CSE/H2S系统预防心肌肥大及药物研制中的应用

技术领域

本发明属于心肌细胞肥大预防机制研究领域，具体涉及CSE/H2S系统对于心肌细胞肥大的预防作用以及在心肌细胞肥大预防或治疗药物研制中的应用。

背景技术

Reactive oxygen species(ROS)是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括超氧阴离子自由基(O-2)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧、羟自由基(HO·)、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。O-2是由细胞内NADPH(Nicotinamide-adenine dinucleotidephosphate)氧化酶或XO(Xanthine Oxidase)激活，NOS解偶联，线粒体氧化磷酸化作用时电子的转移和泄漏等因素形成的。ROS可活化心肌肥大中的多种信号激酶和转导因素，在AngⅡ和α-肾上腺素所致的蛋白解偶联肥大中起着重要的作用。而ROS的增多则是引起细胞凋亡的一个重要因素。NOXs(NADPH oxidases)产生O-2在心血管疾病的病理生理过程中起着重要的作用，NOXs家族成员包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5五个成员。而NOXs家族中的NOX4则在心肌细胞线粒体中存在。有研究证实在心肌NOX4敲除的小鼠中，心脏的O-2产生会明显减少，表明NOX4是心脏产生O-2的一个重要来源。同时也有研究证实心脏中NOX4的增加会引起心脏功能的异常，心肌纤维化，心肌细胞凋亡等一系列病理生理过程。更重要的是NADPH oxidases被认为是线粒体内ROS产生的一个重要来源。所以NOX4是心肌线粒体产生氧化应激的一个重要来源，而心肌线粒体产生氧化应激则导致心肌细胞肥大；

心肌细胞肥大是许多心脏病的病理表现之一，是心血管疾病发生率和死亡率明显升高的危险因素，也是心功能不全和心律失常的重要病理基础。在心血管组织，内源性H2S生成的是在催化酶和含硫氨基酸底物作用下完成，催化酶包括胱硫醚β合成酶(CBS)和胱硫醚―γ―裂解酶(CSE)，CSE主要存在血管组织；我们前期研究发现，外源性H2S通过抑制细胞凋亡而抑制心肌肥大，其机制与减少心肌线粒体活性氧的产生有关；而CSE/H2S系统是否参与心肌细胞肥大发生，迄今尚无报道。鉴此，我们将在前期工作的基础上，揭示心肌肥大CSE表达和内源性H2S含量中的作用，从分子水平进一步阐明活化的CSE/H2S系统预防心肌肥大相关机制。阐明CSE/H2S系统对心肌肥大氧化应激的影响，进一步完善心肌肥大氧化应激机制。此研究对临床预防心肌肥大或者研制预防或治疗心肌肥大药物中有重要作用。

