一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体是一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒。

背景技术

淋病奈瑟球菌，又称淋球菌，为严格的人体寄生菌，主要表现为泌尿生殖道的化脓性感染，以尿道炎、宫颈炎多见，如不及时治疗，淋球菌可侵入泌尿生殖道的其他部位，引起附睾、前列腺、输卵管及盆腔等器官的炎症，甚至可经血液传播到全身其他部位，形成淋病性关节炎、腱鞘炎、心内膜炎、脑膜炎等合并症。

沙眼衣原体是一种严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，可侵犯眼、生殖道和其它脏器。沙眼衣原体引起的泌尿生殖道感染已成为常见的性传播疾病，它可引起男性尿道炎、附睾炎、女性宫颈炎、盆腔炎等多种疾病。妊娠期感染了沙眼衣原体可造成早产、胎膜早破、低体重儿或死胎，并可经产道传染给新生儿而引起新生儿肺炎和包涵体性结膜炎。

目前，检测这两种病原微生物常见方法为细胞培养法，具体操作是将样本接种到单细胞层，然后进行48～72小时培养，该方法准确性高，但周期长，需要专门的设备和人员进行操作。还有采用荧光PCR法检测，此种检测方法灵敏度高，但需要特殊的PCR扩增条件和荧光定量PCR仪，且较易产生污染。还有采用胶体金免疫标记方法检测，在胶体金免疫标记技术中，一般是先用裂解液A液裂解样本，通常裂解液A液为NaOH溶液，然后用同体积的裂解液B液中和处理样本，通常裂解液B液为HCl溶液，进而进行检测。

采用胶体金免疫标记试剂盒检测时，一方面，沙眼衣原体是一种严格细胞内寄生的微生物，淋球菌也常见于急性期病人分泌物的白细胞细胞内，所以检测前需先用裂解液A液处理样本，裂解细胞以暴露病原菌；另一方面，裂解完的样本需用裂解液B液进行中和，以适用胶体金免疫标记技术的检测体系。常规操作是向样本处理管中滴加裂解液A液300μL，放入已取拭子，挤压样本处理管并转动拭子，静置2min后向样本处理管中滴加裂解液B液300μL，挤压样本处理管并转动拭子，静置1min后弃去拭子进行检测。该试剂盒组份多，操作复杂，并且需要将裂解液A液和裂解液B液按顺序、同体积比混合，否则易出现NaOH过多造成假阴或HCl过多造成假阳的可能；检测淋球菌和沙眼衣原体，需要不同组份的裂解液A液和裂解液B液，检测淋球菌的裂解液和检测沙眼衣原体的裂解液组份不同，需要多个盛放容器，配件多，需要两次取样，两次裂解，操作复杂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒，其配件少，操作简单，一次取样即可完成两种病原菌的检测，并且避免了因两种裂解液混合顺序或混合比例不当出现错误结果。

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒，包括检测卡和裂解液，所述检测卡包括淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条，所述淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条均包括样品垫。

所述裂解液包括0.05～0.15M NaOH溶液、0.15M Na

所述淋球菌检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.0～5.5的0.15M PB缓冲液、质量百分比0.5% PVP、质量百分比0.05～0.1% Tween20、质量百分比0.2～0.5%蔗糖、质量百分比0.01～0.05% S9和质量百分比0.9% NaCl，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

所述沙眼衣原体检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.0～5.5的0.15M PB缓冲液、质量百分比1% PVP、质量百分比0.05～0.1% Tween20、质量百分比0.2～0.5%蔗糖和质量百分比0.01～0.05% X-100，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

作为一种优化方案，所述淋球菌检测试纸条还包括固相抗体反应膜，所述淋球菌检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被淋球菌单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述淋球菌单克隆抗体1浓度为1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL。

作为一种优化方案，所述沙眼衣原体检测试纸条还包括固相抗体反应膜，所述沙眼衣原体检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被沙眼衣原体单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述沙眼衣原体单克隆抗体1浓度为1.3mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL。

作为一种优化方案，所述淋球菌检测试纸条还包括金标抗体反应膜，所述淋球菌检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15~20μg/mL比例缓慢加入淋球菌单克隆抗体2，充分反应后，以8000~10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得淋球菌金标抗体-胶体金复合物，将淋球菌金标抗体-胶体金复合物按10~15%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

作为一种优化方案，所述沙眼衣原体检测试纸条还包括金标抗体反应膜，所述沙眼衣原体检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

金标抗体反应膜：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15~20μg/mL比例缓慢加入沙眼衣原体单克隆抗体2，充分反应后，以8000~10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物，将沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物按15~20%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

1、本发明技术方案采用的裂解液为碱性，两种病原菌的样品垫为酸性，通过改变两种样品垫处理液的组分，实现了一次取样及一次样本处理，同时完成两种病原菌的检测，操作方便，快速。

