骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制 备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途以及包含该外泌体的药物组合物。

背景技术

芥子气(sulfur mustard,SM)是一种糜烂性毒剂，中毒后可致皮肤起疱，眼睛、肺、肝脏、脾脏等多器官受累，但目前中毒机制不明，尚无特效治疗药物，其中暴露引发的 肺损伤是致死的主要原因，表现为短期以炎症反应为主的急性肺损伤以及长期的肺纤维 化(Wolfe GA,Petteys SM,Phelps JF,Wasmund JB,Plackett TP.Sulfur MustardExposure: Review ofAcute,Subacute,and Long-Term Effects and TheirManagement.Journal ofspecial operations medicine:a peer reviewed journal forSOF medical professionals 2019；19: 81-6.)。

骨髓间充质干细胞(BMSC)是具有多分化潜能的干细胞，来源丰富，收集操作简便，目前许多研究已经证明BMSC能通过降低炎症因子表达，调节免疫反应改善急性肺 损伤。之前，课题组已经就BMSC对芥子气引起的急性肺损伤的治疗作用进行了探究， 发现BMSC可以通过改善肺部炎症反应及屏障功能促进芥子气急性肺损伤修复。(FengY, Xu Q,Yang Y,Shi W,Meng W,Zhang H,et al.The therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in the acute lung injury inducedby sulfurmustard. Stem cell research&therapy 2019；10:90)。但一方面，BMSC仍存在形成肿瘤的可能及长 期的安全问题，应用还存在一定风险(Lee HY,Hong IS.Double-edged sword ofmesenchymal stem cells:Cancer-promoting versus therapeutic potential.Cancerscience 2017； 108:1939-46)；另一方面，细胞培养条件要求苛刻且难形成制剂，限制了其临床应用。

外泌体(Exosomes)是多种细胞分泌的直径介于40～150nm的脂质双分子层结构，包含多种生物活性物质(蛋白质、DNA和RNA等)，能通过胞吞作用被摄入细胞进行 信息传递，调节信号转导，发挥抗炎、抗氧化等各种生物功能。其免疫原性低，可以很 好地被细胞吸收，是一种极好的信息载体(van Niel G,D'Angelo G,Raposo G.Shedding light onthe cell biology ofextracellular vesicles.Nat Rev Mol Cell Biol 2018；19:213-28)。

目前，尚未见外泌体与芥子气引起的急性肺损伤之间关联的相关研究报道。

发明内容

本发明是为解决上述技术问题进行的，目的在于提供骨髓间充质干细胞来源的外泌 体的新用途、该外泌体的制备方法以及包含该外泌体的药物组合物。

本发明经研究发现BMSC衍生的外泌体能治疗芥子气引起的急性肺损伤。通过超速离心法获得BMSC来源的外泌体，建立芥子气下实验动物模型及小鼠肺上皮细胞 (MLE-12)模型后加入外泌体进行治疗，对芥子气暴露下实验动物生存率及体外细胞活 性进行了检测并测定了细胞紧密连接蛋白分布与表达。结果显示，SM暴露下小鼠生存 率明显下降，肺病理表现出血、水肿、炎症，肺上皮屏障功能明显受损，紧密连接不连 续，紧密连接蛋白分子表达量下降，而BMSC来源的外泌体明显缓解了芥子气引起的肺 部损伤，改善了紧密连接蛋白分子表达与定位，修复了肺屏障功能。

本发明的第一方面，提供了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起 的急性肺损伤药物中的用途。

优选的，所述药物为增强肺上皮细胞活性的药物。根据细胞毒性实验，相对于阴性对照组(SM)、阳性对照组(SM+NAC)，实验组(SM+BMSC-Ex)中肺上皮细胞活 性明显增强(图4)。

优选的，所述药物为药物为提高肺上皮细胞紧密连接相关蛋白表达水平或连接连续 度的药物。免疫荧光实验以及RT-PCR检测结果显示，BMSC来源的外泌体明显改善了 紧密连接蛋白分子表达与定位，修复了肺屏障功能(图5～图7)。

动物模型实验显示，注射外泌体后的芥子气小鼠生存率明显提升，7天生存率由45％ 提升至75％，也远高于阳性对照组(SM+NAC)7天生存率为50％的结果。

本发明的第二方面，提供了该外泌体的制备方法，如下：

A、骨髓间充质干细胞培养

将间充质干细胞培养基加入至骨髓间充质干细胞中，48～72h后收取培养上清液，所 述间充质干细胞培养基的配方为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉 素双抗。

B、外泌体分离

收集骨髓间充质干细胞培养上清液，2000g、4℃条件下离心10min后收取上清液，上清液经10000g、4℃条件离心30min后，再次收集上清液；再次收集的上清液经100000 g、4℃，离心70min后弃上清，收集沉淀后PBS重悬，重复该操作后，收集沉淀溶于 PBS中，得到的外泌体溶液。

