分离自草鱼的CXCL20a蛋白在作为抗菌肽中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及分离自草鱼的CXCL20a蛋白在作为抗菌肽中的应用。

背景技术

抗生素人类抵御细菌感染类疾病的主要武器，在过去数十年对治疗细菌性感染疾病方面取得了一定的成果，但是近年来尤其在养殖业中随着抗生素的滥用，越来越多的病原微生物对传统抗生素产生了耐药性，“超级细菌”的出现几乎能够耐受所有抗生素，更是为人类健康和养殖业发展产生了巨大威胁。所以，寻找无细菌耐药性、能够替代抗生素的新型药物迫在眉睫。

趋化因子是一类由70-100个氨基酸编码6-14kDa分子量的分泌蛋白，主要功能为在炎症和正常生理情况下调控多种多样的免疫细胞定向迁移。鱼类趋化因子的数量因鱼类种属的不同而不同，主要亚型为CC,CXC和XC，草鱼CXCL20a属于CXC亚型家族蛋白，并且CXCL20a为鱼类特有蛋白，对于其未见相关功能研究，仅停留在转录水平方面。

发明内容

本发明的目的在于提供分离自草鱼的CXCL20a蛋白在作为抗菌肽中的应用，所述的CX CL20a蛋白为SEQ ID NO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

分离自草鱼的CXCL20a蛋白在作为抗菌肽中的应用，所述的CXCL20a蛋白为SEQ IDNO.1所示，编码所述的CXCL20a蛋白的多核苷酸优选为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

以上所述的应用中，所述的抗菌肽作用的细菌包括但不限于：耐药性大肠杆菌、耐药性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、荧光假单胞菌、耶尔森氏菌、河流弧菌和嗜水气单胞菌。

以上所述的应用中，优选的、所述的CXCL20a蛋白通过真核表达的方式得到，包括将编码CXCL20a蛋白的多核苷酸按照毕赤酵母偏爱密码子进行密码子优化，优化后的基因片段为SEQ ID NO.3所示，将基因片段与pPIC9k表达载体定向连接，通过Sal I进行酶切线性化后，电转入宿主毕赤酵母后表达、阳离子交换层析提取重组蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

申请人首次发现，草鱼CXCL20a具有类似抗菌肽的直接杀菌功能，与大众的抗菌肽相比，CXCL20a耐受高温高压，在该条件下仍具备良好的抗菌活性。

申请人进一步用真核表达的方式，表达CXCL20a蛋白，操作简单、快捷、需时较短、表达产量高、适合工业化，具有很好的应用价值。例如可以作为治疗细菌病的药物。

附图说明

图1是CXCL20a基因的pPIC9k重组表达载体的构建。

图2是利用G418筛选CXCL20a高表达菌株的结果。

图3是利用PCR检测CXCL20a阳性转化子的结果。

图4是CXCL20a表达及甲醇浓度优化的结果。

图5是CXCL20a蛋白纯化的结果。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明所述CXCL20a的制备及应用。这些实施例仅对本发明进行说明，而不是对本发明进行限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，可参考《微生物学实验》(第四版)。本发明实施例所用的草鱼CXCL20a蛋白通过真核表达方式获得，利用本领域的常规方式。例如，其他蛋白表达方法，或是直接合成的方式获得的CXCL20a蛋白，均可获得本发明的技术效果。

实施例1：

构建含有CXCL20a基因的pPIC9k重组表达系统

根据毕赤酵母偏爱密码子，利用基因合成的方法，将草鱼CXCL20a核苷酸序列进行优化，并在两端分别加入SnaB I和EcoR I两个酶切位点，直接插入pPIC9k中α-分泌信号肽的后面，同时在目的核苷酸序列的后面插入TAA终止子，以终止翻译。再利用Sal I进行酶切线性化，采用电转化的方法，电转入宿主毕赤酵母感受态细胞中。通过G418进行表达菌株的筛选，获得能表达重组融合蛋白的菌株。

具体步骤如下：

(1)根据毕赤酵母偏爱密码子，将草鱼CXCL20a核苷酸序列进行密码子优化，将优化后的序列插入pPIC9k中α-分泌信号肽的后面，在优化密码子时，将TAA终止子插入到目的核苷酸序列的后面，以确保目的蛋白的翻译终止(图1)。核苷酸及氨基酸序列如序列表1所示：