发明内容

本发明在于针对心肌细胞肥大，为了说明心肌肥大与氧化应激密切相关，我们主要是从CSE/H2S系统可以改善氧化应激而预防心肌肥大；

CSE/H2S系统在预防心肌肥大以及预防药物研制中的应用；

进一步的，所述H2S为内源性H2S，其是在胱硫醚―γ―裂解酶(CSE)为催化酶，含硫化合物为底物的作用下产生；

进一步的，所述的含硫氨基酸包括但不限于：半胱氨酸、甲硫氨酸、同型半胱氨酸、硫氢化钠，可通过注射方式给药；

进一步的，所述心肌肥大为心肌细胞体积增大，心肌纤维化，导致细胞凋亡；

进一步的，所述心肌肥大可在心肌细胞线粒体氧化应激反应后产生；

进一步的，所述氧化应激反应是心肌细胞线粒体中ROS(含氧原子或原子团)的过渡表达；导致心肌细胞氧化与抗氧化失衡；

进一步的，所述CSE/H2S系统使心肌细胞线粒体中ROS表达减弱，从而改善心肌细胞氧化应激反应，预防心肌肥大；

进一步的，所述CSE/H2S系统使心肌细胞线粒体中ROS表达减弱通过下述方法实现：CSE/H2S能够明显减少心肌肥大过程中的ROS的产生，其作用机制可能与CSE/H2S可以直接清除氧自由基和减少脂质过氧化反应有关，而NaHS处理对心肌细胞再灌注损伤的保护作用的研究，提示PI3K/Akt信号通路在氧化应激引起的组织损伤中发挥了重要作用；Westernblot检测发现H2S能够使NOX4的表达明显减少；NOXs(NADPH oxidases)产生O-2在心血管疾病的病理生理过程中起着一个重要的作用，而NOXs家族成员包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5五个成员；NOX4是NOXs(NADPH oxidases)家族中的重要成员之一，且在心肌线粒体中存在，在心肌肥大发展过程中表达会增加，而NADPH oxidases已经被认为是线粒体内ROS产生的一个重要来源，我们的结果证实CSE/H2S能够减弱心肌肥大发展过程中氧化应激反应；而我们也知道ROS是引起线粒体凋亡的一个重要因素。

本发明的有益效果是：

本发明揭示了CSE/H2S系统对心肌肥大氧化应激的影响，进一步完善心肌肥大氧化应激机制；CSE/H2S系统通过调节凋亡与ROS的表达(CSE/H2S系统使凋亡与ROS的表达减弱)预防心肌肥大；临床意义和拓展：CSE/H2S系统可以通过改善心肌肥大氧化应激进而预防心肌肥大的发生，了解机制可以针对性预防心肌肥大以及在心肌肥大预防或治疗药物的研制方面有重大意义和作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是大鼠心脏图片；

图2是心肌肥厚大鼠心脏质量指数示意图；

图3是心肌肥厚大鼠中H2S含量指数示意图；

图4是各组大鼠心脏组织中CSE蛋白表达程度指数示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围；

实施例1

通过动物实验探讨活化的CSE/H2S系统预防心肌肥大相关机制技术路线；

实验分组：选取的小鼠随机分成5组，正常对照组6只，心肌肥大两周组6只，心肌肥大四周组6只，心肌肥大+NaHS 2周组6只，心肌肥大+NaHS 4周组6只；在实验结束前1d禁食，自由引水；

1)正常对照组：背部皮下注射生理盐水(170mg/kg.d)；

2)心肌肥大2w组：背部皮下注射ISO(170mg/kg.d)连续注射4天，两周后检测相应指标；

3)心肌肥大4w组：背部皮下注射ISO(170mg/kg.d)连续注射4天，四周后检测相应指标；

4)心肌肥大+NaHS 2w组：背部皮下注射ISO(170mg/kg.d)连续注射4天，同时每天腹腔注射NaHS(sigma,美国)40μmol/kg，连续注射两周，两周后检测各组相应指标；

5)心肌肥大+NaHS 4w组：背部皮下注射ISO(170mg/kg.d)连续注射4天，同时每天腹腔注射NaHS(sigma,美国)40μmol/kg，连续注射四周，四周后检测各组相应指标。

具体实验操作步骤：

1)模型制备：选取体重为220～250g的雄性Wistar大鼠背部皮下注射异丙肾上腺素(ISO)170mg/kg.d，连续注射4天，得到心肌肥大大鼠模型；

2)心肌肥大指数测定：各组动物确定体重(body weight，BW)，于各时间点腹腔注射10％水合氯醛麻醉(0.3g/kg)，迅速取出心脏，修剪去心脏周围组织和血管，用预冷的生理盐水将心脏冲洗干净，用滤纸吸干水分后称全心重(heart weight，HW)；沿冠状沟将左心房剪下，沿室间沟去除右心室游离壁，称左室重(left ventricular weight，LVW)；计算心重指数(HW/BW)和左室重量指数(LVW/BW)，将其作为判定心肌肥大的指标；经过测定，心肌肥厚大鼠心脏质量指数如图2所示，各组大鼠心脏状态图片如图1所示，模型组大鼠IOS干预4周较对照组显著增加(p<0.05)，表明模型建立成功；

3)超声测定：选用GE Vivid7彩色多普勒超声仪，探头为10s，探头频率为8～11MHZ；10％水合氯醛(0.3g/kg)麻醉后选取仰卧位，常规进行经胸切面扫查，包括左侧胸骨旁切面，心尖侧面。重点观察左室血流动力学改变。

