五种生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及五种生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途。

背景技术

癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，也造成人类寿命缩短，例如，肝癌会导致肝功能受损，其中，肝细胞癌(HCC)是全球前5位癌症杀手之一。肝切除术是最常用的治疗方法，可达到70％的5年生存率。然而，在这些患者中，肿瘤复发往往是危及生存的致命因素。现有的研究表明，有接近70％的患者会在手术后5年内复发。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

根据第二方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种计算患癌风险值的方法，包括：

表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9；

风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于预测患癌风险的装置，包括：

表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9；

风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；

判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。

根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：

表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9；

风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；

判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第三方面或第五方面所述方法。

依据上述实施例的五种生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途，五种生物标志物可以用于有效预测患者癌症复发的风险，为临床治疗提供辅助。

附图说明

图1为一种实施例的风险因子在原发肝癌中的表达图。

图2为一种实施例的273例肝癌患者的风险因子表达与肝癌复发率分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

如本文所用，“生物标志物”(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。本文中，“生物标志物”、“预测因子”可互换使用。生物标志物具体可以为表达特定蛋白的特定基因。

对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。

生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平(分子、细胞、个体等)上因受环境污染物影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化、可以是某一生化代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现，可以是个体表现出的异常现象，可以是种群或群落的异常变化，可以是生态系统的异常变化。

如本文所用，术语“表达水平”等同于“表达谱，”“表达谱”是指从待测样本(例如肿瘤组织)获得的一种或多种蛋白(即基因产物)的表达水平。对于从待测样本中回收的基因产物，表达水平可以通过多种方法进行计算得到，例如，可以对待测样本(例如，可以是肿瘤组织样本)中的RNA(通常可以为总RNA)进行逆转录，对逆转录后的DNA进行实时荧光定量PCR检测，结合参考基因(例如，可以是内参基因)，检测得到的循环数，然后计算得到相对表达量，也可以表示为每mL待测样本中特定多肽的质量或任何其他合适的单位。类似单位可用于从其他待测样本获得的基因产物。基因产物的表达可使用任何合适的方法(例如，如下所述)确定。通常对测量值进行归一化，以解释样本数量和质量、逆转录效率等方面的变化。当表达谱反映来自多个不同基因产物(例如，不同基因的RNA转录物，通常为总RNA转录物)的表达时，在生成或比较表达谱或参考谱时，可以赋予基因产物不同的权重。

应用现代分子生物学手段，研究表明，原发肿瘤中基因特征可以比较有效地预测患者的预后和对治疗的反应，同时也为肿瘤复发的潜在风险提供了预测方法。所以，对于复发高风险患者，可以提前进行检测和治疗干预，以便针对性地进行治疗。

根据第一方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

我们的前期研究通过转录组测序及随访追踪研究，发现一些表面分子、转录因子的高表达与肝癌术后复发具有显著的相关性。因此在原发肝癌肿瘤中检测以下五个复发相关高风险因子CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9的基因表达，当原发肿瘤中这五个风险因子的表达显著高于癌旁组织时，能有效预测该患者肿瘤复发的可能性。可以构建包含用于检测上述5因子的检测试剂盒(主要含检测5种基因的qPCR试剂)，用于辅助诊断患者肝细胞肝癌的术后3年期复发风险。

在一实施例中，所述生物标志物包含如下基因中的全部：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因的表达水平。

在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因相对于参考基因的相对表达水平。

在一实施例中，所述参考基因包含在细胞中组成型、稳定表达的基因。

在一实施例中，所述参考基因包含内参基因。

在一实施例中，所述内参基因包括不限于Gapdh基因、Actin基因、Tubulin基因中的至少一种。

在一实施例中，所述生物标志物用于评估癌症复发的风险。

在一实施例中，所述生物标志物用于评估癌症三年期或五年期复发的风险。此处仅仅是示例性列举，也可用于评估其他期限范围的癌症复发风险。

在一实施例中，所述复发包括用药后复发、术后复发中的至少一种。

在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。

在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。

在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。

肝细胞性肝癌：癌细胞排列形成实性团块状，周围富有扩张的血窦。癌细胞境界不清，大小较一致，浆宽。核单个，类圆形，异形性不明显。核分裂象少见。

肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90％，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。遗传、表观遗传改变、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素暴露、吸烟、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危险因素。肝癌预后差的原因是复发率和转移率高。移植是治疗肝癌最有效的方法，但在移植过程中，肿瘤复发率和转移率较高。无论是由于肿瘤负担还是肝功能不好，70％以上的晚期患者不适合移植。

