一种利用共生菌的白芨直播育苗的方法

技术领域

本发明属于中药材育苗技术领域，具体涉及一种利用共生菌的白芨直播育苗的方法。

背景技术

白芨[Bletilla striata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.]，也称白芨，为兰科白芨属多年生草本植物。白芨是我国名贵中草药，具收敛止血、消肿生肌的功效。化学分析表明，白芨块茎中含有联苄类、多糖类、二氢菲类、多酚类、黄酮类等多种有机化合；现代药理学研究表明，这些有机化合物具有抗癌、抗氧化、治疗心血管疾病等多种生物学活性。白芨富含的白芨胶质，除了其药用价值，也可作为天然悬混、增稠剂、润滑剂、乳化剂和保湿剂等广泛应用于化妆品、日化与食品等工业领域，应用前景巨大。

白芨对生长环境条件要求苛刻，野生白芨多分布于海拔较高的丘陵、低山溪谷边及隐蔽草丛中或林下湿地，在我国的甘肃、四川、贵州等多个省份均有自然分布。早年间，白芨药材主要依赖于野生资源采挖，野生白芨遭到过度的开采，野生资源急剧减少，此外由于白芨种子细小且无胚乳，使其在自然条件下萌发率很低，生长较慢，传统的繁殖方式主要进行分株繁殖，但缺点是耗种量大，效率低，周期较长，不能满足大规模种植的需要，已被《国家重点保护野生植物名录》(第2批)列为二级保护植物。

为防止野生资源进一步遭到破坏，同时保证白芨市场需求，目前主要采用组织培养的方式进行白芨种苗繁育。目前在我国西南华中、长江流域等地区均有规模化种植。但是白芨组培育苗方式生产成本高，人工消耗大，移栽成活率相对较低，无法满足药材市场对种苗的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用共生菌的白芨直播育苗的方法，将白芨共生菌分离培养后，在白芨种子萌发过程中加入白芨共生菌，大大提高了白芨种子的直播萌发率，后期管理过程喷施花宝叶面肥，种苗生长速度快，该方法生产成本低，人工消耗少，所培养的白芨种苗生长旺盛，环境适应力强，移栽成活率高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：该利用共生菌的白芨直播育苗的方法，具体包括以下步骤：

S1白芨共生菌的获取：通过白芨外植体培养并获得白芨共生菌的菌种，待用；S2白芨的直播育苗：将经过预处理后的白芨种子与步骤S1中的白芨共生菌进行拌种后播种在苗床中；

S3播种后期管理：待播种后的种子萌发出苗后，进行施肥和炼苗处理后进行移栽。

通过上述技术方案，制备白芨共生菌，再将白芨共生菌与白芨种子混匀后进行直播，再进行炼苗处理，由于白芨种子萌发过程中加入了白芨共生菌，使得白芨种子的直播萌发率高达86％，后期管理过程喷施花宝叶面肥，种苗生长速度快，本发明相比于组培育苗方法，大大降低了生产成本和人工消耗，所培养的白芨种苗活力旺盛，长势均一，移栽成活率高达99％。

进一步地，所述步骤S1白芨共生菌的获取具体包括以下步骤：

S11白芨共生菌的分离：将白芨外植体进行灭菌消毒后，切成0.5～1cm的小块接种到灭菌好的PDA培养基中，置于25℃恒温培养箱中培养2～15d；

S12白芨共生菌的纯化：待所述白芨外植体周围长出内生菌后，挑取菌落边缘的幼菌丝，另接种到一个新的PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养3～7d；S13白芨共生菌的培养：将制备的培养基装培养袋，高温高压蒸汽灭菌1～1.5h，冷却后在无菌环境中接入白芨共生菌的菌种，封好袋口，转入25℃培养室培养20～50d后，待菌丝长满培养袋后，待用。步骤S12中的PDA培养基成分与步骤S11中相同。

