蛋白水解靶向嵌合体

本申请要求于2018年11月2日提交的来自美国临时专利申请No.62/755,038的优先权权益，其全部内容通过引用并入于此。

背景技术

1.技术领域

本公开内容一般性地涉及药物化学和药物领域。更具体地，其涉及使用小分子配体用于选择性地降解靶蛋白，例如参与疾病(例如癌症)的蛋白质的方法。

2.相关技术描述

蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras，PROTAC)是包含两种小分子配体的双官能分子，一种具有针对目的靶蛋白的高亲和力，以及第二种用于募集E3连接酶，所述E3连接酶使蛋白质泛素化并靶向蛋白质以通过26S蛋白酶体进行蛋白水解(Lai和Crews，2017)。两种配体通过柔性系链连接，提供了高模块化的方法，以产生旨在通过与标准小分子或抗体抑制不同的机制来降解和沉默蛋白质的分子。这种模块化方法为优化配体亲和力提供了空间，无需考虑功能活性，因为使蛋白质沉默依赖于在蛋白质极为贴近处募集E3连接酶以进行泛素化，而不是功能抑制。系链的最佳长度和疏水性是重要的，并且必须经过经验评价，因为如果系链太短，则在E3连接酶的募集中可能存在显著的空间相互作用。还应优化系链的疏水性。

另外，还必须考虑募集多种E3泛素连接酶和系链长度和疏水性。已经鉴定了三类E3连接酶，其包括HECT、RING和U-Box结构域类型。HECT结构域家族成员直接催化泛素最终附着至其底物蛋白，而RING和U-Box E3在蛋白质泛素化中没有直接的催化作用(Robinson和Ardley，2004以及Metzger et al.，2012)。Cullin-RING连接酶是最丰富的。靶向这些酶的小分子提供了优化连接酶募集分子的框架(Bulatov et al.，2015)。PROTAC显示出相对特异性的靶标降解和比配体特异性最初提出的更少的脱靶降解，因为募集的E3连接酶可以影响PROTAC的特异性(Lai和Crews，2017)。

因此，仍然需要开发具有增强的接头长度和疏水性的新PROTAC。

发明概述

在一个方面中，本公开内容提供了下式化合物：

其中：

R

R

R

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-(C(O))

其中：

d是0或1；

a、b或c是0、1、2、3、4、5或6；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

e是1、2、3、4或5；

f是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；并且

A是氢或E3连接酶配体；或者

下式化合物：

其中：

R

R

Y

Y

R

X

R

X

X

X

L

-(CH

其中：

g、h和i各自独立地是0、1、2、3、4或5；

X

其中：

R

X

其中R

Y

其中：

j是1、2、3、4或5；

k是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

y是1、2、3、4、5或6；并且

A

或这些式中任一个的可药用盐。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

R

R

R

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-(C(O))

