用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及动物养殖领域，具体涉及用于蜀宣花牛的胶体金检测早孕试纸条、制备方法及应用。

背景技术

蜀宣花牛是我国南方地区的耐湿热性气候、耐粗饲的乳肉兼用型牛，目前群体总数7万余头，基础母牛2.4万余头，存栏基数大。蜀宣花牛作为四川省主推品种已推广到四川的21个市州，并在国内推广到贵州、云南、西藏、重庆、甘肃、江西、广东等12个省。

目前，蜀宣花牛的传统的早孕检测方法需要专门的实验室以及具有良好生产经验的兽医人员，不适用于养牛合作社、家庭农场、农户等推广使用。同时，具有便捷、高效的胶体金检测早孕试纸是基于奶牛乳汁中孕酮水平开发。例如，专利CN104237538B提供了一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条，其基于奶牛的乳汁孕酮进行试纸条研发，能够有效地检测奶牛的妊娠情况，特异性、敏感性和稳定性均较高；专利CN 1796998A提供了一种用于奶牛早期妊娠诊断的试纸，其同样基于奶牛的乳汁孕酮进行试纸研发，试纸具备特异性高、灵敏度高、易储存的特点。这类基于奶牛乳汁中孕酮水平开发的胶体金检测早孕试纸条仅能用于经产奶牛，而不适用于青年母牛，且不同品种的牛在妊娠期各阶段的激素水平变化差异巨大，故有必要研发一种适用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条以弥补乳肉兼用牛上的早孕试纸空白，进而高效地检测蜀宣花牛母牛早期妊娠状态，从而更好地指导蜀宣花牛临床生产，缩短母牛繁殖进程，提高繁殖率。

发明内容

本发明的一个目的在于提供用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法以及采用该制备方法制备的试纸条，该制备方法通过分析蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，推断蜀宣花牛的发情周期，并确定用于开发所述试纸条的生殖激素，基于该生殖激素进行胶体金试纸的研发、制备，得到的胶体金试纸能够简单、高效地检测蜀宣花牛母牛早期妊娠状态，缩短母牛繁殖进程，提高繁殖率，利于指导临床配种工作，弥补了在乳肉兼用牛上胶体金早期妊娠检测空白，具有极高的实际应用价值。

上述目的通过下述技术方案实现：

用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

建立蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，基于所述主要生殖激素变化模式判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内的主要生殖激素变化模式确定用于开发所述试纸条的关键生殖激素；

利用还原法制备胶体金溶液；

基于所述关键生殖激素筛选单克隆抗体，纯化筛选得到的单克隆抗体，确定筛选的单克隆抗体的标记条件；

制备并纯化金标单克隆抗体复合物；

组装胶体金检测试纸条。

现有技术中，市售的早孕检测试纸条多基于奶牛乳汁中的孕酮水平进行开发，该类试纸条仅能用于经产奶牛而不适用于青年母牛，且各品种牛在妊娠期各阶段的激素水平变化差异大，故目前缺乏针对蜀宣花牛的妊娠期的激素水平变化特点开发的早孕检测试纸条，蜀宣花牛的早孕检测方法仍以传统的B超、直肠检测为主，这类检测方法需要专门的实验室以及具有良好生产经验的兽医人员，不适用于养牛合作社、家庭农场、农户等推广使用。为弥补蜀宣花牛早孕检测试纸条的技术空白。本申请提供了一种蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法。

本技术方案中，首先建立蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式。母畜进入妊娠期后，机体发生特殊生理性变化，下丘脑——垂体——甲状腺轴系统处于应激状态，导致繁殖相关激素的生成及代谢发生变化。通过明确蜀宣花牛妊娠过程中繁殖相关技术的变化模式，即可判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内的主要生殖激素变化模式确定用于开发所述试纸条的关键生殖激素，为精准管控繁殖生产过程提供重要理论依据。

在部分实施例中，随机选择年龄相近、膘情适中、生殖机能正常的蜀宣花牛母牛进行同期发情，确定发情的母牛并进行配种，自母牛配种当天开始至第36天止，每隔3天采集血样或尿样。结合直肠检测和B超检测，根据妊娠反应情况将实验群体分为妊娠组和未妊娠组。通过分析妊娠组和未妊娠组中的母牛在发情期间的生殖激素变化模式，判断出蜀宣花牛的发情周期，再通过对比妊娠组和未妊娠组的主要生殖激素变化模式，根据差异是否显著以确定用于开发试纸条的关键生殖激素。

在一个或多个实施例中，所述主要生殖激素包括促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)、孕酮(P4)和雌激素(E2)，基于蜀宣花牛妊娠早期促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式，选择怀孕激素水平与未孕激素水平差异显著的孕酮作为关键生殖激素。

在一个或多个实施例中，基于蜀宣花牛妊娠早期促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式判断蜀宣花牛的发情周期为21天，且在第21天孕牛与未孕牛的血液孕酮差异极显著(p<0.01)，孕牛与未孕牛的尿液孕酮差异显著(p<0.05)，故选择第21天的血液和/或尿液孕酮作为判定蜀宣花牛是否早孕的关键生殖激素，并就此激素进行胶体金试纸的制备。