进一步地，所述步骤S2白芨的直播育苗的具体包括以下步骤：

S21苗床整理：将直播地面翻耕整平，将泥炭土与珍珠岩按8:2拌匀后，在地面上铺0.5～3cm厚度作为直播基质，并且每隔0.8～1m宽开设一条排涝沟，深度在8～12厘米；

S22白芨种子预处理：选择成熟饱满的白芨果荚，将所述白芨果荚切开，取出全部白芨种子，然后将所述白芨种子与草木灰按1：50～1：80的比例混合均匀，获得白芨种子草木灰混合物；

S23拌种：将步骤S1中培养好的白芨共生菌分成3～8cm的小块，然后与步骤S22中白芨种子草木灰混合物充分拌匀，获得白芨种子和白芨共生菌混合物；

S24播种：按每个白芨果荚播种3～5m

进一步地，所述步骤S3播种后期管理的具体包括以下步骤：

S31覆膜和搭棚：喷好水后，在种子上方覆一层地膜，然后再在所述地膜的上方用支架和塑料薄膜搭建一个简易棚；

S32播种后期管理：待白芨种子萌发至0.5cm左右的小苗时，将薄膜揭除，之后每隔10～15d喷施一次花宝叶面肥，施肥量为每平方米0.3～0.8L，并将所述简易棚内的温度控制在18～28℃，湿度控制在60～90％；

S33炼苗处理：待小苗长至4cm左右，白天将所述简易棚两端架起通风，晚间将简易棚的两端盖好；待小苗长至5cm左右，白天将简易棚的薄膜去除，晚间将薄膜盖上以及两端架起；待小苗长至7cm左右，即可移栽至大田种植。采用薄膜和小棚搭建了简易棚可以有效保湿和保温，为白芨种子萌发和幼苗生长提供有利的环境；炼苗过程逐步的通风和去膜，是为了让小苗逐步适应大田自然环境，提高移栽成活率，从而最终使移栽成活率高达99％。

进一步地，步骤S1中所用的白芨外植体为白芨种子组培萌发的圆球茎、白芨块茎和白芨根须。

进一步地，所述步骤S1所用的PDA培养基中含有土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH调制5～6。

进一步地，所述步骤S11白芨外植体进行灭菌消毒的具体步骤为：将白芨外植体用清水洗净，然后用75％的酒精消毒15s，无菌水清洗2次，再在0.1％的升汞中消毒3～5min，无菌水清洗5～7次。

进一步地，所述步骤S13中的培养基的成分为壳斗科植物落叶62％，棉籽壳8％，阔叶树锯木屑13.5％，米糠或麸皮10％，蔗糖1.5％，石膏1.2％，硫酸镁0.8％，磷酸二氢钾1.2％，尿素1.8％，加入适量的水，将以上成分充分拌匀，最终含水量在65～70％。

进一步地，所述步骤S32所用的花宝叶面肥为花宝5号0.6g/L+花宝2号0.2g/L。该花宝5号中氮、磷、钾三要素含量比为30：10：10，花宝2号中氮、磷、钾三要素含量比为20：20：20，为白芨幼苗生长提供充足的营养。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过在白芨种子萌发过程中加入白芨共生菌，大大提高了白芨种子的自然直播萌发率，促进白芨幼苗健康生长，后期管理过程喷施花宝叶面肥，为白芨幼苗生长提供充足的养分，白芨幼苗生长速度快，长势健壮，该方法有效降低白芨种苗生产成本低，人工消耗少，所培养的白芨种苗生长旺盛，环境适应力强，移栽成活率高。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

