一株多粘类芽孢杆菌及其在防治多种土传病害中的应用

技术领域

本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌及其在防治多种土传病害中的应用。

背景技术

土传病害已经成为一个世界性的问题，危害农业的可持续发展。立枯丝核菌、大丽轮枝菌、辣椒疫霉菌、芸薹根肿菌等均为常见的土传病原体，它们寄主范围广泛，引起作物大量减产，造成严重经济损失。当前，由于集约化种植、单一连作等生产模式，土传病害迅速成为限制作物产量和质量的重要因素。此外土传病害的蔓延使得作物产量对农药依赖程度越来越大，进而造成环境污染及食品安全等问题。因此，开展土传病害生物防治的研究尤为重要和迫切。

利用生防菌来防治植物土传病害，因其低成本、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点。种类多样的土传病害一直制约着农业可持续发展，寻找解决土传病害的方法迫在眉睫。类芽孢杆菌(Paenibacillusspp.)具有良好生物活性，能产生多种抗生素，对植物病原菌具有很好的抑制作用，可促进植物生长，诱导植物产生系统抗性，影响根际微生物群落等。目前多粘类芽孢杆菌广谱防治土传病害的报道还非常少。因此，筛选能同时对立枯病、黄萎病、疫病、根肿病等多种土传病害有一定防治作用的生防类芽孢杆菌具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株多粘类芽孢杆菌及其在防治多种土传病害中的应用。

第一方面，本发明首先保护多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129，已于2019年04月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.17631。

第二方面，本发明保护菌剂，含有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129。

第三方面，本发明保护多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129的发酵产物。

进一步地，所述发酵产物是将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129接种于下述(a)-(g)任一所述的培养基进行发酵培养得到的：

(a)LB液体培养基；

(b)黄豆粉8培养基；

(c)棉籽饼培养基；

(d)玉米鱼粉培养基；

(e)豆粕培养基；

(f)甘露醇培养基；

(g)玉米粉培养基。

所述黄豆粉8培养基的配方具体可为：黄豆饼粉30g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾KH

所述棉籽饼培养基的配方具体可为：棉籽饼粉32.5g、玉米粉14g、麸皮12g、磷酸二氢钾KH

所述玉米鱼粉培养基的配方具体可为：玉米粉25g、鱼粉5g、蔗糖1g、蛋白胨1.5g、磷酸氢二钾K

所述豆粕培养基的配方具体可为：豆粕粉80g、麦芽糖15g、磷酸二氢钾KH

所述甘露醇培养基的配方具体可为：甘露醇20g、棉籽饼粉5g、氯化钙CaCl

所述玉米粉培养基的配方具体可为：玉米粉500g、蒸馏水1000mL。

所述发酵产物可为悬液或菌悬液离心得到的上清液。

第四方面，本发明保护多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物在如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)中的应用：

(a1)抑制植物病原菌；

(a2)制备用于抑制植物病原菌的产品；

(a3)防治由植物病原菌所致的疾病；

(a4)制备用于防治由植物病原菌所致的疾病的产品。

所述植物病原菌为病原真菌或病原细菌。所述病原真菌具体可为多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。所述病原细菌具体可为丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus)、丁香假单胞杆菌流泪变种(Pseudomonas syringaepv.lachryrnans)、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense)或茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。

第五方面，本发明保护多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物在如下(b1)-(b8)任一种中的应用：

(b1)防治马铃薯黑痣病；

(b2)防治马铃薯黄萎病；

(b3)防治辣椒疫病；

(b4)防治白菜根肿病；

(b5)制备用于防治马铃薯黑痣病的产品；

(b6)制备用于防治马铃薯黄萎病的产品；

(b7)制备用于防治辣椒疫病的产品；

(b8)制备用于防治白菜根肿病的产品。

所述马铃薯黑痣病具体可为由立枯丝核菌引起的马铃薯黑痣病。

所述马铃薯黄萎病具体可为由大丽轮枝菌引起的马铃薯黄萎病。

所述辣椒疫病具体可为由辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病。

所述白菜根肿病具体可为由芸薹根肿菌引起的白菜根肿病。

第六方面，本发明保护多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物在如下(c1)或(c2)中的应用：