在一实施例中，根据待测样本中所述基因的相对表达量，计算风险值，根据所述风险值，评估受试者复发的风险。

在一实施例中，根据所述风险值与阈值的大小关系，评估受试者复发的风险。

在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。

在一实施例中，所述阈值可以为100。

阈值是根据我们的测序数据和现在已公开发表的肿瘤中基因表达数据计算而得，现有的复发患者肿瘤中这几个基因的相对表达量乘积已达到该阈值，我们便将这个阈值作为判定经验值。数值100是通过系数变换后的数值，用数值100是为了从习惯上方便判定。

在一实施例中，所述风险值＝[RQ

α为经验常数，可以根据自测序的样本数据和/或TCGA数据库中的测序数据得到α值。使用的样本集不同，经验常数α通常会发生一定的变化。

在一实施例中，RQ＝2

在一实施例中，所述PCR循环数是通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测得到。

在一实施例中，所述参考基因包含内参基因。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

在一实施例中，α可以为20。

在一实施例中，所述待测样本包括肿瘤组织样本。

在一实施例中，所述对照样本包括正常组织样本。

在一实施例中，所述正常组织样本包括癌旁组织样本，为实体组织块。

根据第二方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

在一实施例中，所述生物标志物包含如下基因中的全部：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。

在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。

在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种计算患癌风险值的方法，包括：

表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9；

风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。该风险值为中间结果，因此，计算患癌风险值的方法不属于疾病的诊断、治疗方法。

在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。

在一实施例中，所述靶基因的相对表达量RQ＝2

在一实施例中，预测受试者患癌风险时，癌症包括但不限于肝癌。

在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。

在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。

在一实施例中，所述风险包括复发风险。

在一实施例中，所述风险值＝[RQ

在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。

在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。

在一实施例中，还包括信号采集步骤，包括采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的PCR循环数。

在一实施例中，所述信号包含荧光信号。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于预测患癌风险的装置，包括：

表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9；

风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；

判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。

在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。

在一实施例中，所述靶基因的相对表达量RQ＝2

在一实施例中，预测受试者患癌风险时，癌症包括但不限于肝癌。

在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。

在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。

在一实施例中，所述风险包括复发风险。

在一实施例中，所述风险值＝[RQ

在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。

在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。

在一实施例中，还包括信号采集模块，用于采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的PCR循环数。

在一实施例中，所述信号包含荧光信号。

根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：

表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9；

风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；

判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。

在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：CD47、Tcf19、Cldn3、Sox4、Sox9。

在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。

在一实施例中，所述靶基因的相对表达量RQ＝2

在一实施例中，预测受试者患癌风险时，癌症包括但不限于肝癌。

在一实施例中，所述肝癌包括原发性肝癌、继发性肝癌。

在一实施例中，所述原发性肝癌包括肝细胞性肝癌(亦称肝细胞癌，hepatocellular carci noma，HCC)。

在一实施例中，所述风险包括复发风险。

在一实施例中，所述风险值＝[RQ

在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。

在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。

在一实施例中，还包括信号采集步骤，包括采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的PCR循环数。

在一实施例中，所述信号包含荧光信号。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第三方面或第五方面所述方法。

实施例1

试剂盒包含：

Trizol裂解液(Invitrogen，15596-026)；

RNAse-free匀浆器；

RNAse-free 1.5毫升管；

氯仿；

异丙醇；

洗涤液(使用RNAse-free水配制的75％V/V乙醇)；

RNAse-free水；

逆转录试剂混合物(10μL/管，TAKARA，RR047A)；

Q-PCR试剂混合物(TAKARA，639676)；

引物稀释液(含有引物的水溶液)。

操作步骤如下：

1、肿瘤样本制备：对于有多个肝癌灶点的患者，每个灶点取一块肿瘤(50毫克/份)，总取3个灶点；对于少于3个肝癌灶点的患者，则随机取3个肿瘤块(50毫克/份)；肿瘤组织标记为HCC1、HCC2、HCC3。随机取3块癌旁组织(50毫克/份)，标记Nor1、Nor2、Nor3。