通过电镜观察，制备得到的外泌体呈囊泡状，直径为100nm左右。Western blot及CM-Dil检测显示，外泌体的标志性蛋白CD63、CD81、CD9以及TSG101均被检测到， 且CM-Dil标记的外泌体也完全被肺上皮细胞MLE-12吸收。

本发明的第三方面，提供了一种骨髓间充质干细胞来源的外泌体组合物，包括骨髓 间充质干细胞来源的外泌体以及稀释液，该稀释液优选为PBS，方便组合物作为注射剂使用。

本发明的第四方面，提供了该外泌体组合物在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药 物中的用途。

本发明的第五方面，提供了治疗芥子气引起的急性肺损伤的药物组合物，以骨髓间 充质干细胞来源的外泌体为唯一活性组分。

相比现有技术，本发明的技术效果如下：

本发明提供了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤 药物中的用途。通过实验证实，相对于芥子气暴露下小鼠，BMSC来源的外泌体能够明显提高肺上皮细胞活性，同时明显上调肺上皮细胞紧密连接相关蛋白的分子表达与连接连续性，进而修复了肺屏障功能，缓解了芥子气引起的肺部损伤。因此，本发明为芥子 气引起的急性肺损伤提供了一种新的治疗途径。

附图说明

图1为BMSC来源的外泌体鉴定，其中A为透射电子显微镜下外泌体，B为外泌体 纳米颗粒跟踪分析，C为外泌体标志分子Western blot检测，D为CM-Dil标记外泌体被 MLE-12细胞摄取。

图2为BMSC来源外泌体对于SM暴露下小鼠生存率的影响：CTRL：未进行任何 处理的空白细胞对照组；SM：SM染毒小鼠组；SM+NAC：加入阳性对照药物NAC的 SM染毒小鼠组；SM+BMSC-Ex：加入BMSC来源外泌体的SM染毒小鼠组。

图3为外泌体对SM暴露下小鼠肺损伤的病理分析，其中A为不同组别小鼠的肺病理切片，B为各组肺病理评分；

图4为BMSC来源外泌体对SM暴露下MLE-12细胞活性的影响。

图5为外泌体对SM暴露下MLE-12细胞紧密连接蛋白定位的影响。

图6为SM暴露下细胞各紧密连接蛋白mRNA水平分析，其中A～D分别为ZO-1、claudin-1、E-cadherin、occludin抗体标记下不同组别细胞各紧密连接蛋白mRNA水平分析。

图7为SM暴露下细胞各紧密连接蛋白Western blot分析，其中A为电泳结果，B 为不同抗体标记下各组别细胞紧密连接蛋白表达水平对比。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制，同时 实施例不包括对传统方法的详细描述。

实施例1、超速离心法分离骨髓间充质干细胞上清液获取外泌体

A、骨髓间充质干细胞培养

将间充质干细胞培养基加入至骨髓间充质干细胞中，48～72h后收取培养上清液，所 述间充质干细胞培养基的配方为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉 素双抗。

B、外泌体分离

(1)收集骨髓间充质干细胞培养上清液，2000g，4℃，10min，离心收取上清；

(2)10000g，4℃，30min，离心收集上清；

(3)100000g，4℃，70min，离心后弃上清，收集沉淀后PBS重悬，重复该操作；

(4)收集沉淀溶于100μl PBS，得到纯度高的外泌体。

根据图1A和图1B，透射电镜下观察，分离得到的外泌体呈囊泡状，直径在100nm 左右。

实施例2、Western blot鉴定外泌体标志分子

(1)用RIPA裂解液裂解所获外泌体，12000rpm，4℃，20min离心后吸取上清收 集总蛋白，BCA试剂盒测定并调节蛋白浓度；

(2)按照5×蛋白上样缓冲液＝4:1比例在蛋白裂解液中加入蛋白上样缓冲液，震荡 混匀后100℃煮10min；

(3)将10μl蛋白样品加到10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳；

(4)截取相应条带用电转仪转至PVDF膜上；

(5)5％的脱脂牛奶封闭非特异性结合位点1h，然后用CD9,CD63,CD81和TSG101 抗体4℃过夜孵育，TBST缓冲液清洗3次；

(6)HRP标记的二抗(Millipore)室温孵育1h，继而用TBST缓冲液洗3次；

(7)加上显色液显色并拍照分析。

根据图1C，外泌体的标志性蛋白CD63、CD81、CD9以及TSG101均被检测到。

MLE-12细胞外泌体摄取鉴定

(1)在所获外泌体中加入适量CM-Dil储备液，使其最终浓度达到1μg/L，置于 37℃下孵育30min；

(2)将外泌体接种于培养MLE细胞的培养皿上；

(3)37℃孵育60min后荧光显微镜下观察。

根据图1D，CM-Dil标记的外泌体均被MLE-12细胞摄取。

实施例3、SM染毒小鼠后获得肺病理切片及分析生存曲线

(1)选取6～8周ICR小鼠，随机分配至CTRL、SM、SM+NAC、SM+BMSC-Ex 组，除CTRL组，其他组皮下注射1,2-丙二醇为溶剂配制成30mg/kg的芥子气溶液；