(c1)促进植物生长发育；

(c2)制备用于促进植物生长发育的产品。

所述植物具体可为黄瓜。所述黄瓜具体可为中农6号黄瓜。

所述促进植物生长发育具体可为促进株高增加和/或叶面积增加。

第七方面，本发明保护产品，包括多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物；所述产品的用途为如下(1)-(7)中的至少一种：

(1)抑制植物病原菌；

(2)防治由植物病原菌所致的疾病；

(3)防治马铃薯黑痣病；

(4)防治马铃薯黄萎病；

(5)防治辣椒疫病；

(6)防治白菜根肿病；

(7)促进植物生长发育。

所述马铃薯黑痣病具体可为由立枯丝核菌引起的马铃薯黑痣病。

所述马铃薯黄萎病具体可为由大丽轮枝菌引起的马铃薯黄萎病。

所述辣椒疫病具体可为由辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病。

所述白菜根肿病具体可为由芸薹根肿菌引起的白菜根肿病。

第八方面，本发明保护下述任一方法；

(A)一种防治马铃薯黑痣病的方法，包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物施于马铃薯根部。

所述马铃薯黑痣病具体可为由立枯丝核菌引起的马铃薯黑痣病。所述马铃薯具体可为费乌瑞它马铃薯。所述方法中，具体可将马铃薯移栽于含有有效浓度多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129的培养基质中。每1kg基质中具体可含有1×10

(B)一种防治马铃薯黄萎病的方法，包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物施于马铃薯根部。

所述马铃薯黄萎病具体可为由大丽轮枝菌引起的马铃薯黄萎病。所述马铃薯具体可为费乌瑞它马铃薯。所述方法中，具体可将马铃薯根部浸泡于有效浓度(具体可为1×10

(C)一种防治辣椒疫病的方法，包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物施于辣椒根部。

所述辣椒疫病具体可为由辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病。所述辣椒具体可为陇椒5号辣椒。所述方法中，具体采用喷雾法向将有效浓度(具体可为1×10

(D)一种防治白菜根肿病的方法，包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物施于白菜根部。

所述白菜根肿病具体可为由芸薹根肿菌引起的白菜根肿病。所述白菜具体可为菊心白菜。所述方法中，具体可将马铃薯移栽于含有有效浓度多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129的培养基质中。每1kg基质中具体可含有1×10

第九方面，本发明保护一种促进植物生长发育的方法，包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物发酵产物施于植物根部。

所述方法中，具体可采用灌根法将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129或所述菌剂或所述发酵产物发酵产物施于植物根部。

所述植物具体可为黄瓜。所述黄瓜具体可为中农6号黄瓜。

所述促进植物生长发育具体可为促进株高增加和/或叶面积增加。

每株黄瓜具体可施用5ml浓度为1×10

第十方面，本发明保护多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129在制备所述菌剂或所述发酵产物中的应用。

本发明从马铃薯根际土壤中分离筛选得到一株对多种土传病害病原物具有强抑制作用的拮抗菌株ZF129，通过对峙培养发现，菌株ZF129显著抑制病原真菌菌丝生长。抑菌谱测定试验表明菌株ZF129对6种病原细菌和8种病原真菌都具有拮抗活性，显示出广谱拮抗活性。根据形态特征、生理生化特性及系统发育树鉴定菌株ZF129为多粘类芽孢杆菌。发酵试验结果表明，菌株ZF129用玉米粉培养基发酵效果最好。菌株发酵液对马铃薯黑痣病、马铃薯黄萎病、辣椒疫病和白菜根肿病的防效分别为84.76％、43.24％、78.21％和76.24％，并对植株具有促生能力。本发明中的多粘类芽孢杆菌ZF129表现出优良的生防性状，具有进一步开发潜力，并为类芽孢杆菌在防病作用机理方面的深入研究奠定一定基础。

附图说明

图1为平板对峙菌丝形态观察。A、C：菌株ZF129；B、D：对照。

图2为菌株ZF129系统进化树。

图3为菌株ZF129抑菌谱。A：丁香假单胞杆菌番茄致病变种；B：野油菜黄单胞野油菜致病变种；C：密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种；D：丁香假单胞杆菌流泪变种；E：胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种；F：茄科雷尔式菌；G：多主棒孢菌；H：尖孢镰孢菌；I：辣椒炭疽菌；J：辣椒疫霉菌；K：茄链格孢菌；L：灰葡萄孢菌。