实施例1：该利用共生菌的白芨直播育苗的方法，具体包括以下步骤：

S1白芨共生菌的获取：通过白芨外植体培养并获得白芨共生菌的菌种，待用；

S11白芨共生菌的分离：将白芨外植体进行灭菌消毒，步骤为：首先将白芨外植体(包括白芨种子组培萌发的圆球茎、白芨块茎和白芨根须)用清水洗净，然后用75％的酒精消毒15s，无菌水清洗2次，再在0.1％的升汞中消毒4min，无菌水清洗5次，将灭菌消毒后的白芨外植体切成0.6cm的小块接种到灭菌好的PDA培养基中，所用的PDA培养基中含有土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH调制5～6；再置于25℃恒温培养箱中培养7d；

S12白芨共生菌的纯化：待所述白芨外植体周围长出内生菌后，挑取菌落边缘的幼菌丝，另接种到一个新的PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养5d；

S13白芨共生菌的培养：将制备的培养基装培养袋，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后在无菌环境中接入白芨共生菌的菌种，封好袋口，转入25℃培养室培养30d后，待菌丝长满培养袋后，待用；其中培养基的成分为壳斗科植物落叶62％，棉籽壳8％，阔叶树锯木屑13.5％，米糠或麸皮10％，蔗糖1.5％，石膏1.2％，硫酸镁0.8％，磷酸二氢钾1.2％，尿素1.8％，加入适量的水，将以上成分充分拌匀，最终含水量在65～70％；

S2白芨的直播育苗：将经过预处理后的白芨种子与步骤S1中的白芨共生菌进行拌种后播种在苗床中；

S21苗床整理：将直播地面翻耕整平，将泥炭土与珍珠岩按8:2拌匀后，在地面上铺1.5cm厚度作为直播基质，并且每隔0.8m宽开设一条排涝沟，深度在10厘米；

S22白芨种子预处理：选择成熟饱满的白芨果荚，将所述白芨果荚切开，取出全部白芨种子，然后将所述白芨种子与草木灰按1：50的比例混合均匀，获得白芨种子草木灰混合物；

S23拌种：将步骤S1中培养好的白芨共生菌分成3～5cm的小块，然后与步骤S22中白芨种子草木灰混合物充分拌匀，获得白芨种子和白芨共生菌混合物；其中每个白芨果荚拌入的白芨共生菌的用量为1.5Kg，白芨共生菌可以有效提高白芨种子的自然萌发率，促进幼苗生长；

S24播种：按每个白芨果荚播种3.5m

S3播种后期管理：待播种后的种子萌发出苗后，进行施肥和炼苗处理后进行移栽；

S31覆膜和搭棚：喷好水后，在种子上方覆一层地膜，然后再在所述地膜的上方用支架和塑料薄膜搭建一个简易棚；采用薄膜和小棚搭建了简易棚可以有效保湿和保温，为白芨种子萌发和幼苗生长提供有利的环境；

S32播种后期管理：待白芨种子萌发至0.5cm左右的小苗时，将薄膜揭除，之后每隔10d喷施一次花宝叶面肥，施肥量为每平方米0.6L，并将所述简易棚内的温度控制在20～22℃，湿度控制在60～70％；所述步骤S32所用的花宝叶面肥为花宝5号0.6g/L+花宝2号0.2g/L；该花宝5号中氮、磷、钾三要素含量比为30：10：10，花宝2号中氮、磷、钾三要素含量比为20：20：20，为白芨幼苗生长提供充足的营养；

S33炼苗处理：待小苗长至4cm左右，白天将所述简易棚两端架起通风，晚间将简易棚的两端盖好；待小苗长至5cm左右，白天将简易棚的薄膜去除，晚间将薄膜盖上以及两端架起；待小苗长至7cm左右，即可移栽至大田种植；炼苗过程逐步的通风和去膜，是为了让小苗逐步适应大田自然环境，提高移栽成活率。该实施例1的白芨种子萌发率为86％，小苗移栽成活率为98％。