其中：

d是0或1；

a、b或c是0、1、2、3、4、5或6；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

e是1、2、3、4或5；

f是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；并且

A是氢或E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

R

R

R

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-C(O)(CH

其中：

a、b或c是0、1、2、3、4或5；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

d是1、2、3、4或5；

e是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；并且

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

R

R

R

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-C(O)(CH

其中：

a、b或c是0、1、2、3、4或5；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

d是1、2、3、4或5；

e是0、1、2、3、4或5；并且

R

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-C(O)(CH

其中：

a、b或c是0、1、2、3、4或5；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

d是1、2、3、4或5；

e是0、1、2、3、4或5；并且

R

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-C(O)(CH

其中：

a、b或c是0、1、2、3、4或5；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

d是1、2、3、4或5；

e是0、1、2、3、4或5；并且

R

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

X

L是下式的连接基：

-C(O)(CH

其中：

a、b或c是0、1、2、3、4或5；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

d是1、2、3、4或5；

e是0、1、2、3、4或5；并且

R

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

L是下式的连接基：

-C(O)-(CH

其中：

a、b或c是0、1、2、3、4或5；前提是a、b和c的总和大于1；

X

其中R

X

其中R

Y

其中：

d是1、2、3、4或5；

e是0、1、2、3、4或5；并且

R

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中

R

R

R

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

Y

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

X

R

X

X

L是下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

X

L是下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；

A是E3连接酶配体。

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

L是下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

x是1、2、3、4、5或6；

A是E3连接酶配体。

在另一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

R

R

Y

Y

R

X

R

X

X

X

L

-(CH

其中：

g、h和i各自独立地是0、1、2、3、4或5；

X

其中：

R

X

其中R

Y

其中：

j是1、2、3、4或5；

k是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

y是1、2、3、4、5或6；并且

A

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

Y

Y

R

X

R

X

X

X

L

-(CH

其中：

g、h和i各自独立地是0、1、2、3、4或5；

X

其中：

R

X

其中R

Y

其中：

j是1、2、3、4或5；

k是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

y是1、2、3、4、5或6；并且

A

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

Y

R

X

R

X

X

X

L

-(CH

其中：

g、h和i各自独立地是0、1、2、3、4或5；

X

其中：

R

X

其中R

Y

其中：

j是1、2、3、4或5；

k是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

y是1、2、3、4、5或6；并且

A

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

R

X

R

X

X

X

L

-(CH

其中：

g、h和i各自独立地是0、1、2、3、4或5；

X

其中：

R

X

其中R

Y

其中：

j是1、2、3、4或5；

k是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

y是1、2、3、4、5或6；并且

A

在一些实施方案中，所述化合物进一步限定为：

或其可药用盐，

其中：

X

R

X

X

X

L

-(CH

其中：

g、h和i各自独立地是0、1、2、3、4或5；

X

其中：

R

X

其中R

Y

其中：

j是1、2、3、4或5；

k是0、1、2、3、4或5；并且

R

下式的连接基：

-(AA

其中：

AA

y是1、2、3、4、5或6；并且

A

在一些实施方案中，a是0、1、2或3。在一些实施方案中，a是0或1。在另一些实施方案中，a是1或2。在另一些实施方案中，a是6。在一些实施方案中，b是0、1、2或3。在一些实施方案中，b是0或1。在另一些实施方案中，b是1或2。在一些实施方案中，c是0、1、2或3。在一些实施方案中，c是0或1。在另一些实施方案中，c是1或2。在一些实施方案中，d是0。在另一些实施方案中，d是1。

在一些实施方案中，X

在一些实施方案中，Y

在一些实施方案中，AA

在一些实施方案中，X

在一些实施方案中，A是氢。在另一些实施方案中，A是VHL、MDM2、cereblon或cIAP的E3连接酶配体。在另一些实施方案中，E3连接酶配体是泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、VHL-1、金刚烷、1-((4，4，5，5，5-五氟戊基)亚磺酰基)壬烷、nutlin-3a、RG7112、RG7338、AMG232、AA-115、苯丁抑制素(bestatin)、MV-1、LCL161，或其衍生物。

在一些实施方案中，A

在一些实施方案中，该化合物进一步限定为以下或其可药用盐：

在一些实施方案中，该化合物进一步限定为以下或其可药用盐：

在另一个方面中，本公开内容提供了包含本公开内容的化合物和赋形剂的组合物。在一些实施方案中，组合物配制成用于如下施用：经口、脂肪内(intraadiposally)、动脉内、关节内、颅内、皮内、病灶内、肌内、鼻内、眼内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、气管内、肿瘤内、脐带内、阴道内、静脉内、囊内、玻璃体内、经脂质体、局部、经黏膜、肠胃外、经直肠、结膜下、皮下、舌下、表面、经口含化(transbuccally)、经皮、阴道、作为乳膏(in crème)、作为脂质组合物、通过导管、通过灌洗、通过连续输注、通过输注、通过吸入、通过注射、通过局部递送或通过局部灌注。在一些实施方案中，组合物被配制成单位剂量。

在另一个方面中，本公开内容提供了在患者中治疗疾病或病症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本公开内容的化合物或组合物。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，癌症具有异常的CDK4或CDK6的信号传导。在一些实施方案中，癌症是白血病、乳腺癌、胃癌、胰腺癌或肝癌。在另一些实施方案中，白血病是急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病或慢性髓性白血病。在一些实施方案中，该方法还包括施用第二抗癌治疗。在一些实施方案中，患者是哺乳动物，例如人。

就特定组分而言，本文中使用的“基本上不含”在本文中用于意指特定组分均不被有目的地配制成组合物和/或者仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期的污染导致的特定组分的总量远低于0.1％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到特定组分之量的组合物。

如本文在说明书中使用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。

除非明确地指出仅是指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指代仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二个/种或更多个/种。

贯穿本申请中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。

根据以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例尽管指出了本公开内容的一些优选实施方案，但是仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多个变化和修改对于本领域技术人员而言将是明显的。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中所示具体实施方案的详细描述，本公开内容可被更好地理解。