图4为菌株ZF129不同培养基发酵液对立枯丝核菌的抑制效果。

图5为菌株ZF129对马铃薯黑痣病盆栽防效试验。A：菌株ZF129；B：氟唑菌苯胺；C：对照。

图6为菌株ZF129对马铃薯黄萎病盆栽防效试验。A：菌株ZF129；B：甲基硫菌灵；C：对照。

图7为菌株ZF129对辣椒疫病盆栽防效试验。A：菌株ZF129；B：代森锰锌；C：对照。

图8为菌株ZF129对白菜根肿病盆栽防效试验。A：菌株ZF129；B：氰霜唑；C：对照。

图9为菌株ZF129对黄瓜促生效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129的分离筛选及鉴定

一、菌株分离

从河北沽源马铃薯根际土壤中分离得到60株细菌。分离方法如下：

称取马铃薯根际土壤10g，溶于90mL无菌水中，28℃、160r/min振荡处理30min，使其充分混匀。将混匀的土样80℃水浴10min后，按照10

二、菌株筛选

采用平板对峙法测定步骤一分离的60株菌株对马铃薯黑痣病菌立枯丝核菌的抑制率。具体方法如下：在PDA平板中央接种直径5mm立枯丝核菌菌饼，同时在距平板中央3.5cm处接种5μL OD

通过上述筛选得到7株对立枯丝核菌具有抑制作用的菌株，其中1株对马铃薯黑痣病菌立枯丝核菌有强拮抗作用的菌株ZF129，抑制率达55.29％，其余菌株抑制率均小于48％。分别挑取菌株ZF129处理过的立枯丝核菌丝和正常的菌丝置于光学显微镜下，观察到经过菌株ZF129处理过的菌丝相比正常菌丝有明显膨大，菌丝表面不光滑，凹凸不平，菌丝内部浑浊，原生质体外溢(图1)。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜，2008，(6)：9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

三、菌株ZF129鉴定

1、形态学

菌株ZF129在LB固体培养基上呈乳白色，菌落表面无褶皱，边缘不规则，挑起菌落时较为粘稠。

2、生理生化测定

将菌株ZF129划线接种于LB固体培养基，28℃培养24h，依据《常见细菌系统鉴定手册》对生理生化特征进行鉴定。

检测结果如表1所示。结果表明，菌株ZF129为革兰氏阳性细菌，在15℃-37℃条件下均可生长，培养基含盐量为1％时可正常生长，含盐量为4-8％时不能生长。

表1菌株ZF129生理生化特性

3、Biolog测定

挑取菌株ZF129单菌落接种至LB培养基试管斜面上，28℃培养24h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENEⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF129进行唯一碳源利用的测定。

结果显示，菌株ZF129可以利用甘露糖和果胶，不能利用明胶、山梨醇和柠檬酸盐，硝酸盐还原反应为阴性，淀粉水解反应为阳性(表1)。

4、16S rDNA基因扩增及序列分析

用普通细菌基因组提取试剂盒提取菌株ZF129的基因组DNA后，分别利用细菌16SrDNA的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′对菌株ZF129的16S rDNA进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃延伸10min。所得产物送博迈德生物公司进行序列测定。用MEGA7.0采用最大似然法构建系统发育树，分析其亲缘关系。

16S rDNA测序结果如序列表的序列1所示。16S rDNA测序结果经BLAST比对发现，ZF129与多粘类芽孢杆菌一致性较高。构建16S rDNA系统发育树，结果菌株ZF129与多粘类芽孢杆菌标准菌株聚在一簇上(图2)。结合菌株ZF129的生理生化测定、BIOLOG测定和系统发育树结果，确定菌株ZF129为多粘类芽孢杆菌。

5、菌株ZF129的保藏

本发明提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129，已于2019年04月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.17631。多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF129简称为多粘类芽孢杆菌ZF129。