尽管蜀宣花牛的孕牛与未孕牛的尿液或血液中关键生殖激素差异显著或极显著，但其差异通常小于0.5μmol/L，例如，血液中的孕酮水平在发情当天(0天或第21天)为0.34±0.11μmol/L，在第12天达到峰值时为0.70±0.21μmol/L。该差异远小于奶牛乳汁孕酮在未孕牛和孕牛间的差异，因此，对蜀宣花牛胶体金检测试纸条的检测灵敏度有更高的要求。

本技术方案中，依据蜀宣花牛关键生殖激素的激素水平变化规律，采用小分子竞争法制备基于血清和/或尿液的胶体金试纸条。

在部分实施例中，利用还原法制备胶体金溶液时，具体包括以下步骤：加热终浓度0.01％的氯金酸溶液至沸腾，向沸腾的氯金酸溶液中加入1％的柠檬酸三钠水溶液直至反应溶液变为红色后，继续加热直至颜色稳定不变；冷却后，向反应溶液中加入超纯水恢复到原体积，加入0.02％的NaN

在一个或多个实施例中，胶体金溶液制备后，可通过下述方法综合鉴定胶体金溶液的质量：通过肉眼观察胶体金的颜色变化，看有无浑浊、是否透明、有无折光性和有无凝胶；通过电镜观察胶体金颗粒大小、形态和密度；通过可见光谱在分光光度计OD400

本技术方案中，基于所述关键生殖激素筛选单克隆抗体，纯化筛选得到的单克隆抗体，确定筛选的单克隆抗体的标记条件。在部分实施例中，通过棋盘滴定筛选得到的单克隆抗体为牛孕酮小鼠单克隆抗体，孕酮(PROG)单克隆抗体(50H10细胞株)，偶联物为孕酮(PROG)-BSA(或OVA)抗原；纯化时，将牛孕酮小鼠单克隆抗体放入透析袋中，将透析袋放入0.01M的PB液中，充分透析过夜，之后将透析后的牛孕酮小鼠单克隆抗体离心去除聚合物，取上清液。在一个或多个实施例中，对透析袋进行预处理，将透析袋剪成多个小段，严格检查是否有漏洞，用蒸馏水洗净后置于500mL含1mmol/L EDTA-Na的2％NaHCO

筛选、纯化单克隆抗体后，确定所筛选的单克隆抗体的标记条件。

在部分实施例中，所确定的单克隆抗体的标记条件包括采用胶体金梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适pH值。具体地，在各玻璃试管中分别加入制备好的胶体金溶液，用碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH分别调为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5；取牛孕酮小鼠单克隆抗体加入上述胶体金管中，混匀后室温放置；之后每管分别加入10％Nacl溶液，混匀，室温静置1～2小时；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH值；再将pH调为梯度最低pH±0.1；重复上述试验。最后记录仍保持红色的最低PH，即为最适PH。在一个或多个实施例中，牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适pH值为8.0，通过确定最适pH值，能够进一步提高检测试纸条的灵敏度，以检测怀孕和未孕的孕酮差值更小的蜀宣花牛。

在部分实施例中，所确定的单克隆抗体的标记条件包括采用蛋白梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适浓度。具体地，在各玻璃试管中分别加入制备好的胶体金溶液，优选地，所述胶体金溶液已调到最适pH值；将牛孕酮小鼠单克隆抗体用纯化水稀释成1mg/mL，各取0、5、10、20、30、40、60、80μL按顺序加入上述小试管中混匀；放置一段时间后，在每一小试管中加入10％Nacl水溶液，混匀，室温静置1～2小时；观察各小试管颜色变化，对照管和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的试管，呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入的蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持红色不变，找出胶体金液由红变蓝的交界管，其所含的蛋白量即为稳定胶体金所需的最小蛋白量。在一个或多个实施例中，孕酮小鼠单克隆抗体稳定1mL胶体金所需的最小抗体量为10μg/mL。

确定单克隆抗体及标记条件后，即可制备并纯化金标单克隆抗体复合物。

在部分实施例中，所述制备并纯化金标单克隆抗体复合物包括以下步骤：

制备：离心胶体金溶液以去除胶体金溶液中较大的聚合物，利用K

通过将胶体金溶液离心能够除去胶体金溶液制备过程中形成的较大的聚合物，以免它们在标记过程中影响抗体蛋白对胶体金颗粒的吸附，优选地，胶体金溶液在以3000r/min离心20min。10％BSA作为稳定剂，在一个或多个实施例中，也可以加入10％聚乙二醇(MW20000)，室温搅拌10min，9000-11000r/min离心40-60min，弃去上清，沉淀溶于胶体金—抗体保存液中，用0.45um滤膜过滤，所得即为胶体金—抗体结合物原液。

纯化：将胶体金溶液以第一转速离心后吸取上清液，将上清液以第二转速离心后弃去上清液，将沉淀溶解于原体积的TBS溶液中，所述TBS溶液的pH值为8.0，TBS溶液含有1％BSA和0.02％NaN