表1草鱼CXCL20a核苷酸及氨基酸序列

(2)目的序列线性化。Sal I酶切线性化反应体系如表所示：

表2线性化反应体系

按照线性化反应体系加入到1.5ml的EP管中，放入37℃水浴锅中酶切30min后进行回收。

(3)制备酵母感受态细胞。挑取酵母单菌落，接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；取100-150μl的培养物接种至含有20ml新鲜培养基的200ml三角摇瓶中，培养过夜；将细胞培养物于4℃和转速1500g的条件下离心5min，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；进行同条件下离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；进行同条件下离心，用20ml的冰预冷的1mol山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；进行同条件下离心，用1ml的冰预冷的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其总体积约为1.5ml。

(4)线性化质粒电转入酵母感受态细胞。将上述步骤(2)的线性化质粒与上述步骤(3)的100μl酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯(冰浴5min)中，以电压1.5kv、电阻200Ω及电容25μF进行电击，电击完毕后，立即加入1ml冰预冷的山梨酸溶液将菌体混匀，在超净台内将电转液转至1.5ml的EP管中，30℃静置1h，然后1500g离5min，吸出500μl上清弃掉，再加入500μlYPD培养基，在30℃下250r摇30min，再次离心后，吸出600μl上清弃掉，再重悬菌体。将200μl菌体悬液涂布于YPD平板上，将平板置于30℃培养2-4d，直至单个菌落出现。

(5)G418筛选表达菌株。将上述在YPD生长的单菌落通过影印法接种到不同浓度的G418平板(0.25mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml)上(图2)，将同平板上面的优势阳性菌株进行PCR检测(图3)，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃再延伸10min。反应体系如表3所示：

表3 CXCL20a PCR检测体系

之后将检测正确的菌株进行诱导，以获得表达菌株。

(6)诱导表达菌株并优化甲醇诱导浓度。用上述步骤(5)中挑取的单克隆菌落，利用BM MY培养基扩大培养后，在4℃、1500g条件下离心5min，转入BMGY培养基中进行诱导培养5d，利用发酵上清液进行目的蛋白检测，并优化纯甲醇的诱导浓度，确定纯甲醇诱导浓度为1.0％(图4)。

实施例2：

纯化CXCL20a重组蛋白

将扩大诱导的发酵上清液进行收集，并根据蛋白的性质使用阳离子纯化出CXCL20a。

具体步骤如下：

将发酵上清液与阳离子填料于4℃下，进行过夜孵育。随后将溶液以0.5mL/min的流速通过阳离子交换层析柱，之后用20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl，pH 8.0的缓冲液以1mL/min的流速洗脱杂蛋白。最后使用20mmol/L Tris、150-1000mmol/L NaCl，pH 8.0，1mL/min的流速梯度洗脱目的蛋白，将目的蛋白梯度透析至20mmol/L Tris，pH 8.0缓冲液中。最后吸取80μl的蛋白纯化液，加入20μl的5×SDS上样缓冲液，利用SDS-PAGE进行检测(图5)，从图5中可以看到，利用上述方法成功纯化出CXCL20a蛋白，并且纯化后的蛋白很纯净，纯化后的蛋白浓度可以达到2mg/ml。

实施例3：

抗菌活性检测

测试细菌：河流弧菌(Vibrio fluvialis，ATCC33847)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydr ophila，ATCC7966)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，ATCC13813)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus，ATCC25923)、大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC25922)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus，ATCC10240

具体步骤如下：

(1)先把-80℃条件下保存的八种细菌：河流弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、荧光假单胞菌、耶尔森氏菌置于4℃溶解后，取出平衡至室温，然后分别进行小量肉汤液体培养基接菌种活化，分别根据其细菌特性于28或37℃条件下恒温摇床培养18小时至对数生长期。

(2)将活化好的菌液接种到肉汤琼脂固体斜面培养基上，28或37℃恒温培养18小时，用无菌水洗下菌苔，稀释至5×10

(3)取稀释后的菌液50μl与不同浓度的CXCL20a溶液50μl混合均匀，放在28℃恒温水浴锅内孵育3小时，取出50μl混合液涂平板，每组做3个平行，28或37℃倒置培养12小时后计数菌落并拍照，阴性对照为菌液+无菌水。

(4)根据以下公式计算抑菌率：

抑菌率(100％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100％

(5)结果分析：

表4 CXCL20a对八种细菌抑制率

由表4可以得到，CXCL20a对河流弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、荧光假单胞菌、耶尔森氏菌8种细菌在低浓度就有很高的抑制率，说明CXCL20a对这8种菌有明显的抑制作用。由上表的抑制率可知，CXCL20a对金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和无乳链球菌有相当强的抑制作用。

实施例4：

抗多耐药细菌活性检测

测试细菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，A TCC43300)、耐β-内酰胺酶类抗生素大肠杆菌(Escherichiacoli(Migula)Castellani and C halmers，ATCC35218)、致病性多耐药大肠杆菌PCN033(Genome analysis and in vivo vir ulence of porcine extraintestinal pathogenicEscherichia coli strain PCN033)。