实施例2、多粘类芽孢杆菌ZF129抑菌谱测定

一、真菌抑菌谱测定

按照实施例1步骤二中的方法检测多粘类芽孢杆菌ZF129对多主棒孢菌、尖孢镰孢菌、辣椒炭疽菌、辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、茄链格孢菌、灰葡萄孢菌和立枯丝核菌的抑制率。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报，2011，38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)已在文献“石延霞、张晓慧、徐玉芳、谢学文、柴阿丽、李宝聚.吡唑并嘧啶衍生物BDO-1诱导黄瓜对枯萎病的抗性.园艺学报，2019，46(05)：877-890.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)已在文献“于洋、石延霞、傅俊范、李宝聚.亲和病原菌诱导黄瓜组织结构抗病性机制.植物保护学报，2008，(01)：37-42.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)已在文献“程颖超、康华军、石延霞、柴阿丽、张红杰、谢学文、李宝聚.辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用.园艺学报，2018，45(05)：997-1006.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)已在文献“刘芮池、程有普、柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用.中国农业科学，2019，52(12)：2069-2078.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄链格孢菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报，2015，30(增刊)：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)已在文献“石延霞、唐明、晋知文、谢学文、柴阿丽、李宝聚.蔬菜作物灰葡萄孢菌对不同类型杀菌剂抗性评价.中国蔬菜，2016，(03)：60-65.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜，2008，(6)：9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

二、细菌抑菌谱测定

采用双层培养法测定多粘类芽孢杆菌ZF129对病原细菌(丁香假单胞杆菌番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜致病变种、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种、丁香假单胞杆菌流泪变种、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种或茄科雷尔式菌)的拮抗活性。具体方法如下：在PDA平板中心接种5μL OD

丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“柴阿丽、帕提古丽、郭威涛、石延霞、谢学文、席先梅、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报，2019，46(01)：182-192.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜，2011，17：23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus)已在文献“马海艳、张家森、王丽、高中强、余宏军、蒋卫杰.蒋卫杰博士：聚焦生产一线(十四)滕州市早春拱棚马铃薯高效栽培技术.中国蔬菜，2015，(08)：70-73.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

丁香假单胞杆菌流泪变种(Pseudomonas syringae pv.lachryrnans)已在文献“李焕玲、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(五十三)黄瓜细菌性角斑病的症状多样性与综合防治.中国蔬菜，2012，(21)：23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense)已在文献“郑斐、李磊、石延霞、谢学文、柴阿丽、程有普、李宝聚.水生拉恩氏菌ZF7分离鉴定及其促生防病效果研究.植物病理学报，2019，49(6)：836-845.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)已在文献“康华军、柴阿丽、石延霞、谢学文、袁军海、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.园艺学报，2018，45(11)：2254-2264.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

上述实验结果如表2所示。结果显示，菌株ZF129可抑制8种病原真菌和6种病原细菌的生长(图3)，具有广谱拮抗活性，对野油菜黄单胞野油菜致病变种的抑菌圈可达到3.40cm，对多主棒孢菌、尖孢镰孢菌、辣椒疫霉菌、链格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制率均在60％以上。另外，菌株ZF129对丁香假单胞杆菌番茄致病变种、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种、丁香假单胞流泪致病变种、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、茄科雷尔氏菌、辣椒炭疽菌和立枯丝核菌都具有良好的抑制作用。

表2 ZF129菌株抑菌谱试验

实施例3、多粘类芽孢杆菌ZF129不同培养基发酵液对马铃薯枯萎病菌生长的抑制效果

1、将多粘类芽孢杆菌ZF129接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min恒温振荡培养16h得到母液。

