1μg/ml的溶液。

步骤二：测定

精密量取供试品溶液、空白溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱条件测试，系统适用性典型图谱见下图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。