实施例2：该利用共生菌的白芨直播育苗的方法，具体包括以下步骤：

S1白芨共生菌的获取：通过白芨外植体培养并获得白芨共生菌的菌种，待用；

S11白芨共生菌的分离：将白芨外植体进行灭菌消毒，步骤为：首先将白芨外植体(包括白芨种子组培萌发的圆球茎、白芨块茎和白芨根须)用清水洗净，然后用75％的酒精消毒15s，无菌水清洗2次，再在0.1％的升汞中消毒5min，无菌水清洗5次，将灭菌消毒后的白芨外植体切成0.8cm的小块接种到灭菌好的PDA培养基中，所用的PDA培养基中含有土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH调制5～6；再置于25℃恒温培养箱中培养10d；

S12白芨共生菌的纯化：待所述白芨外植体周围长出内生菌后，挑取菌落边缘的幼菌丝，另接种到一个新的PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养7d；

S13白芨共生菌的培养：将制备的培养基装培养袋，高温高压蒸汽灭菌1.2h，冷却后在无菌环境中接入白芨共生菌的菌种，封好袋口，转入25℃培养室培养50d后，待菌丝长满培养袋后，待用；其中培养基的成分为壳斗科植物落叶62％，棉籽壳8％，阔叶树锯木屑13.5％，米糠或麸皮10％，蔗糖1.5％，石膏1.2％，硫酸镁0.8％，磷酸二氢钾1.2％，尿素1.8％，加入适量的水，将以上成分充分拌匀，最终含水量在65～70％；

S2白芨的直播育苗：将经过预处理后的白芨种子与步骤S1中的白芨共生菌进行拌种后播种在苗床中；

S21苗床整理：将直播地面翻耕整平，将泥炭土与珍珠岩按8:2拌匀后，在地面上铺2cm厚度作为直播基质，并且每隔0.9m宽开设一条排涝沟，深度在8厘米；

S22白芨种子预处理：选择成熟饱满的白芨果荚，将所述白芨果荚切开，取出全部白芨种子，然后将所述白芨种子与草木灰按1：70的比例混合均匀，获得白芨种子草木灰混合物；

S23拌种：将步骤S1中培养好的白芨共生菌分成5～6cm的小块，然后与步骤S22中白芨种子草木灰混合物充分拌匀，获得白芨种子和白芨共生菌混合物；其中每个白芨果荚拌入的白芨共生菌的用量为1.2Kg，白芨共生菌可以有效提高白芨种子的自然萌发率，促进幼苗生长；

S24播种：按每个白芨果荚播种4.5m

S3播种后期管理：待播种后的种子萌发出苗后，进行施肥和炼苗处理后进行移栽；

S31覆膜和搭棚：喷好水后，在种子上方覆一层地膜，然后再在所述地膜的上方用支架和塑料薄膜搭建一个简易棚；采用薄膜和小棚搭建了简易棚可以有效保湿和保温，为白芨种子萌发和幼苗生长提供有利的环境；

S32播种后期管理：待白芨种子萌发至0.5cm左右的小苗时，将薄膜揭除，之后每隔12d喷施一次花宝叶面肥，施肥量为每平方米0.5L，并将所述简易棚内的温度控制在22～25℃，湿度控制在65～80％；所述步骤S32所用的花宝叶面肥为花宝5号0.6g/L+花宝2号0.2g/L；该花宝5号中氮、磷、钾三要素含量比为30：10：10，花宝2号中氮、磷、钾三要素含量比为20：20：20，为白芨幼苗生长提供充足的营养；

S33炼苗处理：待小苗长至4cm左右，白天将所述简易棚两端架起通风，晚间将简易棚的两端盖好；待小苗长至5cm左右，白天将简易棚的薄膜去除，晚间将薄膜盖上以及两端架起；待小苗长至7cm左右，即可移栽至大田种植；炼苗过程逐步的通风和去膜，是为了让小苗逐步适应大田自然环境，提高移栽成活率。该实施例2的白芨种子萌发率为83％，小苗移栽成活率为96％。