2、本发明技术方案仅使用一种组份的裂解液，即可完成两种病原菌的检测，仅需一次取样及一次样本处理，同时完成两种病原菌的检测，极大方便了患者及临床检验人员，较采用两种裂解液按比例搭配使用，配件少、操作简单、快速且避免了因混合顺序或混合比例不当出现错误结果。

3、本发明技术方案仅使用一种组份的裂解液，两种组份的样品垫，两种病原菌共用一种裂解液，其一方面是可裂解细胞，暴露病原菌，一方面是可被检测试剂样品垫中和，直接加样，简化了操作流程。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒，包括检测卡和裂解液，所述检测卡包括淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条，所述淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条均包括吸水纸、底板、样品垫、固相抗体反应膜和金标抗体反应膜，固相抗体反应膜粘贴在底板的中间位置，金标抗体反应膜位于固相抗体反应膜下方，样品垫位于金标抗体反应膜下方，吸水纸位于固相抗体反应膜上方，底板为PVC板，将上述步骤得到的产品平整后，切成3.0mm宽的试纸条。

所述裂解液包括0.05M NaOH溶液、0.15M Na

所述淋球菌检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.5的0.15M PB缓冲液、质量百分比0.5% PVP、质量百分比0.05% Tween20、质量百分比0.2%蔗糖、质量百分比0.01% S9和质量百分比0.9% NaCl，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

样品垫整体为酸性，可以中和细胞裂解后的碱性，保证检测的顺利进行。

所述沙眼衣原体检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.5的0.15M PB缓冲液、质量百分比1% PVP、质量百分比0.05% Tween20、质量百分比0.2%蔗糖和质量百分比0.01% X-100，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

样品垫整体为酸性，可以中和细胞裂解后的碱性，保证检测的顺利进行。

所述淋球菌检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被淋球菌单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述淋球菌单克隆抗体1浓度为1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL。

所述沙眼衣原体检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被沙眼衣原体单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述沙眼衣原体单克隆抗体1浓度为1.3mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL。

所述淋球菌检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15μg/mL比例缓慢加入淋球菌单克隆抗体2，充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得淋球菌金标抗体-胶体金复合物，将淋球菌金标抗体-胶体金复合物按15%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

所述沙眼衣原体检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

金标抗体反应膜：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15μg/mL比例缓慢加入沙眼衣原体单克隆抗体2，充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物，将沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物按20%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

检测方法如下：

（1）样本处理

a、检测样本为女性宫颈分泌物和男性尿道拭子。

b、在附属的处理管中加入0.5mL样本裂解液，将采集样本后的拭子浸在处理管中的裂解液中，挤压处理管并转动拭子15～20次，静止2min。

c、从样本处理管外壁挤干拭子，使裂解后的混合液尽量多的留在管内，弃去拭子。

（2）检测

a、从试剂盒中取出两种病原菌的检测卡，放在台面上。

b、分别向两种病原菌的检测卡的加样孔处滴加3滴（约100µL）裂解样本。

c、10分钟观察结果，15分钟后结果无效。

（3）结果判断

a、阳性（+）：质控线（C）和检测线（T）各出现一条红线。

b、阴性（-）：只有质控线（C）出现一条红线，检测线（T）位置无红线出现。

c、无效：质控线（C）位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效。

实施例2：一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒，包括检测卡和裂解液，所述检测卡包括淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条，所述淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条均包括吸水纸、底板、样品垫、固相抗体反应膜和金标抗体反应膜，固相抗体反应膜粘贴在底板的中间位置，金标抗体反应膜位于固相抗体反应膜下方，样品垫位于金标抗体反应膜下方，吸水纸位于固相抗体反应膜上方，底板为PVC板，将上述步骤得到的产品平整后，切成3.0mm宽的试纸条。

所述裂解液包括0.15M NaOH溶液、0.15M Na

所述淋球菌检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.0的0.15M PB缓冲液、质量百分比0.5% PVP、质量百分比0.1% Tween20、质量百分比0.5%蔗糖、质量百分比0.05% S9和质量百分比0.9% NaCl，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

样品垫整体为酸性，可以中和细胞裂解后的碱性，保证检测的顺利进行。

所述沙眼衣原体检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.0的0.15M PB缓冲液、质量百分比1% PVP、质量百分比0.1% Tween20、质量百分比0.5%蔗糖和质量百分比0.05% X-100，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

样品垫整体为酸性，可以中和细胞裂解后的碱性，保证检测的顺利进行。

所述淋球菌检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被淋球菌单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述淋球菌单克隆抗体1浓度为1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL。

所述沙眼衣原体检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被沙眼衣原体单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述沙眼衣原体单克隆抗体1浓度为1.3mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL。