4)H2S的检测(Elisa试剂盒)：大量硫化氢(H2S)Elisa试剂盒用双抗夹心法测定标本中大鼠硫化氢(H2S)水平。用纯化的硫化氢(H2S)抗体包被微孔板，制成固体抗体，往包被单抗的微孔里依次加入硫化氢(H2S)，再与HPR标记的硫化氢(H2S)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HPR酶催化下转为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中硫化氢(H2S)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠硫化氢(H2S)浓度；

心肌肥厚大鼠血液和心肌组织中H2S含量检测，如图3所示：

ISO模型组大鼠2、4周H2S含量低于对照组(p<0.05)，与ISO模型组比较，ISO+NaHS组2、4周H2S含量都有增加(p<0.05)，与2周ISO模型组相比4周ISO模型组H2S含量有增加(p<0.05)。

5)HE染色：取各组大鼠左心室心尖部组织(0.5～1mm

6)透射电子显微镜观察：取各组大鼠左心室心尖部组织(1～2mm3)置于2.5％的戊二醛磷酸缓冲液中固定24-48h。制成常规脱水、透明、包埋、染色等制成厚度为50～70nm的超薄切片，在透射电子镜下观察大鼠心肌组织的超微结构变化。

7)TUNEL染色观察细胞凋亡：对每一组均用10％的中性福尔马林将新鲜组织固定，制作石蜡切片，脱蜡、水合；内源性过氧化物酶的阻断和细胞的通透：用PBS冲洗石蜡切片2～3次，给予阻断剂(3％H2O2甲醇溶液)于室温下孵育约30分钟。用PBS冲洗切片后，加入通透液(0.1％的TritonX-100溶于0.1％的枸掾酸纳溶液中)置于水浴锅中孵育约2分钟；标记：用PBS冲洗切片2次，滤纸吸干样品周围的水，每个样品滴加50μl配制好的TUNEL反应混合液，加盖玻片，放入37℃湿盒中，孵育60分钟。用PBS冲洗2～3次，在荧光显微镜下观察并分析结果；细胞凋亡判定：吸干样品周围的水份，加50μl转化剂POD，加盖玻片，放入37℃湿盒中，室温下孵育约30分钟。用PBS冲洗2～3次，分别滴加(50～100)μl DAB底物溶液，在室温下孵育约10分钟，然后用苏木素进行轻度复染，经PBS冲洗，脱水、透明、封片。在光学显微镜下观察并分析细胞的凋亡情况。光学显微镜下，正常的心肌细胞核被染成蓝色，而凋亡的细胞核则呈棕褐色。每一张切片随机选取5个以上的高倍镜视野，数不少于500个心肌细胞核，计算凋亡率。公式如下：AI(％)＝(凋亡细胞数/500)×100％；

8)心肌组织总蛋白提取及蛋白定量

a)SDS-PAGE配制10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离胶，平稳地将分离胶移入预备好的制胶仪中，同时为积层胶留出足够大的空间，添加约5ml覆盖物(去离子水)，防止空气中的氧气抑制凝胶的聚合；待凝胶聚合(大约40min)后，弃掉制胶仪中的覆盖层，再用去离子水冲洗凝胶上部2～3次，用滤纸尽量吸干凝胶顶部残存的液体；配制5％的SDS-PAGE凝胶电泳积层胶，移入制胶仪中，缓慢地插入梳子，尽量避免胶内产生气泡，平稳地置于室温下。待凝胶聚合完成(大约40min)，再用去离子水小心地冲洗梳孔1～2次，把凝胶移入电泳槽内，倒入l×的电泳缓冲液，按顺序加入准备好的蛋白样品40μg，开始电泳，初始电压设置为80V，待染料进入分离胶后，再将电压调至100V，直至染料靠近分离胶的底部，将分离胶取出。