纯化步骤采用低温超速离心法，先将金标抗体在4℃下用1500r/min低速离心，吸取上清液后弃沉淀，之后上清液在4℃下以13000r/min超速离心，弃去上清液，最后将沉淀以原体积的TBS缓冲液溶解，重复离心洗涤2～3次，原体积的1/10重悬沉淀，4℃保存备用。

进一步地，组装胶体金检测试纸条包括以下步骤：

在底板中间粘贴抗体固相NC膜，即灌注有金标抗体的玻璃纤维膜，所述抗体固相NC膜上设置有检测线(T线)和对照线(C线)，所述检测线的孕酮抗原的工作浓度为1.0～1.5mg/mL，所述对照线的羊抗鼠IgG抗体的工作浓度为1.0～1.5mg/mL；

在底板上靠近检测线的一端上粘贴探针条带，所述探针条带与所述抗体固相NC膜至少部分重叠，在底板下端粘贴样本垫，所述样本垫与所述探针条带至少部分重叠；

在底板上靠近对照线的一端上粘贴吸水纸，所述吸水纸与所述抗体固相NC膜至少部分重叠。

优选地，用于检测血液孕酮的试纸条的T线工作浓度为1.0mg/mL，用于检测尿液孕酮的试纸条的T线工作浓度为1.5mg/mL。

在部分实施例中，用工作液将胶体金－抗体结合物原液按1:2、1:4、1:8、1:16进行稀释，取胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37℃烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度。在一个或多个实施例中，胶体金－抗体结合物原液工作浓度为1:4，该比例能够进一步提高金标垫的检测效果。

在部分实施例中，上述组装完成后，底板切割为2.8mm宽的试纸条并放入空白卡壳中形成胶体金检测试纸条。在一个或多个实施例中，在完成组装的试纸条的上表面贴附有锡箔纸，用于保护检测线、对照线和检测孔不受污染，在检测时，去除锡箔纸即可。

上述制备方法所制备的试纸条的检测原理为：试纸条含有被事先固定于硝酸纤维素膜测试区(T)的抗原和控制区(C)的Ⅱ抗以及固定于结合垫上的金标抗体。待测样本加入后，T区包膜固相的抗原将和样本中的目标抗原竞争金标抗体，若样本为阳性，则抗体跟样本中的目标抗原结合，此时与T区抗原结合的抗体将变少，或者完全没有，所以T区的紫红色条带将变浅或者直接消线；若样本为阴性，则T区会出现紫红色条带。无论样本中是否有孕酮存在，C区都会出现一条紫红色条带，若C区没有紫红色条带，则试纸条检测结果无效。

上述制备方法基于蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，判断了蜀宣花牛的发情周期，并确定用于开发早孕检测试纸条的关键生殖激素，围绕关键生殖激素制备胶体金检测试纸条，构建了标准化的能够用于检测蜀宣花牛早孕检测的试纸条的制备方法和流程，得到的胶体金试纸能够简单、高效地检测蜀宣花牛母牛早期妊娠状态，缩短母牛繁殖进程，提高繁殖率，利于指导临床配种工作，弥补了在乳肉兼用牛上胶体金早期妊娠检测空白，具有极高的实际应用价值。此外，通过确定最适pH值、最小抗体量等标记条件，确定胶体金－抗体结合物原液工作浓度，以及建立检测线和对照线的工作浓度，使试纸条具有更高的灵敏度，能够检测出蜀宣花牛孕牛和未孕牛的小于0.5μmol/L的激素差值。

本发明的另一个目的在于提供一种用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条，所述试纸条采用前述任一种试纸条制备方法制备得到。该检测试纸条的检测灵敏度能够达到5ng/mL，因此能够通过检测蜀宣花牛尿液或血液中的孕酮差值是否超过阈值，敏感性和特异性高，能够便捷、高效地检测蜀宣花牛是否怀孕，进而高效地检测蜀宣花牛母牛早期妊娠状态，从而更好地指导蜀宣花牛临床生产，缩短母牛繁殖进程，提高繁殖率。

本发明的又一个目的在于提供前述任一种试纸条在蜀宣花牛早孕检测装置中的应用。

现有技术中，进行牛早孕检测时，工作人员将待检测的采样管标记序号后存放于样管架上，之后依次取出采样管，在对应序号的试纸条上进行检测。然而，在样本检测量较大时，这种方式不仅容易因产生误操作，导致待检测的采样管与试纸条上的序号不一致，试验数据错误，而且试纸条相互之间存在影响，造成并非由试纸条的灵敏度和特异性导致的检测结果不准确，同时，传统的检测方式操作不方便，也不便于采样管、试纸条的管理，检测效率低。

为了解决上述问题，本技术方案中，所述检测装置包括壳体，所述壳体内设置有若干检测单元，所述检测单元包括有用于容纳所述试纸条的检测腔，所述检测腔的顶部设置有通槽，所述通槽内设置有用于装载采样管的装载件，所述装载件能够在通槽内翻转，装载件通过拉绳连接有位于检测腔内的推板，在试纸条插入至检测腔中时，所述推板能够受试纸条的推动在检测腔内移动，并在移动过程中通过拉绳拉动装载件翻转，翻转的装载件带动采样管翻转，采样管内的待测液体能够通过通槽落入至检测腔内的试纸条的检测孔内。