2、将步骤1制备得到的母液按照1:20(体积比)的比例接种于培养基中，28℃、180r/min恒温振荡培养24h。

所述培养基为黄豆粉8培养基、棉籽饼培养基、玉米鱼粉培养基、豆粕培养基、甘露醇培养基、玉米粉培养基。

黄豆粉8培养基：黄豆饼粉30g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾KH

棉籽饼培养基：棉籽饼粉32.5g、玉米粉14g、麸皮12g、磷酸二氢钾KH

玉米鱼粉培养基：玉米粉25g、鱼粉5g、蔗糖1g、蛋白胨1.5g、磷酸氢二钾K

豆粕培养基：豆粕粉80g、麦芽糖15g、磷酸二氢钾KH

甘露醇培养基：甘露醇20g、棉籽饼粉5g、氯化钙CaCl

玉米粉培养基：玉米粉500g、蒸馏水1000mL。

棉籽饼粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号FA0250；

玉米粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号FA0100；

鱼粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号FA0080；

黄豆饼粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号FA0160；

豆粕粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号FA0040；

麸皮(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号FA0360。

3、完成步骤2后，将发酵液10000r/min离心15min，取上清液。将上清液通过0.22μm的滤芯过滤。

4、完成步骤3后，将上清液按照不同比例加至20mL PD培养基中，使上清液的终浓度分别为1％，5％，10％(体积分数)，并以不加发酵液的PDA平板接菌作为对照，每处理设置3个重复。在平板中央接种立枯丝核菌菌碟，28℃培养3d，测量测量靶标菌的对照菌落直径和处理菌落直径，用抑菌率表示。抑菌率(％)＝100×(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径。

结果如图4所示。结果显示，在6种培养基中，随着菌株ZF129发酵液含量的升高，对立枯丝核菌的抑制率也随之升高。玉米粉培养基3种不同添加比例的抑制率差异极显著，并且添加量为10％时，抑制率最高，达到56.49％。

实施例4、多粘类芽孢杆菌ZF129对马铃薯黑痣病盆栽防效试验

1、挑取多粘类芽孢杆菌ZF129单菌落接种于LB液体培养基中，28℃下振荡培养至浓度为1×10

2、将立枯丝核菌菌饼接种于PD培养基，28℃、180r/min振荡培养7d，过滤除去菌丝后，通过血球计数板稀释孢子悬浮液浓度为10

3、选取生长至4-5片复叶的费乌瑞它马铃薯植株，用无菌水清洗根茎部，针刺茎基部后置于步骤2制备的菌悬液中浸根30min，然后移栽于拌有生防菌(多粘类芽孢杆菌ZF129)的基质中，多粘类芽孢杆菌ZF129菌液浓度为1×10

结果如表3和图5所示。结果显示，菌株ZF129可有效降低马铃薯植株发病的病情指数，防效达到84.76％，显著高于对照药剂22.4％氟唑菌苯胺悬浮剂的防效。试验结果显示，菌株ZF129可以在活体植株上发挥生防效果，具有开发潜力。

表3菌株ZF129对马铃薯黑痣病盆栽防治效果

实施例5、多粘类芽孢杆菌ZF129对马铃薯黄萎病盆栽防效试验

1、挑取多粘类芽孢杆菌ZF129单菌落接种于LB液体培养基中，28℃下振荡培养至浓度为1×10

2、将大丽轮枝菌菌饼接种于PD培养基，28℃、180r/min振荡培养12d，过滤除去菌丝后，通过血球计数板稀释孢子悬浮液浓度为10

3、采用伤根浸根法接种大丽轮枝菌，将马铃薯植株连根拔出，用无菌水将根部洗净，在孢子浓度为1×10

马铃薯黄萎病病情分级标准：0级：健株，植株叶片无褪绿及枯死；1级：植株叶片表现褪绿，<1％叶片枯死症状；2级：40％植株叶片表现褪绿，1％～20％叶片枯死症状；3级：植株叶片表现褪绿，21％～35％叶片枯死症状；4级：植株叶片表现褪绿，36％～70％叶片枯死症状；5级：植株叶片表现褪绿，71％～100％叶片枯死症状。病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)；防治效果(％)＝100×(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数。

结果如表4和图6所示。结果显示，菌株ZF129的防效为43.24％，对照药剂甲基硫菌灵的防效为35.14％，菌株ZF129的防效比药剂高8.10％。

表4菌株ZF129对马铃薯黄萎病盆栽防治效果

实施例6、多粘类芽孢杆菌ZF129对辣椒疫病盆栽防效试验

1、挑取多粘类芽孢杆菌ZF129单菌落接种于LB液体培养基中，28℃下振荡培养至浓度为1×10

2、将辣椒疫霉菌饼接种于PD培养基，28℃、180r/min振荡培养7d，过滤除去菌丝后，通过血球计数板稀释孢子悬浮液浓度为10

3、将疫霉孢子悬浮液与无菌基质按体质比1：10的比例混匀，移栽2叶1心健康长势一致的陇椒5号辣椒苗至拌有辣椒疫霉的基质中。采用喷雾法每株辣椒分别接种1×10

辣椒疫病分级标准：0级：无症状；1级：幼苗根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：幼苗根茎部变黑超过2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级：幼苗根茎部变黑溢缩，除生长点外全部落叶或植株萎蔫；5级：植株枯死。病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)；防治效果(％)＝100×(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数。

