用于针对髓源性抑制细胞的靶向治疗的细胞外囊泡

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月19日提交的美国临时申请第62/747,982号的权益，此临时申请在此通过引用整体并入本文中。

序列表

本申请含有以电子形式提交的序列表，其为于2019年10月16日创建的名称为“321501-2360Sequence Listing_ST25”的ASCII.txt文件。此序列表的内容整体并入本文中。

背景技术

髓源性抑制细胞(MDSC)在许多生理和病理过程(包括癌症、伤口愈合和组织修复)中发挥基础性作用。例如，MDSC通过使肿瘤细胞屏蔽宿主的免疫系统和/或抗癌治疗，并通过促进肿瘤细胞的散布/扩散来实现肿瘤/癌症进展。因此，需要开发治疗方法以选择性地靶向MDSC并调节其活性。

发明内容

本文公开了有效靶向MDSC并递送治疗性货物的纳米载体系统。这些纳米载体基于设计的细胞外囊泡(EV)，其本质上可以是自体的(即，来源于同一患者的细胞)或同种异体的(即，来源于供体的细胞)。细胞天然地生产EV。然而，为了避免免疫应答，可以使用来自免疫系统的细胞，诸如抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)或巨噬细胞。

所公开的装饰有ICAM的EV可被用在许多不同病状(诸如癌症和自身免疫性疾病)中来靶向骨髓细胞。在一些实施方案中，可以通过将ICAM表达载体转染到“供体”细胞或组织中来实现装饰。另选地，可以使用本来就具有高水平ICAM表达的供体细胞和组织。

因此，可以使用不同的转染技术(例如，批量电穿孔、纳米电穿孔、组织纳米转染、病毒转染、声致穿孔、纳米粒子、微粒、化学转染)，在转染体外细胞或体内组织后获得设计的EV。可以通过用例如编码ICAM1的质粒DNA转染细胞来实现负载治疗性货物和/或用MDSC靶向配体装饰。基于ICAM1的靶向容许在数分钟内选择性地将EV/货物递送至MDSC。

这些EV被收集后可以经由电穿孔(为了添加更多的货物)、生化或化学功能化以包括造影剂(用于诊断)或其他靶向或示踪蛋白/元素来进一步修饰。EV还可以用可透过脂质的药物/化学物质(例如，为了添加药理剂以及遗传性货物)来进一步修饰，所述药物/化学物质能够经由浓度梯度进入EV来进一步修饰货物。

可以根据要增强还是削弱骨髓抑制子活性来改变治疗性货物，这取决于所治疗的病状。例如，使装饰有ICAM1的EV负载miR146a可以例如用来抵抗肿瘤龛位内的MDSC活性。除了基于核酸的治疗性货物外，装饰有ICAM1的EV还可以负载有可透过膜的药理化合物(例如，依鲁替尼(Ibrutinib))，这些化合物可以经由浓度梯度扩散到EV中。在一些实施方案中，货物是用于诊断成像的显像剂，诸如造影剂。

在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将是显而易见的。

附图说明

图1是生产靶向MDSC的装饰有ICAM1的EV的示意图。EV是如下制得：将编码ICAM1的质粒和编码治疗性货物(基于核酸的治疗剂)的质粒递送入自体或同种异体细胞(体外或体内)。细胞机器加工这些质粒，从而能够生产装饰有ICAM1并负载有目标核酸的设计的EV。

图2是负载有药物治疗性货物(例如，依鲁替尼，一种抑制布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的可透过膜的药理化合物)的表面装饰的EV的示意图。

图3说明装饰有ICAM1的EV可用于靶向肿瘤微环境内的MDSC和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，以抵消它们的免疫抑制活性并促进肿瘤的治疗。

图4A显示在孵育15分钟后，装饰有ICAM-1的EV优先被MDSC或巨噬细胞(例如，TAM)内化，而未被癌细胞(A549)内化(EV用绿色荧光染料标记)。图4B显示在装饰的EV中miR-146a的负载。Scr-CT是通过用加扰质粒转染细胞制成的对照(CT)EV。