具体地，检测装置包括壳体，壳体至少一端为开口端以使得试纸条能够放入到壳体内。在一个或多个实施例中，壳体的底面上设置有若干隔板，所述隔板将壳体的内部空间分隔为若干相互独立的检测单元。所述检测单元内设置有检测腔，试纸条能够通过壳体的开口端放入至检测腔内。

检测腔的顶部设置有通槽，通槽连通检测腔的内部和外部空间。检测腔内设置的能够相对于通槽翻转的装载件，该装载件上设置有能够卡接采样管的装载槽，装载槽的尺寸与采样管相匹配。装载件翻转时带动装载的采样管翻转，驱使采样管内的待检测尿液或血液通过通槽倒入至对应的检测腔内部。

检测腔内设置有推板，推板与装载件之间设置的拉绳用于在推板移动时，驱动装载件翻转。推板的驱动力在于工作人员作用于试纸条卡壳上的推力。

检测前，先将各试纸条放置在各检测单元的入口处，将各待检测采样管放置在各检测单元的装载件内并开启采样管，此时试纸条不对推板产生作用力，推板与装载件之间的拉绳处于自然松弛状态；检测时，依次向内推动试纸条，向检测腔内移动的试纸条驱动推板移动，移动的推板通过拉绳驱动装载件翻转，待推板移动至预设位置时，装载件翻转预设的角度使得采样管内的液体能够通过通槽落入至检测腔内的试纸条的检测孔内，从而完成采样；采样完成一段时间后，取出各试纸条进行样本分析。

在一个或多个实施例中，在检测前可以采用半透膜、透析膜对待检测样品进行过滤，取一定量的滤液加入至待检测采样管中。在一个实施例中，所述待检测采样管内的样品量为150～200μL。

通过上述设置，试纸条与采样管在检测前即完成一一对应并核对，能够确保试纸条与采样管的序号的一致性，有效地降低了错误率；同时，各试纸条处于独立的检测单元内，相互之间不会造成影响，大幅地提高了检测结果的准确性；另外，在推动试纸条进入检测腔的同时驱动待检测采样管内的液体倒出，操作方便、规范、快速，能够显著地提高检测效率和准确性，有利于大规模推广应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供的用于蜀宣花牛的制备方法基于蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，判断了蜀宣花牛的发情周期，并确定用于开发早孕检测试纸条的关键生殖激素，围绕关键生殖激素制备胶体金检测试纸条，构建了标准化的能够用于检测蜀宣花牛早孕检测的试纸条的制备方法和流程，得到的胶体金试纸能够简单、高效地检测蜀宣花牛母牛早期妊娠状态，缩短母牛繁殖进程，提高繁殖率，利于指导临床配种工作，弥补了在乳肉兼用牛上胶体金早期妊娠检测空白，具有极高的实际应用价值；

2、本发明的制备方法通过确定最适pH值、最小抗体量等标记条件，确定胶体金－抗体结合物原液工作浓度，以及建立检测线和对照线的工作浓度，使试纸条具有更高的灵敏度，能够检测出蜀宣花牛孕牛和未孕牛的小于0.5μmol/L的激素差值；

3、本发明通过对检测装置的改进，使得试纸条与采样管在检测前即完成一一对应并核对，能够确保试纸条与采样管的序号的一致性，有效地降低了错误率；同时，各试纸条处于独立的检测单元内，相互之间不会造成影响，大幅地提高了检测结果的准确性；另外，在推动试纸条进入检测腔的同时驱动待检测采样管内的液体倒出，操作方便、规范、快速，能够显著地提高检测效率和准确性，有利于大规模推广应用。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明具体实施例中制备方法的流程示意图；

图2为本发明具体实施例中蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，其中，图2(a)为血清中促黄体素的变化情况；图2(b)为血清中促卵泡素的变化情况；图2(c)为血清中雌激素的变化情况；图2(d)为血清中孕酮的变化情况；图2(e)为尿液中孕酮的变化情况；

图3为本发明具体实施例中抗体标记最适pH确定实验的结果图；

图4为本发明具体实施例中抗体最适标记量确定实验的结果图；

图5为本发明具体实施例中试纸条不同判定结果的示意图；

图6为本发明具体实施例中用于安装试纸条的检测装置的结构示意图；

图7为本发明具体实施例中检测单元在准备状态下的结构示意图；

图8为本发明具体实施例中检测单元在检测状态下的结构示意图；

图9为本发明具体实施例中锁紧件受推板触发时的示意图；

图10为本发明具体实施例中锁紧件与推板锁紧时的示意图；

图11为本发明具体实施例中防溅板的结构示意图。

附图中标记及对应的零部件名称：

1-盒体，2-隔板，3-通槽，4-装载件，5-挡板，6-推板，61-卡槽，7-第一弹簧，8-防溅板，81-开口，82-容纳腔，83-汇流面，9-锁紧件，91-连接板，92-第二弹簧，93-卡凸，10-拉绳，11-转轴，12-采样管，13-试纸条，14-检测孔。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法即可制备。