结果如表5和图7所示。结果显示，菌株ZF129对辣椒疫霉的抑制作用较为明显，活体防效为78.21％，比对照药剂代森锰锌高3.84％。

表5菌株ZF129对辣椒疫病盆栽防治效果

实施例7、多粘类芽孢杆菌ZF129对白菜根肿病盆栽防效试验

1、挑取多粘类芽孢杆菌ZF129单菌落接种于LB液体培养基中，28℃下振荡培养至浓度为1×10

2、将适量无菌水混合白菜根肿病发病菌根(菌根采集于湖北恩施下坝村)，用豆浆机打碎后，用纱布过滤，调节休眠孢子浓度为1×10

3、将2叶1心时期的菊心白菜根部洗净，在芸薹根肿菌孢子悬液中浸泡3h，移栽到拌有1×10

待对照处理表现出明显症状时，进行调查，统计植株发病情况，计算病情指数与防治效果。白菜根肿病分级标准：0级：根部无肿大；1级：肿根只附着在侧跟上，占全部根系1～-25％；2级：主根上有肿根附着，侧根上肿根占25％～50％；3级：主根上有肿根附着，肿根占根系50％～75％；4级：主根上有肿根附着，肿根占根系75％以上。病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)；防治效果(％)＝100×(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数。

结果如表6和图8所示。结果显示，接种60d后，经过菌株ZF129处理后的白菜相比对照，病情指数显著降低64.17％，防效达到76.24％。

表6菌株ZF129对白菜根肿病盆栽防治效果

实施例8、多粘类芽孢杆菌ZF129对黄瓜的促生作用

将多粘类芽孢杆菌ZF129接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min摇培24h后，调节菌悬液浓度至1×10

结果如表7和图9所示。结果表明，菌株ZF129具有促生作用，株高和叶面积相比对照分别提高了19.09cm和34.48cm

表7菌株ZF129对黄瓜促生效果

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一株多粘类芽孢杆菌及其在防治多种土传病害中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)

<400> 1

tctccataga aaggaggtga tccagccgca ccttccgata cggctacctt gttacgactt 60

caccccaatc atctacccca ccttcggcgg ctggctcctt gcggttacct caccgacttc 120

gggtgttgta aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aagacccggg aacgtattca 180

ccgcggcatg ctgatccgcg attactagca attccgactt catgtaggcg agttgcagcc 240

tacaatccga actgagaccg gcttttctag gattggctcc agatcgctcc ttcgcttccc 300

gttgtaccgg ccattgtagt acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac 360

gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctgc ttagagtgcc cagcttgacc 420

tgctggcaac taagcataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac 480

acgagctgac gacaaccatg caccacctgt ctcctctgtc ccgaaggaaa ggtctatctc 540

tagaccggtc aaagggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac 600

cacatactcc actgcttgtg cgggtccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc 660

gtactcccca ggcggaatgc ttaatgtgtt aacttcggca ccaagggtat cgaaacccct 720

aacacctagc attcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc 780

ccacgctttc gcgcctcagc gtcagttaca gcccagagag tcgccttcgc cactggtgtt 840

cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact 900

caagctcccc agtttccagt gcgacccgaa gttgagcctc gggattaaac accagactta 960

aagagccgcc tgcgcgcgct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cccctacgta 1020

ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gggctttctt ctcaggtacc gtcacctcaa 1080

gagcagttac tctctcaagc gttcttccct ggcaacagag ctttacgatc cgaaaacctt 1140

catcactcac gcggcgttgc tccgtcaggc tttcgcccat tgcggaagat tccctactgc 1200

tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg 1260

tcggctacgc atcgtcgcct tggtaggcct ttaccccacc aactagctaa tgcgccgcag 1320

gcccatccac aagtgacaga ttgctccgcc tttcctcctt ctcccatgca ggaaaaggat 1380

gtatcgggta ttagctaccg tttccggtag ttatccctgt cttgtgggca ggttgcctac 1440

gtgttactca cccgtccgcc gctaggttga ttagaagcaa gcttctaatc aaccccgctc 1500

gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg ttcgtcctga gccaggatca aactctccat 1560

taa 1563