图5是显示基于EV的治疗阻碍肿瘤生长的条形图。

图6A和图6B是显示基于EV的治疗影响肿瘤的免疫细胞组成(图6A)并减少MDSC(图6B)的条形图。

图7说明验证经工程改造的EV的实验

图8A和图8B显示与对照EV相比，在负载的EV中发现的miR146a的水平增加了约400倍(图8A)，而GLUT-1的水平增加了约3000倍(图8B)。图8C是蛋白质印迹，显示EV装饰有ICAM-1。

图9A显示装饰有ICAM的EV靶向MDSC。我们将MDCS与癌细胞共培养，并且我们在72小时期间用EEV处理它们。图9B显示MDSC转变为促炎表型。

图10显示经工程改造的EV减少乳腺癌鼠模型(PyMT)中的肿瘤进展。

图11A和图11B显示经工程改造的EV表现出免疫调节活性。注射了经工程改造的EV的肿瘤具有与基线相比更少的单核细胞型MDSC(图11)，而巨噬细胞无变化(图11B)。

图12A和图12B显示经工程改造的EV具有增加的T细胞浸润。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并且因此当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅为了描述特定实施方案，并不意图进行限制，因为本公开的范围将仅受限于所附权利要求。

在提供数值范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个居中值(到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指示)以及在该规定范围中的任何其它规定值或居中值涵盖在本公开内。这些更小的范围的上限和下限可独立地包括在所述更小的范围内，并且也涵盖在本公开中，受制于所述范围中任何具体排除的界限。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中所引用的所有出版物和专利通过引用并入在本文中，犹如每个个体出版物或专利都具体地且单独地被指示为通过引用并入且通过引用并入在本文中以结合所引用出版物所陈述的内容来公开和描述方法和/或材料。任何出版物的引用均是其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开内容无权凭借在先公开内容而早于该出版物。此外，提供的发布日期可能与可能需要独立确认的实际发布日期不同。

如本领域的技术人员在阅读本公开之后将清楚，本文中所描述且所示出的各个实施方案中的每一者具有分立部件和特征，这些分立部件和特征可以很容易与其它数个实施方案中的任一者的特征分离或结合，而不脱离本公开的范围或精神。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

除非另外指出，否则本公开的实施方案将采用本领域技术范围内的化学、生物学等技术。

提出下面的实施例以向本领域普通技术人员提供如何实施方法以及如何使用本文公开和要求保护的标的物的完整公开和描述。已经尽力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指出，否则份数为重量份，温度以℃计，并且压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

在详细描述本公开的实施方案之前，应理解，除非另外指出，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应物质、制造工艺等，因此可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅为了描述特定实施方案，而不意图进行限制。在本公开中还可能的是，在逻辑上可行的情况下，可以按不同的顺序进行步骤。

须注意，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个指代物，除非上下文另有明确指示。

公开了负载有治疗性货物的靶向MDSC的细胞外囊泡(EV)以及其组合物、系统和制备方法。本文还公开了MDSC靶向配体，诸如含有MDSC靶向部分的融合蛋白。还公开了含有所公开的融合蛋白的EV。在一些实施方案中，EV还负载有治疗性货物。还公开了经工程改造以生产所公开的EV的EV生产细胞。还公开了制备所公开的EV的方法，所述方法涉及在适于生产EV的条件下培养所公开的EV生产细胞。所述方法还可以涉及纯化来自所述细胞的EV。

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并且因此当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅为了描述特定实施方案，并不意图进行限制，因为本公开的范围将仅受限于所附权利要求。

在提供数值范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个居中值(到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指示)以及在该规定范围中的任何其它规定值或居中值涵盖在本公开内。这些更小的范围的上限和下限可独立地包括在所述更小的范围内，并且也涵盖在本公开中，受制于所述范围中任何具体排除的界限。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中所引用的所有出版物和专利通过引用并入在本文中，犹如每个个体出版物或专利都具体地且单独地被指示为通过引用并入且通过引用并入在本文中以结合所引用出版物所陈述的内容来公开和描述方法和/或材料。任何出版物的引用均是其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开内容无权凭借在先公开内容而早于该出版物。此外，提供的发布日期可能与可能需要独立确认的实际发布日期不同。

如本领域的技术人员在阅读本公开之后将清楚，本文中所描述且所示出的各个实施方案中的每一者具有分立部件和特征，这些分立部件和特征可以很容易与其它数个实施方案中的任一者的特征分离或结合，而不脱离本公开的范围或精神。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