b)转膜裁剪一张与分离胶大小相同的NC滤膜，浸入转移液中，按照海绵，滤纸，胶，NC滤膜，滤纸，海绵的顺序放好，移入转移槽内，膜一侧靠近正极，胶一侧靠近负极；300mA恒定电流条件下于冰盒内转移约2h。

c)一抗孵育待转移完成后，在37℃条件下，将NC滤膜置于含5％脱脂奶粉的TBST溶液中封闭约1h。将NC滤膜置于配制好的一抗中，4℃摇床震荡过夜。

d)显迹用TBST溶液漂洗的NC滤膜大约3次，每次5min，将膜与用TBST稀释的二抗(羊抗兔IgG浓度为1:500，碱性磷酸酶的标记法)进行孵育，室温条件下振荡约1h；依次用TBST溶液，TBS溶液漂洗去掉没有结合的二抗。用Western blue stabilized substratefor AP法显色，在凝胶成像的系统下进行拍照，计算条带的光密度的值；各蛋白的表达水平用该蛋白与相应内参的光密度比值来表示；

经过对心肌组织中蛋白的提取和测定CSE蛋白表达，得出结果：

ISO模型组大鼠2、4周CSE蛋白表达低于对照组(p<0.05)，与模型组相比，ISO+NaHS的2、4周CSE蛋白表达都有增加(p<0.05)；与2周模型组相比，4周模型组CSE蛋白表达有增加(p<0.05)，见图4所示。

实施例2

通过细胞实验探讨活化的CSE/H2S系统预防心肌肥大相关机制技术路线；

实验分组：

1)正常对照组：正常细胞培养，不做任何处理；

2)心肌肥大组：加入AngII，最终浓度为100nmol/L，作用48h；

3)心肌肥大+NaHS处理组：加入AngII，终浓度为100nmol/L，作用48小时，之后加入NaHS(100μmol/L)干预48小时。

具体实验操作步骤：

1)原代心肌细胞培养：将出生1～3天的Wistar乳鼠浸泡在70％的酒精里进行消毒，然后开胸将心室肌取出，再用PBS冲洗3次，剪碎，放入玻璃瓶中；玻璃瓶中装有0.25％胰酶，37℃消化9分钟后再加入相同体积的DMEM全培养液进行终止消化；然后重复以上消化过程4-5次，每次消化温度为37℃时间为10分钟；收集除第一次以外的上清液，2400r/min离心13分钟，弃掉上清，用含10％胎牛血清及双抗(青霉素和链霉素)的低糖DMEM培养液充分而缓慢地吹打成单个细胞悬浮液。然后进行差，置于温度为37℃、5％CO2的孵箱中孵育1～2小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞，细胞培养48h后用于实验。

2)鬼笔环肽染色检测肌原纤维新生肌节的形成：弃培养液，用预冷的PBS冲洗细胞2～3次；在室温下置于含4％福尔马林的PBS溶液(pH＝7.4)中固定约10min；置于含有1％TRITON X-100的PBS溶液中进行通透约30min；用含有1％BSA的PBS溶液中封闭约60min；滴加偶合FITC液1～2ml，室温下置于湿盒内避光反应2h；吸去反应液，PBS冲洗后，用400倍的荧光显微镜(波长495nm)观察并拍照。

3)MitoSox检测线粒体ROS的产生：取六孔板进行原代心肌细胞培养，提前在六孔板中加入盖玻片。分组施加干预因素后，将六孔培养板中的盖玻片取出，用PBS洗涤细胞两次；滴加H2O2(100μM)，激发后分别加入MitoSox(5μM)加盖玻片，37℃，5％CO2的细胞培养箱中进行孵育15～20min；用PBS洗涤1～2遍；将盖玻片倒置放在载玻片上，在荧光显微镜下进行观察。

4)Hoechst 33342/PI双染法检测细胞凋亡：Hoechst 33342/PI双染是一种方便快捷的基于荧光检测的方法来检测凋亡细胞中染色质的改变。染色缓冲液的配制：根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL染色buffer加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成染色缓冲液。收集样本细胞，细胞数量在10×10

5)心肌细胞总蛋白提取及蛋白定量(参照实施例1的提取与定量方法)。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。