本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯或胶体金检测试纸条领域常规的纯度要求。

本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或者通过常规方法制备得到。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1：

如图1所示的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

建立蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，基于所述主要生殖激素变化模式判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内的主要生殖激素变化模式确定用于开发所述试纸条的关键生殖激素；

利用还原法制备胶体金溶液；

基于所述关键生殖激素筛选单克隆抗体，纯化筛选得到的单克隆抗体，确定筛选的单克隆抗体的标记条件；

制备并纯化金标单克隆抗体复合物；

组装胶体金检测试纸条。

在部分实施例中，所述主要生殖激素包括促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素，基于蜀宣花牛妊娠早期促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式，选择怀孕激素水平与未孕激素水平差异显著的孕酮作为关键生殖激素。

在部分实施例中，利用还原法制备胶体金溶液包括以下步骤：加热氯金酸溶液至沸腾，向沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠水溶液直至反应溶液变为红色后，继续加热直至颜色稳定不变；冷却后，向反应溶液中加入超纯水恢复到原体积，加入NaN

在部分实施例中，所述筛选得到的单克隆抗体为牛孕酮小鼠单克隆抗体，偶联物为孕酮(PROG)-BSA(或OVA)抗原；纯化时，将牛孕酮小鼠单克隆抗体放入透析袋中，将透析袋放入磷酸缓冲液中，充分透析过夜，之后将透析后的牛孕酮小鼠单克隆抗体离心去除聚合物，取上清液。

在部分实施例中，所述制备并纯化金标单克隆抗体复合物包括以下步骤：

制备：离心胶体金溶液以去除胶体金溶液中较大的聚合物，利用K

纯化：将胶体金溶液以第一转速离心后吸取上清液，将上清液以第二转速离心后弃去上清液，将沉淀溶解于原体积的TBS溶液中，所述TBS溶液的pH值为8.0，TBS溶液含有1％BSA和0.02％NaN

在部分实施例中，组装胶体金检测试纸条包括以下步骤：

在底板中间粘贴抗体固相NC膜，所述抗体固相NC膜上设置有检测线和对照线，用于检测血液孕酮的试纸条的T线工作浓度为1.0mg/mL，用于检测尿液孕酮的试纸条的T线工作浓度为1.5mg/mL，所述对照线的羊抗鼠IgG抗体的工作浓度为1.0～1.5mg/mL；

在底板上靠近检测线的一端上粘贴探针条带，所述探针条带与所述抗体固相NC膜至少部分重叠，在底板下端粘贴样本垫，所述样本垫与所述探针条带至少部分重叠；

在底板上靠近对照线的一端上粘贴吸水纸，所述吸水纸与所述抗体固相NC膜至少部分重叠。

上述制备方法所制备的试纸条的检测原理为：试纸条含有被事先固定于硝酸纤维素膜测试区(T)的抗原和控制区(C)的Ⅱ抗以及固定于结合垫上的金标抗体。待测样本加入后，T区包膜固相的抗原将和样本中的目标抗原竞争金标抗体，若样本为阳性，则抗体跟样本中的目标抗原结合，此时与T区抗原结合的抗体将变少，或者完全没有，所以T区的紫红色条带将变浅或者直接消线；若样本为阴性，则T区会出现紫红色条带。无论样本中是否有孕酮存在，C区都会出现一条紫红色条带，若C区没有紫红色条带，则试纸条检测结果无效。

如图5所示，当C线显色、T线不显色或者相比C线有减弱显色趋势，则可判定为阳性；当C线显色，T线肉眼可见且与C线显色程度相当，则可判定为阴性；当C线不显色，无论T线是否显色，该试纸条均判为无效。

本实施例的制备方法基于蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，判断了蜀宣花牛的发情周期，并确定用于开发早孕检测试纸条的关键生殖激素，围绕关键生殖激素制备胶体金检测试纸条，构建了标准化的能够用于检测蜀宣花牛早孕检测的试纸条的制备方法和流程，得到的胶体金试纸能够简单、高效地检测蜀宣花牛母牛早期妊娠状态，缩短母牛繁殖进程，提高繁殖率，利于指导临床配种工作，弥补了在乳肉兼用牛上胶体金早期妊娠检测空白，具有极高的实际应用价值。

实施例2：

在实施例1的基础上，采用以下方法制备用于蜀宣花牛血液或尿液孕酮的胶体金检测试纸条。

1)建立蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式

随机选择年龄相近、膘情适中、生殖机能正常的蜀宣花牛母牛18头进行同期发情，确定12头牛发情并适时配种，自母牛配种当天开始至第36天止，每隔3天采集血样或尿样，每次采血液10ml或尿样5ml。配合直肠检测和B超检测，根据妊娠反应情况将实验群体分为未妊娠组和妊娠组，其中未妊娠组7头，妊娠组5头。

分析未妊娠组和妊娠组在发情期间的促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)、孕酮(P4)和雌激素(E2)的变化情况。