具体步骤如下：

(1)先把-80℃条件下保存的3种细菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐β-内酰胺酶类抗生素大肠杆菌、致病性多耐药大肠杆菌PCN033置于4℃溶解后，取出平衡至室温，然后分别进行小量肉汤液体培养基接菌种活化，于37℃条件下恒温摇床培养18小时至对数生长期。

(2)将活化好的菌液接种到肉汤琼脂固体斜面培养基上，37℃恒温培养18小时，用无菌水洗下菌苔，稀释至5×10

(3)取稀释后的菌液50μl与不同浓度的CXCL20a溶液50μl混合均匀，放在28℃恒温水浴锅内孵育3小时，取出50μl混合液涂平板，每组做3个平行，37℃倒置培养12小时后计数菌落并拍照，阴性对照为菌液+无菌水。

(4)根据以下公式计算抑菌率：

抑菌率(100％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100％

(5)结果分析：

表5 CXCL20a对三种细菌抑制率

由表5可以得到，CXCL20a对多耐药菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐β-内酰胺酶类抗生素大肠杆菌、致病性多耐药大肠杆菌PCN033 3种细菌在低浓度就有很高的抑制率，说明CXCL20a对这3种菌有明显的抑制作用。

实施例5：

高温高压条件下检测抗菌活性测试细菌：大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC25922)和金黄葡萄球菌(Staphylococcus au reaus，ATCC25923)。

具体步骤如下：

(1)取100μl的CXCL20a蛋白液装于1.5ml的EP管中，于高压灭菌锅(温度121℃，高压0.12MPa)下进行加热加压30min。

(2)选取一种革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌)进行小量肉汤液体培养基接菌种活化，分别37℃条件下恒温摇床培养18小时至对数生长期。

(3)将活化好的菌液接种到肉汤琼脂固体斜面培养基上，37℃恒温培养18小时，用无菌水洗下菌苔，稀释至5×10

(4)取稀释后的菌液50μl与不同浓度的CXCL20a溶液50μl混合均匀，放在28℃恒温水浴锅内孵育3小时，取出50μl混合液涂平板，每组做3个平行，28或37℃倒置培养12小时后计数菌落并拍照，阴性对照为菌液+无菌水。

(5)根据以下公式计算抑菌率：

抑菌率(100％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100％

(6)结果分析：

表6高温高压下CXCL20a对两种细菌抑制率

由表6可以得到，CXCL20a在经过高温高压下，对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌)依旧具备良好的抗菌活性。在低浓度下就有很高的抑制率，说明CXCL20a可以耐受高温高压的条件，对革兰氏阴、阳性菌有明显的抑制作用，为制备生物制品提供了可能。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 分离自草鱼的CXCL20a蛋白在作为抗菌肽中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Gly His Gly Ala Gly Ile Ser Gln Arg Cys Leu Cys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Met Arg Lys Ala Met Lys Pro Lys Tyr Ile His Ala Ala Glu Leu Phe

20 25 30

Pro Pro Ser Ala Ser Cys Ser Lys Thr Glu Ile Ile Leu Thr Leu Asn

35 40 45

Arg Lys Gly Lys Gly Lys Gly Arg Gly Lys Gly Leu Lys Val Cys Leu

50 55 60

Asp Pro Tyr Glu Lys Gln Gly Arg Arg Leu Leu Lys Ser Lys Gly Ile

65 70 75 80

Gln Asn Lys Lys Gln Lys Asn Arg Gly Arg Lys Gly Arg Asn Lys Lys

85 90 95

Ser Asp Val Lys Asp Asp

100

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggcatggag cagggatttc acagcgctgt ttatgcagag gcagaatgcg gaaagcaatg 60

aagcctaaat acattcatgc agctgaattg ttcccaccaa gtgcctcctg ctcaaagacc 120

gagattatac tgactctcaa tagaaaagga aagggaaaag gaaggggaaa ggggttaaag 180

gtgtgtctgg atccatatga gaagcaagga cggagattac tgaagagcaa agggattcaa 240

aacaaaaagc aaaagaacag aggaaggaaa ggaaggaata aaaagtctga tgtcaaggat 300

gactag 306

<210> 3

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcatggtg ctggaatctc tcagaggtgc ttgtgcagag gaaggatgag gaaggccatg 60

aagccaaagt acatccacgc tgccgagttg ttcccaccat ctgcctcttg ctctaagacc 120

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aacaagaagc agaagaatag aggtaggaag ggaaggaaca agaaatctga tgttaaagat 300

gattga 306