除非另外指出，否则本公开的实施方案将采用本领域技术范围内的化学、生物学等技术。

提出下面的实施例以向本领域普通技术人员提供如何实施方法以及如何使用本文公开和要求保护的标的物的完整公开和描述。已经尽力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指出，否则份数为重量份，温度以℃计，并且压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

在详细描述本公开的实施方案之前，应理解，除非另外指出，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应物质、制造工艺等，因此可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅为了描述特定实施方案，而不意图进行限制。在本公开中还可能的是，在逻辑上可行的情况下，可以按不同的顺序进行步骤。

须注意，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个指代物，除非上下文另有明确指示。

细胞外囊泡(EV)

在一些实施方案中，所公开的EV可以是能够由细胞分泌的任何囊泡。细胞分泌具有广范围直径和功能的细胞外囊泡(EV)，包括凋亡小体(1-5μm)、微囊泡(大小为100-1000nm)和内体起源的囊泡(称为外泌体(50-150nm))。

所公开的细胞外囊泡可以通过本领域已知的方法制备。例如，可以通过在真核细胞中表达编码细胞靶向配体的mRNA来制备所公开的细胞外囊泡。在一些实施方案中，细胞还表达编码治疗性货物的mRNA。细胞靶向配体和治疗性货物的mRNA可以由载体表达，所述载体被转染到合适的生产细胞中以生产所公开的EV。细胞靶向配体和治疗性货物的mRNA可以由同一载体表达(例如，其中载体由各自的启动子表达细胞靶向配体和治疗性货物的mRNA)，或者细胞靶向配体和治疗性货物的mRNA可以由各自的载体表达。可以将用于表达细胞靶向配体和治疗性货物的mRNA的一种或多种载体包装在被设计用于制备所公开的细胞外囊泡的试剂盒中。

还公开了包含含有所公开的靶向配体的EV的组合物。在一些实施方案中，EV负载有所公开的治疗性货物。还公开了经工程改造以分泌所公开的EV的EV生产细胞。

EV(诸如，外泌体)由许多不同类型的细胞(包括免疫细胞诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞(DC)和大多数细胞)生产。EV也由例如神经胶质瘤细胞、血小板、网状细胞、神经元、肠上皮细胞和肿瘤细胞生产。用于所公开的组合物和方法中的EV可以来源于任何合适的细胞，包括上文指认的细胞。适于大量生产的EV生产细胞的非限制性实例包括树突状细胞(例如，未成熟的树突状细胞)、人胚肾293(HEK)细胞、293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人ESC来源的间充质干细胞。EV也可以从自体患者来源的、异种单倍型匹配的或异种的干细胞获得，以减少或避免在被递送外泌体的患者中产生免疫应答。任何EV生产细胞均可用于此目的。

还公开了用于制备负载有治疗性货物的所公开的EV的方法，所述方法涉及培养所公开的经工程改造以分泌所公开的EV的EV生产细胞。所述方法可以进一步涉及纯化来自所述细胞的EV。

可以通过任何合适的方法从培养基中收集由细胞生产的EV。通常，可以通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液中制备EV制剂。例如，EV可以通过以下来制备：差速离心，即低速(<20000g)离心以沉淀较大的颗粒，然后高速(>100000g)离心以沉淀EV；使用合适的过滤器进行尺寸过滤；梯度超速离心(例如，使用蔗糖梯度)或这些方法的组合。

MDSC靶向配体

所公开的EV可以通过在EV的表面上表达与MDSC的表面上表达的细胞表面部分结合的靶向部分而靶向于MDSC。合适的靶向部分的实例是短肽、scFv和完整蛋白，只要靶向部分可以在外泌体的表面上表达即可。肽靶向部分的长度通常可以小于100个氨基酸，例如长度小于50个氨基酸，长度小于30个氨基酸，最小长度为10、5或3个氨基酸。

例如，在一些实施方案中，细胞靶向配体是ICAM1。基于ICAM1的靶向容许在数分钟之内选择性地将EV/货物递送至MDSC。在一些实施方案中，靶向配体是ICAM-1并且具有氨基酸序列：