主要生殖激素的变化情况如图2(a)～(e)所示。通过实验发现，未孕牛在发情后第21天出现强烈的LH峰，而孕牛未出现LH波峰且趋势平稳，显示未孕牛再次发情并排卵而孕牛未进入新的发情周期。青年牛的LH峰值与体内胚胎发育能力有关系，排卵前LH峰值可以提高胚胎细胞质的成熟，但不是影响卵母细胞核成熟的主要因素。而未孕牛与孕牛在情期中的FSH均表现出1～2个小的波峰，推测与促进母牛卵泡发育有关，但同一天里在不同时间段的血清FSH浓度差别很大，因而在自然发情牛中很难捕捉到发情当天的FSH峰。孕酮属于甾体类激素，主要由卵巢黄体细胞产生，卵泡的内膜细胞和妊娠时的胎盘也能产生。通过实验发现，蜀宣花牛正常情期血液及尿液中的孕酮水平在发情当天处于低值，而在12天达到峰值，这主要是因为未孕牛黄体在发情周期8～10天达到最大，期间孕酮浓度持续上升而达到峰值，黄体退化发生在发情周期的15～19天，此时孕酮浓度也会急剧下降。而对于妊娠牛，黄体未发生退化，因此孕酮浓度一直平稳上升。同时，在发情周期中，E2水平上升是与每个卵泡波息息相关的，优势卵泡继续增长，同时其他卵泡开始衰退，而随之E2水平下降。研究发现蜀宣花牛母牛E2的分泌在发情开始时很高，随后逐步下降并在12天为最低值，与P4变化相反，在未孕牛发情时E2达到下一个高峰，而怀孕肉牛则一直保持较低水平。P4下降时，E2却上升，并在发情时达到较高水平，这与卵泡的发育及形态变化相一致。所以引起发情行为的激素变化特征是孕酮水平的下降，随后雌激素的迅速上升。

因此，基于蜀宣花牛妊娠早期促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式判断蜀宣花牛的发情周期为21天。蜀宣花牛不同实验组在第21天的主要生殖激素差异表如表1所示。

表1

由表1可知，孕牛与未孕牛的血液孕酮差异在21天差异极显著(p<0.01)，尿液孕酮水平差异显著(p<0.05)，并且通过比较第21天主要生殖激素差异及后续变化趋势，选择第21天的血液和/或尿液孕酮作为判定蜀宣花牛是否早孕的关键生殖激素，并就此激素进行胶体金试纸的制备。

尽管蜀宣花牛的孕牛与未孕牛的尿液或血液中关键生殖激素差异显著或极显著，但其差异通常小于0.5μmol/L，例如，血液中的孕酮水平在发情当天(0天或第21天)为0.34±0.11μmol/L，在第12天达到峰值时为0.70±0.21μmol/L。该差异远小于奶牛乳汁孕酮在未孕牛和孕牛间的差异，因此，对蜀宣花牛胶体金检测试纸条的检测灵敏度有更高的要求。

本实施例依据蜀宣花牛关键生殖激素的激素水平变化规律，采用小分子竞争法制备基于血清和/或尿液的胶体金试纸条。

2)利用还原法制备胶体金溶液

取终浓度0.01％的氯金酸溶液，微波炉中加热至沸腾，搅动下快速准确加入现配的1％柠檬酸三钠水溶液，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为红色，中档继续煮沸5min直至颜色稳定不变，冷却后用超纯水恢复到原体积，加入0.02％的NaN

制备完成后，可通过下述方法综合鉴定胶体金溶液的质量：通过肉眼观察胶体金的颜色变化，看有无浑浊、是否透明、有无折光性和有无凝胶；通过电镜观察胶体金颗粒大小、形态和密度；通过可见光谱在分光光度计OD400

3)筛选并纯化单克隆抗体

通过棋盘滴定筛选出试纸开发的最适单克隆抗体为孕酮(PROG)单克隆抗体(50H10细胞株)，偶联物为孕酮(PROG)-BSA(或OVA)抗原。

将透析袋剪成10cm长的小段，严格检查无漏洞时方可使用。先用蒸馏水洗净，然后置于500mL含1mmol/LEDTA-Na的2％NaHCO

将待透析的单抗放入处理好的透析袋中，扎好后放入0.01M的PB液中4℃充分透析过夜，然后将透析后的抗体10000r/min 4℃离心1h，去除聚合物，取上清液。

4)制备并纯化金标单克隆抗体复合物

标记前，将胶体金3000r/min离心20min，除去制备过程形成的大的聚合物，以免聚合物在标记过程中影响抗体蛋白对胶体金颗粒的吸附。用0.2mol/LK

在一个或多个实施例中，也可以加入10％聚乙二醇(MW20000)，室温搅拌10min，9000-11000r/min离心40-60min，弃去上清，沉淀溶于胶体金—抗体保存液中，用0.45um滤膜过滤，所得即为胶体金—抗体结合物原液。

制备完成后，采用低温超速离心法纯化金标蛋白，以除去溶液中未标记的蛋白和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。先将金标抗体在4℃下用1500r/min低速离心15min，小心吸取上清液，弃去沉淀。然后将上清液再以13000r/min 4℃离心，弃去上清液，最后将沉淀以原体积的pH 8.0 0.1moL/L TBS(内含1％BSA，0.02％叠氮钠)溶解，重复离心洗涤2-3次，原体积的1/10重悬沉淀。4℃保存备用。