实施例3：该利用共生菌的白芨直播育苗的方法，具体包括以下步骤：

S1白芨共生菌的获取：通过白芨外植体培养并获得白芨共生菌的菌种，待用；

S11白芨共生菌的分离：将白芨外植体进行灭菌消毒，步骤为：首先将白芨外植体(包括白芨种子组培萌发的圆球茎、白芨块茎和白芨根须)用清水洗净，然后用75％的酒精消毒15s，无菌水清洗2次，再在0.1％的升汞中消毒3.5min，无菌水清洗6次，将灭菌消毒后的白芨外植体切成1cm的小块接种到灭菌好的PDA培养基中，所用的PDA培养基中含有土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH调制5～6；再置于25℃恒温培养箱中培养13d；

S12白芨共生菌的纯化：待所述白芨外植体周围长出内生菌后，挑取菌落边缘的幼菌丝，另接种到一个新的PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养6d；

S13白芨共生菌的培养：将制备的培养基装培养袋，高温高压蒸汽灭菌1.5h，冷却后在无菌环境中接入白芨共生菌的菌种，封好袋口，转入25℃培养室培养45d后，待菌丝长满培养袋后，待用；其中培养基的成分为壳斗科植物落叶62％，棉籽壳8％，阔叶树锯木屑13.5％，米糠或麸皮10％，蔗糖1.5％，石膏1.2％，硫酸镁0.8％，磷酸二氢钾1.2％，尿素1.8％，加入适量的水，将以上成分充分拌匀，最终含水量在65～70％；

S2白芨的直播育苗：将经过预处理后的白芨种子与步骤S1中的白芨共生菌进行拌种后播种在苗床中；

S21苗床整理：将直播地面翻耕整平，将泥炭土与珍珠岩按8:2拌匀后，在地面上铺2.8cm厚度作为直播基质，并且每隔1m宽开设一条排涝沟，深度在9厘米；

S22白芨种子预处理：选择成熟饱满的白芨果荚，将所述白芨果荚切开，取出全部白芨种子，然后将所述白芨种子与草木灰按1：80的比例混合均匀，获得白芨种子草木灰混合物；

S23拌种：将步骤S1中培养好的白芨共生菌分成6～8cm的小块，然后与步骤S22中白芨种子草木灰混合物充分拌匀，获得白芨种子和白芨共生菌混合物；其中每个白芨果荚拌入的白芨共生菌的用量为1.8Kg，白芨共生菌可以有效提高白芨种子的自然萌发率，促进幼苗生长；

S24播种：按每个白芨果荚播种4m

S3播种后期管理：待播种后的种子萌发出苗后，进行施肥和炼苗处理后进行移栽；

S31覆膜和搭棚：喷好水后，在种子上方覆一层地膜，然后再在所述地膜的上方用支架和塑料薄膜搭建一个简易棚；采用薄膜和小棚搭建了简易棚可以有效保湿和保温，为白芨种子萌发和幼苗生长提供有利的环境；

S32播种后期管理：待白芨种子萌发至0.5cm左右的小苗时，将薄膜揭除，之后每隔14d喷施一次花宝叶面肥，施肥量为每平方米0.8L，并将所述简易棚内的温度控制在24～26℃，湿度控制在75～90％；所述步骤S32所用的花宝叶面肥为花宝5号0.6g/L+花宝2号0.2g/L；该花宝5号中氮、磷、钾三要素含量比为30：10：10，花宝2号中氮、磷、钾三要素含量比为20：20：20，为白芨幼苗生长提供充足的营养；

S33炼苗处理：待小苗长至4cm左右，白天将所述简易棚两端架起通风，晚间将简易棚的两端盖好；待小苗长至5cm左右，白天将简易棚的薄膜去除，晚间将薄膜盖上以及两端架起；待小苗长至7cm左右，即可移栽至大田种植；炼苗过程逐步的通风和去膜，是为了让小苗逐步适应大田自然环境，提高移栽成活率。该实施例3的白芨种子萌发率为84％，小苗移栽成活率为99％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形；本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。