MASTRAKPTLPLLLALVTVVIPGPGDAQVSIHPREAFLPQGGSVQVNCSSSCKEDLSLGLETQWLKDELESGPNWKLFELSEIGEDSSPLCFENCGTVQSSASATITVYSFPESVELRPLPAWQQVGKDLTLRCHVDGGAPRTQLSAVLLRGEEILSRQPVGGHPKDPKEITFTVLASRGDHGANFSCRTELDLRPQGLALFSNVSEARSLRTFDLPATIPKLDTPDLLEVGTQQKLFCSLEGLFPASEARIYLELGGQMPTQESTNSSDSVSATALVEVTEEFDRTLPLRCVLELADQILETQRTLTVYNFSAPVLTLSQLEVSEGSQVTVKCEAHSGSKVVLLSGVEPRPPTPQVQFTLNASSEDHKRSFFCSAALEVAGKFLFKNQTLELHVLYGPRLDETDCLGNWTWQEGSQQTLKCQAWGNPSPKMTCRRKADGALLPIGVVKSVKQEMNGTYVCHAFSSHGNVTRNVYLTVLYHSQNNWTIIILVPVLLVIVGLVMAASYVYNRQRKIRIYKLQKAQEEAIKLKGQAPPP(SEQ ID NO:1)，或是可靶向MDSC上分子的与SEQ ID NO:1具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的其变体和/或片段。例如，靶向配体可以是SEQ ID NO:1的能够结合氨基酸序列LYQAKRFKV(SEQ ID NO:2)的片段和/或变体，该氨基酸序列可以在一些实施方案中定义ICAM-1结合位点。

在一些实施方案中，靶向配体是ICAM-1的片段，包含SEQ ID NO:1的至少100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、156、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、420、430、440、441、442、443、444、445、456、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536或537个连续氨基酸，或其变体。

ICAM-1中的结合位点描述于例如Diamond MS等人，细胞(Cell)1991 65:961-971，和Hermand P等人，生物化学杂志(J Biol Chem)2000 275(34):26002-26010中，所述文献关于这些结合结构域的教导通过引用整体并入本文中。

在一些实施方案中，细胞靶向配体可以通过将其表达为与外泌体或溶酶体跨膜蛋白的融合蛋白而在EV的表面上表达。

治疗性货物

所公开的细胞外囊泡还可负载治疗剂，其中细胞外囊泡将该药剂递送至靶细胞。合适的治疗剂包括但不限于治疗性药物(例如，小分子药物)、治疗性蛋白和治疗性核酸(例如，治疗性RNA)。在一些实施方案中，所公开的细胞外囊泡包含治疗性RNA(在本文中也称为“货物RNA”)。

例如，在一些实施方案中，含有细胞靶向基序的融合蛋白还包括与存在于货物RNA中的一种或多种RNA基序结合的RNA结构域(例如，在融合蛋白的胞质C端)，以便在细胞分泌细胞外囊泡之前将货物RNA包装到细胞外囊泡中。因此，融合蛋白可以同时充当“细胞靶向蛋白”和“包装蛋白”。在一些实施方案中，包装蛋白可以称为细胞外囊泡负载蛋白或“EV负载蛋白”。

在一些实施方案中，货物RNA是miRNA、shRNA、mRNA、ncRNA、sgRNA或其任何组合。例如，在一些实施方案中，抗炎剂是微小RNA 146a。已经报道了其他miRNA调节负责M1促进糖酵解代谢的关键分子(例如，mRr9、miR127和miR155)的表达。

所公开的细胞外囊泡的货物RNA可以具有任何合适的长度。例如，在一些实施方案中，货物RNA可具有至少约10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、100nt、200nt、500nt、1000nt、2000nt、5000nt或更长的核苷酸长度。在其他实施方案中，货物RNA可以具有不超过约5000nt、2000nt、1000nt、500nt、200nt、100nt、50nt、40nt、30nt、20nt或10nt的核苷酸长度。在更进一步的实施方案中，货物RNA可具有在这些预计核苷酸长度范围内的核苷酸长度，例如，在约10nt至5000nt范围之间的核苷酸长度，或其他范围。所公开的细胞外囊泡的货物RNA可以相对较长，例如，其中货物RNA包含mRNA或另一相对较长的RNA。