5)组装胶体金检测试纸条

将PVC底板切成宽2.8mm×长6cm的条；

在PVC底板中间粘贴抗体固相NC膜，距离上段1.5cm；

在PVC底板下端，即靠近NC膜的T线端粘贴玻璃纤维膜探针条带，并与抗原固相NC膜重叠0.1cm，然后在下端粘贴1.7cm宽样本垫与探针条带重叠0.1-0.2cm；

在PVC底板上端，即靠近NC膜的C线端粘贴1.7cm宽的吸水纸，并与抗体固相NC膜重叠0.1-0.2cm；

切成2.8mm宽的试纸条，并装入空白卡壳中；

所述检测线的孕酮抗原的工作浓度为1.0～1.5mg/mL，其中，用于检测血液孕酮的试纸条的T线工作浓度为1.0mg/mL，用于检测尿液孕酮的试纸条的T线工作浓度为1.5mg/mL；所述对照线的羊抗鼠IgG抗体的工作浓度为1.0～1.5mg/mL。

在一个或多个实施例中，用工作液将胶体金－抗体结合物原液按1:2、1:4、1:8、1:16进行稀释，取胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37℃烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度。在一个或多个实施例中，胶体金－抗体结合物原液工作浓度为1:4，该比例能够进一步提高金标垫的检测效果。

在一个或多个实施例中，选择几种不同型号的NC膜，通过跑板功能测试、胶体金溶液在不同型号NC膜上流动性、滞后度和背景残留的测试和NC膜的重新选择测试等试验，确定最适型号的NC膜为赛多利斯CN140。

在一个或多个实施例中，用0.01mol/LpH为8.0PBS将孕酮抗原和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜。T线与C线的距离为0.5cm，参数均为1μL/cm，喷好的NC膜置37～45℃烤干干燥8h以上。

在一个或多个实施例中，在完成组装的试纸条的上表面贴附有锡箔纸，用于保护检测线、对照线和检测孔不受污染，在检测时，去除锡箔纸即可。

在一个或多个实施例中，还可以设置标准卡，以便于工作人员比对、确认检测结果。

实施例3：

在上述实施例的基础上，所述确定筛选的单克隆抗体的标记条件包括采用胶体金梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适pH值；所述确定筛选的单克隆抗体的标记条件包括采用蛋白梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适浓度。

1)确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适pH值

用0.02％20nm胶体金标记牛孕酮小鼠单克隆抗体，用胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH值。具体如下：

(a)取7支采样管，分别加入1mL制备好的胶体金溶液；

(b)用0.2mol/L碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH分别调为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5；

(c)取50μL 1mg/ml的牛孕酮小鼠单克隆抗体加入上述采样管中，混匀后室温放20min；

(d)然后每管分别加入100μL 10％NaCl溶液，混匀，室温静置1～2h；

(e)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH值；

(f)再将pH值调为梯度最低pH±0.1；重复上述试验。

记录仍保持红色的最低pH，即为最适pH值。

实验结果如图3所示，据此确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适pH值为8.0。通过确定最适pH值，能够进一步提高检测试纸条的灵敏度，以检测怀孕和未孕的孕酮差值更小的蜀宣花牛。

2)确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适浓度

采用蛋白梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金结合的最适浓度。具体如下：

(a)取8支采样管，分别加入1mL调到pH为8.0的胶体金溶液；

(b)将牛孕酮小鼠单克隆抗体用纯化水稀释成1mg/mL，各取0、5、10、20、30、40、60、80μL按顺序加入上述小试管中混匀；

(c)放置10min后，在各采样管中加入10％NaCl水溶液0.1mL，混匀，室温静置1-2h；

(d)观察小试管颜色变化，对照管和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的采样管，呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入的蛋白量达到或超过最低稳定量的采样管则保持红色不变，找出胶体金液由红变蓝的交界管，其所含的蛋白量即为稳定1ml胶体金所需的最小蛋白量。

实验结果如图4所示，据此确定孕酮小鼠单克隆抗体稳定1mL胶体金所需的最小抗体量为10μg/mL。

上述制备方法中，通过确定最适pH值、最小抗体量等标记条件，确定胶体金－抗体结合物原液工作浓度，以及建立检测线和对照线的工作浓度，使试纸条具有更高的灵敏度，能够检测出蜀宣花牛孕牛和未孕牛的小于0.5μmol/L的激素差值。

实施例4：

在上述实施例的基础上，提供一种前述任一种检测试纸条在蜀宣花牛早孕检测装置中的应用，如图6至图11所示，所述检测装置包括壳体1，所述壳体1内设置有若干检测单元，所述检测单元包括有用于容纳所述试纸条13的检测腔，所述检测腔的顶部设置有通槽3，所述通槽3内设置有用于装载采样管12的装载件4，所述装载件4能够在通槽3内翻转，装载件4通过拉绳10连接有位于检测腔内的推板6，在试纸条13插入至检测腔中时，所述推板6能够受试纸条13的推动在检测腔内移动，并在移动过程中通过拉绳10拉动装载件4翻转，翻转的装载件4带动采样管12翻转，采样管12内的待测液体能够通过通槽3落入至检测腔内的试纸条13的检测孔14内。