(2)在SM染毒后，NAC组给予NAC灌胃(200mg/kg，1次/d，连续7d)，作为 阳性对照组；BMSC-Ex组在染毒后1d和3d尾静脉注射BMSC-Ex，作为实验组；

(3)每天观察小鼠体重、饮食及死亡情况，绘制生存曲线；

(4)于第5天使用戊巴比妥麻醉处死后取部分肺组织，4％多聚甲醛固定后行HE 染色。

根据图2，SM暴露下小鼠生存率明显下降；注射外泌体后，芥子气小鼠生存率明显提升，7天生存率由45％提升至75％，也远高于阳性对照组(SM+NAC)7天生存率为 50％的结果。

根据图3A，SM暴露下小鼠肺病理表现出血、水肿、炎症，肺上皮屏障功能明显受损；尾静脉注射BMSC-Ex后，肺上皮屏障损伤缓解明显，高于阳性组NAC的修复效果。 病理性肺损伤评分显示，SM+BMSC-Ex组的评分也低于较SM以及SM+NAC组(图3B)。

实施例4、细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测BMSC来源的外泌体对芥子气肺细胞损伤的影响，具体步骤 如下：

收集对数生长期MLE-12细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜 贴壁，芥子气(300μM)染毒0.5h后NAC组及BMSC-Ex组分别加入NAC及外泌体， 培养24h后弃去原有培养基，每孔加入10μl CCK-8、100μl新鲜培养液，培养2h后用 多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。重复3次，计算平均值。

根据图4，SM+BMSC-Ex组MLE-12细胞活性最高，随着外泌体浓度的提高，MLE-12 细胞活性也呈递增状态。

实施例5、免疫荧光实验检测MLE-12细胞紧密连接相关蛋白分布

(1)收集对数生长期MLE-12细胞，以每孔3×10

(2)培养24h后PBS清洗一遍，加入-20℃预冷的甲醇透膜；

(3)免疫荧光染色封闭液封闭1h，分别加入occludin、claudin-1、E-cadherin、ZO-1 抗体孵育3h；

(4)洗板3次后加入荧光二抗孵育1h，PBS清洗1次；

(5)DAPI试剂染细胞核，孵育10min后PBS清洗2次，荧光显微镜下观察。

根据图5，SM暴露下小鼠MLE-12细胞紧密连接不连续，阳性对照组施用NAC后，MLE-12细胞紧密连接不连续程度得以缓解，但效果远不及施用了外泌体的BMSC-Ex 组。

实施例6、RT-PCR检测MLE-12细胞紧密连接相关蛋白mRNA水平

(1)TRIzol(Takara)分别提取四组细胞的总RNA，具体步骤如下：

收集对数生长期MLE-12细胞，以每孔3×10

(2)利用

在PCR管中加入如下反应体系:

轻柔混合混匀，置于42℃反应15min，然后置于85℃加热5s灭活逆转录酶；

(3)荧光定量PCR检测

利用

cDNA Variable

(根据模板浓度，cDNA总量控制在10pg-1μg)

利用ABI Prism 7000仪器进行两步法扩增，94℃预变性30s，进行40个PCR循环，94℃5s，60℃30s。

根据图6，SM+NAC组中MLE-12细胞紧密连接相关蛋白mRNA水平与SM组相差 无几，远低于SM+BMSC-Ex组的紧密连接相关蛋白mRNA表达水平。

实施例7、Western blot检测MLE-12细胞紧密连接相关蛋白表达水平

(1)收集对数生长期MLE-12细胞，以每孔3×10

(2)按照5×蛋白上样缓冲液＝4:1比例在蛋白裂解液中加入蛋白上样缓冲液，震荡 混匀后100℃煮10min；

(3)将10μl蛋白样品加到10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳；

(4)截取相应条带用电转仪转至PVDF膜上；

(5)5％的脱脂牛奶封闭非特异性结合位点1h，然后用occludin、claudin-1、 E-cadherin、ZO-1抗体4℃过夜孵育，TBST缓冲液清洗3次；

(6)HRP标记的二抗(Millipore)室温孵育1h，继而用TBST缓冲液洗3次；

(7)加上显色液显色并拍照分析。

结果图如7显示，SM组紧密连接蛋白分子表达量下降，SM+NAC组与SM组几乎 无差异，远低于SM+BMSC-Ex组的紧密连接相关蛋白分子表达水平。BMSC来源的外 泌体明显缓解了芥子气引起的肺部损伤，改善了紧密连接蛋白分子表达与定位，修复了 肺屏障功能。

本发明中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实现。申请人声明， 本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法， 即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了， 对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的 选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。