在一些实施方案中，治疗性货物是可透过膜的药理化合物，其是在细胞分泌EV后被负载到EV中。在一些实施方案中，货物是能引起靶向肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞焦亡的抗癌剂。在一些实施方案中，抗癌剂是小分子药物。例如，在一些实施方案中，货物是依鲁替尼。随附于本文所述的肿瘤靶向肽的抗癌药或抗肿瘤药的其他实例包括但不限于阿柔比星、六甲蜜胺、氨基蝶呤、氨柔比星、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝洛替康、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫氟、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、地西他滨、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、氮芥、美法仑、巯嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、吡柔比星、匹杉琼、甲基苄肼、息疟定雷替曲塞、卢比替康、satraplatin、链脲霉素、硫鸟嘌呤、四硝酸三铂(triplatintetranitrate)、替尼泊苷、拓扑替康、喃氟啶、甲氧苄啶、乌拉莫司汀、戊柔比星、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨和佐柔比星。

为了实现将小RNA负载到EV中，已经提出了基于转染的方法。其他报道已显示，使用载体诱导的细胞中小RNA的表达，可以实现将小RNA负载到EV中。可替代地，可以直接用小RNA转染EV供体细胞。用化疗药物孵育肿瘤细胞也是将药物包装到EV中的另一种方法。为了刺激载药EV的形成，用紫外线辐照细胞以诱导细胞凋亡。诸如促融合脂质体等替代方法也导致将药物负载到EV中。

在一些实施方案中，通过经由浓度梯度的扩散将治疗性货物负载到EV中。

方法

本文还涵盖使用所公开的EV的方法。例如，所公开的细胞外囊泡可用于将所公开的治疗性货物递送至髓源性抑制细胞(MDSC)，其中所述方法包括使靶细胞与所公开的EV接触。

MDSC在许多生理和病理过程(包括癌症、伤口愈合和组织修复)中发挥基础性作用。可以将所公开的EV配制成用于治疗涉及MDSC的疾病或病症的药物组合物的一部分，并且可以将该药物组合物施用于有需要的患者以将货物递送至靶MDSC，从而治疗疾病或病症。因此，本文还公开了治疗受试者的涉及MDSC的疾病的方法，所述方法涉及向受试者施用治疗有效量的含有本文公开的载有货物的靶向MDSC的EV的组合物。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，受试者具有可检测的循环MDSC。最近的研究已证实MDSC能参与许多病理状况，诸如细菌、病毒和寄生虫感染、创伤性应激、败血症、急性炎症、移植物抗宿主病，以及不同的自身免疫性疾病如糖尿病、脑脊髓炎和结肠炎。

可以通过任何合适的方式将所公开的EV施用于受试者。对人或动物受试者的施用可以选自肠胃外、肌内、脑内、血管内、皮下或透皮施用。通常，递送方法是通过注射。优选地，注射为肌内或血管内(例如，静脉内)。医师将能够确定每个特定患者所需的施用途径。

EV优选作为组合物递送。所述组合物可以配制为肠胃外、肌内、脑内、血管内(包括静脉内)、皮下或透皮施用。肠胃外施用的组合物可以包括无菌水溶液，其也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。EV可以配制成药物组合物，其除EV外还可以包括药学上可接受的载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和其他药学上可接受的载剂或赋形剂等。

肠胃外施用的特征通常在于注射，诸如皮下、肌内或静脉内。肠胃外施用的制剂包括准备注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(诸如冻干粉剂，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌混悬剂、准备在即将使用前与媒剂组合的无菌干燥不溶产品和无菌乳剂。溶液可以是水性或非水性的。

如果静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇和其混合物)的溶液。肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载剂包括水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性媒剂的实例包括氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗葡萄糖注射剂、无菌水注射剂、葡萄糖和乳酸林格注射剂。非水性肠胃外媒剂包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。包装于多剂量容器中的肠胃外制剂必须添加抗菌或抑菌浓度的抗菌剂，包括苯酚类或甲酚类、汞类、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯与对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