在一个或多个实施例中，壳体的底面上设置有若干隔板2，所述隔板2将壳体的内部空间分隔为若干相互独立的检测单元。所述检测单元内设置有检测腔，试纸条能够通过壳体的开口端放入至检测腔内。

在一个或多个实施例中，如图6所示，所述装载件的外壁上设置有转轴11，所述转轴活动插入至通槽的壁面上，以使得装载件能够相对于通槽翻转。

检测前，先将各试纸条放置在各检测单元的入口处，将各待检测采样管放置在各检测单元的装载件内并开启采样管，此时试纸条不对推板产生作用力，推板与装载件之间的拉绳处于自然松弛状态；检测时，依次向内推动试纸条，向检测腔内移动的试纸条驱动推板移动，移动的推板通过拉绳驱动装载件翻转，待推板移动至预设位置时，装载件翻转预设的角度使得采样管内的液体能够通过通槽落入至检测腔内的试纸条的检测孔内，从而完成采样；采样完成一段时间后，取出各试纸条进行样本分析。

在一个或多个实施例中，在检测前可以采用半透膜、透析膜对待检测样品进行过滤，利用透析膜过滤待检测样品能够省去待检测样品的静置步骤。在一个实施例中，过滤完成后，取150～200μL的滤液加入至待检测采样管中。

在一个或多个实施例中，如图6至图8所示，检测单元的上表面还设置有挡板5，挡板5上位于通槽靠近检测装置开口端的一侧，以在装载件翻转时，对装载件翻转的角度形成限位，避免采样管经通槽落入至检测腔内。

在一个或多个实施例中，各检测单元上设置有标识区域，所述标识区域用于显示对应的检测单元的序号，以进一步降低错误率。

在部分实施例中，如图7所示，所述推板6和检测腔之间还设置有第一弹簧7，所述转轴上设置有扭簧(未示出)，在试纸条未作用于推板时，所述第一弹簧处于自然伸长状态，所述装载件在扭簧的作用下保持竖直或相对竖直。检测时，当试纸条的卡壳推动推板，推板压缩第一弹簧，同时带动装载件克服扭簧的作用力而翻转；采样完成后，卸除试纸条上的作用力，推板在第一弹簧的作用力下复位，拉绳松弛，失去拉绳拉力的装载件在扭簧的作用力下复位，进而检测单元复位至初始未检测的状态。通过第一弹簧和扭簧的设置，使得采样完成后检测装置能自动恢复至初始位置，进一步降低操作难度，提高检测效率。

在部分实施例中，如图6至图10所示，检测装置还设置有自锁机构。自锁机构包括锁紧件9，锁紧件的外壁上设置有连接板91，连接板91上设置有第二弹簧92，第二弹簧92的底端连接至检测装置的上表面，锁紧件9的底端活动贯穿至检测腔的内部，且锁紧件的底端设置有卡凸93，所述推板6上设置有卡槽61，卡凸93与卡槽61的尺寸相匹配。

推板受试纸条卡壳驱动向检测腔内移动，当移动至卡凸时，推板推动卡凸，锁紧件竖直向上移动，待推板的卡槽经过卡凸时，失去支撑的卡凸在第二弹簧的作用下竖直向下移动并插入至卡槽中形成卡接，卡接后，锁紧件与推板相对固定，推板达到预设位置；采样完成后，向上提起锁紧件解锁，推板在第一弹簧的作用下复位。该设置使得在检测过程中工作人员无需考虑推板移动的距离，在锁紧后试纸条的检测孔即可与采样管中待测液体的落点对齐，进一步简化操作步骤，提高检测的准确度。

在一个或多个实施例中，所述卡凸93面向推板6的一侧为斜面，以使得卡凸受推板作用时，能够产生竖直方向的分力，促使锁紧件竖直向上移动。

在部分实施例中，如图7、图8和图11所示，检测腔内还设置有位于隔板下方的防溅板，所述防溅板用于引导采样管内倾倒出的液体滴落至下方的检测孔。在一个或多个实施例中，所述防溅板为中空结构，防溅板朝向通槽的面为斜面，且斜面上开设有开口以连通防溅板内部的容纳腔和外部空间，容纳腔的底面为汇流面，以使得通过开口进入至容纳腔内的液体能够通过汇流面向容纳腔底部汇集，最终通过容纳腔底部的开口滴落至检测孔中。通过上述设置，倾倒于防溅板上的液体被分流为两部分，一部分延防溅板的倾斜面流动，另一部分在容纳腔中汇集，避免采样管中倾倒出的液体瞬时流量过大而导致部分液体在接触倾斜面后溅射，导致采样量不达标，进一步提高检测的准确度。

本文中所使用的“第一”、“第二”等(例如第一弹簧、第二弹簧等)只是为了描述清楚起见而对相应部件进行区别，不旨在限制任何次序或者强调重要性等。此外，在本文中使用的术语“连接”在不进行特别说明的情况下，可以是直接相连，也可以使经由其他部件间接相连。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。