所述淋球菌检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按20μg/mL比例缓慢加入淋球菌单克隆抗体2，充分反应后，以10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得淋球菌金标抗体-胶体金复合物，将淋球菌金标抗体-胶体金复合物按10%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

所述沙眼衣原体检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

金标抗体反应膜：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按20μg/mL比例缓慢加入沙眼衣原体单克隆抗体2，充分反应后，以10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物，将沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物按15%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

检测方法如下：

（1）样本处理

a、检测样本为女性宫颈分泌物和男性尿道拭子。

b、在附属的处理管中加入0.5mL样本裂解液，将采集样本后的拭子浸在处理管中的裂解液中，挤压处理管并转动拭子15～20次，静止2min。

c、从样本处理管外壁挤干拭子，使裂解后的混合液尽量多的留在管内，弃去拭子。

（2）检测

a、从试剂盒中取出两种病原菌的检测卡，放在台面上。

b、分别向两种病原菌的检测卡的加样孔处滴加3滴（约100µL）裂解样本。

c、10分钟观察结果，15分钟后结果无效。

（3）结果判断

a、阳性（+）：质控线（C）和检测线（T）各出现一条红线。

b、阴性（-）：只有质控线（C）出现一条红线，检测线（T）位置无红线出现。

c、无效：质控线（C）位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效。

实施例3：一种淋球菌、沙眼衣原体两种病原菌联合检测试剂盒，包括检测卡和裂解液，所述检测卡包括淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条，所述淋球菌检测试纸条和沙眼衣原体检测试纸条均包括吸水纸、底板、样品垫、固相抗体反应膜和金标抗体反应膜，固相抗体反应膜粘贴在底板的中间位置，金标抗体反应膜位于固相抗体反应膜下方，样品垫位于金标抗体反应膜下方，吸水纸位于固相抗体反应膜上方，底板为PVC板，将上述步骤得到的产品平整后，切成3.0mm宽的试纸条。

所述裂解液包括0.1M NaOH溶液、0.15M Na

所述淋球菌检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.3的0.15M PB缓冲液、质量百分比0.5% PVP、质量百分比0.08% Tween20、质量百分比0.35%蔗糖、质量百分比0.03% S9和质量百分比0.9% NaCl，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

样品垫整体为酸性，可以中和细胞裂解后的碱性，保证检测的顺利进行。

所述沙眼衣原体检测试纸条中样品垫的制备方法如下：

样品垫处理液包括为pH为5.3的0.15M PB缓冲液、质量百分比1% PVP、质量百分比0.08% Tween20、质量百分比0.35%蔗糖和质量百分比0.03% X-100，将样品垫处理液涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得样品垫。

样品垫整体为酸性，可以中和细胞裂解后的碱性，保证检测的顺利进行。

所述淋球菌检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被淋球菌单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述淋球菌单克隆抗体1浓度为1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL。

所述沙眼衣原体检测试纸条中固相抗体反应膜的制备方法如下：

硝酸纤维素膜上包被沙眼衣原体单克隆抗体1和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述沙眼衣原体单克隆抗体1浓度为1.3mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL。

所述淋球菌检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按18μg/mL比例缓慢加入淋球菌单克隆抗体2，充分反应后，以9000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得淋球菌金标抗体-胶体金复合物，将淋球菌金标抗体-胶体金复合物按12%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

所述沙眼衣原体检测试纸条中金标抗体反应膜的制备方法如下：

金标抗体反应膜：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按18μg/mL比例缓慢加入沙眼衣原体单克隆抗体2，充分反应后，以9000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物，将沙眼衣原体金标抗体-胶体金复合物按17%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥，制得金标抗体反应膜。

检测方法如下：

（1）样本处理

a、检测样本为女性宫颈分泌物和男性尿道拭子。

b、在附属的处理管中加入0.5mL样本裂解液，将采集样本后的拭子浸在处理管中的裂解液中，挤压处理管并转动拭子15～20次，静止2min。

c、从样本处理管外壁挤干拭子，使裂解后的混合液尽量多的留在管内，弃去拭子。

（2）检测

a、从试剂盒中取出两种病原菌的检测卡，放在台面上。

b、分别向两种病原菌的检测卡的加样孔处滴加3滴（约100µL）裂解样本。

c、10分钟观察结果，15分钟后结果无效。

（3）结果判断

a、阳性（+）：质控线（C）和检测线（T）各出现一条红线。

b、阴性（-）：只有质控线（C）出现一条红线，检测线（T）位置无红线出现。

c、无效：质控线（C）位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效。

实验数据如下：

本发明试剂盒的敏感性、特异性验证。

（1）敏感性

外购淋球菌、沙眼衣原体菌液，分别梯度稀释至10

备注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

（2）分析特异性

以下菌液为10

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。