乳化剂包括聚山梨醇酯80(

单位剂量肠胃外制剂可以包装在安瓿、小瓶或带针的注射器中。如本领域已知和实践的，所有肠胃外施用制剂应为无菌的。

施用治疗有效量的组合物。剂量可以根据各种参数来确定，特别是根据要治疗的患者的病状的严重程度、年龄和体重；施用途径；和所需方案。医师将能够确定任何特定患者所需的施用途径和剂量。最佳剂量可以根据各个构建体的相对效力而有所不同，并且通常可以根据被发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行估算。通常，剂量为0.01mg/kg至100mg/kg体重。典型日剂量为约0.1至50mg/kg，优选约0.1mg/kg至10mg/kg体重，这取决于具体构建体的效力，所要治疗的受试者的年龄、体重和病状，疾病的严重程度以及施用的频率和途径。根据施用是通过肌内注射还是全身(静脉内或皮下)注射，可以施用不同剂量的构建体。

优选地，单次肌内注射的剂量在约5至20μg的范围内。优选地，单次或多次全身注射的剂量在10至100mg/kg体重的范围内。

由于构建体清除(和任何靶向分子的分解)，患者可能必须反复治疗，例如每天、每周、每月或每年一次或多次。本领域普通技术人员可以基于测得的构建体在体液或组织中的停留时间和浓度，容易地估算给药重复率。成功治疗后，可能需要让患者进行维持治疗，其中以0.01mg/kg至100mg/kg体重的维持剂量按每天一次或多次至每20年一次施用构建体。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。

实施例

实施例1：

用miR146a的质粒对DC进行纳米转染。使用ExoQuick从培养基中分离出EV。为了评估体外功效，MDSC或巨噬细胞使用体外单培养，而癌细胞(A549)未使用。用货物EV处理细胞。图4A显示在孵育15分钟后，装饰有ICAM1的EV优先被MDSC或巨噬细胞(例如TAM)内化，而未被癌细胞(A549)内化(EV用绿色荧光染料标记)。进行了miR146a的rq-PCR。图4B显示在装饰的EV中miR-146a的负载。Scr-CT是通过用加扰质粒转染细胞制成的对照(CT)EV。+

实施例2：

用于针对髓源性抑制细胞的靶向治疗的设计的EV阻碍肿瘤生长(图5)。如图6A和图6B所示，基于EV的治疗通过增加CD4和CD8细胞并减少MDSC来影响肿瘤的免疫细胞构成(图6B)。

实施例3：

直接注射由TNT生产的EV以促进肿瘤环境的免疫调节。为了证明EV确实是肿瘤进展减少的原因，使用纳米电穿孔在体外制备EV，然后使其负载miR146a、GLUT-1和ICAM-1，称为“经工程改造的EV”(图7)将胚胎成纤维细胞作为皮肤模型来生产经工程改造的EV。

当经工程改造的EV负载有目标货物时，与对照EV相比，在负载的EV中发现的miR146a的水平增加了大约400倍，而GLUT-1的水平增加了大约3000倍(图8A和图8B)。图8C是蛋白质印迹，显示EV装饰有ICAM-1。

为了测试EEV是否靶向MDSC，将MDCS与癌细胞共培养并在72小时期间用经工程改造的EV处理。当EV未被装饰时，它们同时被MDSC和肿瘤细胞摄取。然而，带装饰的经工程改造的EV选择性地靶向MDSC，而不是肿瘤细胞(图9A)。另外，MDSC转变为促炎表型：促炎标志物水平增加，而抗炎或肿瘤保护标志物水平下降(图9B)。

将具功能性的经工程改造的EV直接注射到乳腺癌鼠模型(PyMT)的肿瘤中，导致在治疗的动物中肿瘤进展减少(图10)。如图11A和图11B所示，注射了经工程改造的EV的肿瘤具有与基线相比更少的单核细胞型MDSC(图11A)。这些结果表明，经工程改造的EV可用于增加促炎骨髓细胞在肿瘤中的比例。

最后，与对照相比，注射经工程改造的EV明显促进了细胞毒性T细胞的浸润增加(图12A和图12B)。综上所述，这些结果证实，当注射EV时，会使肿瘤“更热”或更具促炎性

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文中所引用的出版物和所引的材料具体地通过引用并入。

本领域技术人员仅使用常规实验便会认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同形式。此类等同方案旨在由所附权利要求涵盖。

序列表

<110> 俄亥俄州国家创新基金会(Ohio State Innovation Foundation)