2、用消毒灭菌的剪刀将组织尽可能剪碎，加入200微升Trizol裂解液。

3、用移液枪将上述组织碎片裂解液混合物转移至RNAse-free匀浆器中，将组织碎片磨碎直到没有明显颗粒状组织。

4、加入800微升Trizol裂解液，将组织裂解液转移到新的RNAse-free 1.5毫升管，用移液枪反复吹打10次，混匀，常温静置5分钟。

5、向组织裂解液中加入200微升氯仿，盖上盖，上下用力摇动使液体混匀，常温静置5分钟。

6、将上述组织裂解液于4℃、12000×g条件下离心20分钟。

7、离心结束后，用移液枪吸取200微升上清到新的RNAse-free 1.5毫升管。

8、向上述上清中加入200微升异丙醇，盖上盖，上下摇动使液体混匀，常温静置10分钟。

9、将上述液体于4℃、12000×g条件下离心10分钟。

10、去掉上清液，管底可见白色沉淀，向沉淀中加入500微升洗涤液，盖上盖，上下用力摇动试管3次。

11、将上述液体于4℃、6000×g条件下离心5分钟。

12、去掉上清液，将试管开盖置于通风橱10分钟。

13、加入50～100微升RNAse-free水，60℃水浴5分钟。

14、高速离心试管1分钟，收集液体于管底。

15、测量RNA浓度，置于冰盒或4℃冰箱待用。

步骤1～15可用市场上现有的全自动核酸提取工作站完成，本实施例未使用全自动核酸提取工作站，为手动完成。

16、对于同一患者或同一批检测，使用同一质量的RNA(总RNA)进行逆转录(模板量可以为100ng～1000ng，本实施例具体为500ng)。

17、向逆转录试剂混合物(10μL/管)中加入待检测RNA，并加入RNAse-free水补足至20微升。补充RNAse-free水的体积(μL)＝10-RNA质量(ng)/RNA浓度(ng/μL)。

18、在PCR仪器中进行逆转录反应，反应条件依次如下：

25℃，10分钟；

42℃，30分钟；

85℃，5分钟；

结束。

19、Q-PCR反应

反应体系配置：上述逆转录反应液1ul，引物混合物0.5ul，ROX混合物0.5ul，Q-PCR反应混合物8ul。(每个反应设置3个重复)

反应条件：

(A)95℃，3分钟；

(B)95℃，5秒；

(C)60℃，30秒；步骤B、C重复40次；

(D)72℃，30秒(信号收集)；

(E)72℃，5分钟；

(F)熔解曲线(Melting curve)生成反应；

结束。

20、计算方法：

按如下公式进行计算：RQ＝2

RQ：相对表达量。

ΔCt＝肿瘤样本(HCC)靶基因PCR循环数-内参PCR循环数。

ΔΔCt＝[肿瘤样本(HCC)靶基因PCR循环数-内参PCR循环数]-[对照样本(Nor)靶基因PCR循环数-内参PCR循环数]。

内参基因为Gapdh基因。

21、复发风险值：

Risk＝RQ

22、判定方法

如果Risk≤100，正常复发风险；Risk＞100，高复发风险。

23、引物序列如表1所示。

表1

图1为风险因子在原发肝癌中的表达图，纵坐标为Log

图2为273例肝细胞癌患者(本课题组自行测序的有42例，另外231例的测序数据为TCCA数据库中的数据)的风险因子表达与肝癌复发率分析图，纵坐标为肝癌三年复发率，表示根据横坐标对应的风险因子计算得到的风险值＞100的三年复发病例数占比，各风险因子的复发风险值参见步骤21的公式进行计算，例如，对单因子Cldn3组，复发风险值Risk＝RQ

与图2对应的各组病例数见表2。

表2

结合表2、图2可见，单独基于五种风险因子(即预测因子)进行评估，肝癌三年复发率大于40％，基于CD47、Cldn3、Sox9三种风险因子组合进行评估，肝癌三年复发率约为80％，基于CD47、Tcf19、Cldn3、Sox9、Sox4五种风险因子进行评估，肝癌三年复发率＞90％。

本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市龙华区中心医院

<120> 五种生物标志物在制备或筛选肝癌诊断试剂中的用途

<130> 21I32336

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agaaggtgaa acgatcatcg agc 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcatccata ccaccggatc t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggcggtga tctctacac 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggagtcgga cattattgac ca 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacaccatta tccgggactt ct 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcggagtaga cgaccttgg 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agcgacaaga tccctttcat tc 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgttgccgga cttcacctt 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcgaacgca catcaagac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctgtaggcga tctgttgggg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggctgttgtc atacttctca tgg 23