<120> 用于针对髓源性抑制细胞的靶向治疗的细胞外囊泡

<130> 321501-2360

<150> US 62/747,982

<151> 2018-10-19

<160> 2

<170> 专利版本3.5

<210> 1

<211> 537

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Ser Thr Arg Ala Lys Pro Thr Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Val Val Ile Pro Gly Pro Gly Asp Ala Gln Val Ser Ile His

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Phe Leu Pro Gln Gly Gly Ser Val Gln Val Asn Cys

35 40 45

Ser Ser Ser Cys Lys Glu Asp Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Gln Trp

50 55 60

Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ser Gly Pro Asn Trp Lys Leu Phe Glu Leu

65 70 75 80

Ser Glu Ile Gly Glu Asp Ser Ser Pro Leu Cys Phe Glu Asn Cys Gly

85 90 95

Thr Val Gln Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ile Thr Val Tyr Ser Phe Pro

100 105 110

Glu Ser Val Glu Leu Arg Pro Leu Pro Ala Trp Gln Gln Val Gly Lys

115 120 125

Asp Leu Thr Leu Arg Cys His Val Asp Gly Gly Ala Pro Arg Thr Gln

130 135 140

Leu Ser Ala Val Leu Leu Arg Gly Glu Glu Ile Leu Ser Arg Gln Pro

145 150 155 160

Val Gly Gly His Pro Lys Asp Pro Lys Glu Ile Thr Phe Thr Val Leu

165 170 175

Ala Ser Arg Gly Asp His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu

180 185 190

Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ala Leu Phe Ser Asn Val Ser Glu Ala

195 200 205

Arg Ser Leu Arg Thr Phe Asp Leu Pro Ala Thr Ile Pro Lys Leu Asp

210 215 220

Thr Pro Asp Leu Leu Glu Val Gly Thr Gln Gln Lys Leu Phe Cys Ser

225 230 235 240

Leu Glu Gly Leu Phe Pro Ala Ser Glu Ala Arg Ile Tyr Leu Glu Leu

245 250 255

Gly Gly Gln Met Pro Thr Gln Glu Ser Thr Asn Ser Ser Asp Ser Val

260 265 270

Ser Ala Thr Ala Leu Val Glu Val Thr Glu Glu Phe Asp Arg Thr Leu

275 280 285

Pro Leu Arg Cys Val Leu Glu Leu Ala Asp Gln Ile Leu Glu Thr Gln

290 295 300

Arg Thr Leu Thr Val Tyr Asn Phe Ser Ala Pro Val Leu Thr Leu Ser

305 310 315 320

Gln Leu Glu Val Ser Glu Gly Ser Gln Val Thr Val Lys Cys Glu Ala

325 330 335

His Ser Gly Ser Lys Val Val Leu Leu Ser Gly Val Glu Pro Arg Pro

340 345 350

Pro Thr Pro Gln Val Gln Phe Thr Leu Asn Ala Ser Ser Glu Asp His

355 360 365

Lys Arg Ser Phe Phe Cys Ser Ala Ala Leu Glu Val Ala Gly Lys Phe

370 375 380

Leu Phe Lys Asn Gln Thr Leu Glu Leu His Val Leu Tyr Gly Pro Arg

385 390 395 400

Leu Asp Glu Thr Asp Cys Leu Gly Asn Trp Thr Trp Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Gln Gln Thr Leu Lys Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Ser Pro Lys Met

420 425 430

Thr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Gly Ala Leu Leu Pro Ile Gly Val Val

435 440 445

Lys Ser Val Lys Gln Glu Met Asn Gly Thr Tyr Val Cys His Ala Phe

450 455 460

Ser Ser His Gly Asn Val Thr Arg Asn Val Tyr Leu Thr Val Leu Tyr

465 470 475 480

His Ser Gln Asn Asn Trp Thr Ile Ile Ile Leu Val Pro Val Leu Leu

485 490 495

Val Ile Val Gly Leu Val Met Ala Ala Ser Tyr Val Tyr Asn Arg Gln

500 505 510

Arg Lys Ile Arg Ile Tyr Lys Leu Gln Lys Ala Gln Glu Glu Ala Ile

515 520 525

Lys Leu Lys Gly Gln Ala Pro Pro Pro

530 535

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val

1 5