图1示出了对YX-2-79、YX-2-107和YX-2-115的CDK4和CDK6激酶活性的抑制。

图2A至2D示出了帕博西尼(palbociclib)、YX-2-107和Cereblon-配体(CRBN-L)在BV173和SUP-B15细胞中的作用。图2A＆2B示出了在用指定剂量的药物处理48小时之后BV173细胞(图2A)和SUP-B15细胞(图2B)的细胞周期。图2C＆2D示出了BV173细胞(图2C)和SUP-B15细胞(图2D)的western印迹，其示出了在用指定剂量的药物处理72小时之后CDK6、CDK4、FOXM1的表达和RB的磷酸化。

图3A＆3B示出YX-2-107诱导了CDK6的快速蛋白酶体依赖性降解。图3A示出了在用YX-2-107或帕博西尼处理指定时间的BV173细胞中CDK6表达的免疫印迹。图3B示出了在具有或不具有蛋白酶体抑制剂MG132的情况下在用YX-2-107处理4小时的BV173细胞中的CDK6表达的免疫印迹。

图4A至4C示出了用YX-2-107或帕博西尼的体内处理。将白血病小鼠(每组3只)用帕博西尼或YX-2-107以150mg/kg连续处理3天。在处理结束之后24小时，纯化骨髓细胞(通过CD19-CD10流式细胞术的人细胞纯度＞90％)，并进行通过碘化丙啶染色的细胞周期分析(图4A)或针对RB-磷酸化和FOXM1、CDK4和CDK6表达的western印迹(图4B)。图4C示出了来自图4B的CDK4和CDK6表达的密度测定(densitometry)。

图5A至5C示出了YX-2-233在Ph+ALL细胞系中的作用。图5A示出了YX-2-233的结构。图5B示出了24小时时的细胞周期分析。图5C示出了经YX-2-233处理(24小时)的BV173或SUP-B15细胞的免疫印迹。

图6示出了YX-2-196和YX-2-107在BV173和SUP-B15细胞中的作用的比较。

图7示出了AC-1-027和YX-2-107在BV173和SUP-B15细胞中4小时和24小时之后的作用的比较。

图8示出了来自比较在用每日IP注射帕博西尼和YX-2-107处理10天后对白血病负荷(leukemia load)的作用的体内实验的结果。

图9示出了Ph+BV173和SUP-B15细胞中YX-2-107的另外的数据。

图10A至10E示出了CDK6沉默对BV173细胞的凋亡和白血病发生的作用。将BV173细胞用scramble(SCR)、CDK4或CDK6(82、86、88、73)shRNA载体转导，并用嘌呤霉素选择或用帕博西尼(2μM)处理。(图10A)通过对经shRNA转导的或帕博西尼处理的细胞的碘化丙啶染色进行的细胞周期分析；(图10B)在嘌呤霉素或帕博西尼处理7天之后通过膜联蛋白V染色检测到的凋亡；(图10C)CDK4/6和磷酸化-RB表达的代表性免疫印迹；(图10D)通过对用TET-ONshCDK6-88转导并用多西环素(1μg/ml)或帕博西尼(1μM)处理7天的BV173细胞进行膜联蛋白V染色检测到的凋亡；(图10E)注射BV173TET-ON shCDK6-88细胞并保持未处理或者从细胞注射后7天开始用DOX(在饮用水中的2g/L)或帕博西尼饲料(chow)处理4周的NSG小鼠的白血病负荷(在治疗停止之后两周进行的CD19+mCherry+细胞的外周血流式细胞术分析)；(图10F)注射BV173TET-ON shCDK6-88并保持未处理或者从细胞注射后7天开始用多西环素(在饮用水中的2g/L)或帕博西尼饲料处理4周的NSG小鼠的Kaplan-Meier存活图。

图11A至11D示出了CDK6沉默对BV173细胞的细胞周期和凋亡的特定作用。(图11A)用TET-ON shCDK6-88或空载体转导并用DMSO、DOX(1μg/ml)或帕博西尼(1μM)处理2天或者用表达CDK6的shRNA抗性形式(CDK6-shRES)的BV173 shCDK6-88转导用DOX(1μμM)处理2天的BV173细胞的细胞周期分析；(图11B)用DMSO、DOX(1μM)或帕博西尼(1μM)处理3天的BV173shCDK6-88 EV或CDK6-shRES细胞中的CDK6和磷酸化-RB水平；(图11C)通过对用TET-ONshCDK6-88、空(EV)载体或p53靶向shRNA 9sh-p53)转导并用DOX(1μg/ml)或帕博西尼(1μM)处理10天的BV173细胞进行膜联蛋白V染色监测到的凋亡；(图11D)EV或sh-p53转导的BV173细胞中的p53水平。

图12A＆12B示出了BV173细胞中由CDK6沉默诱导的凋亡在很大程度上是p53非依赖性的。(图12A)通过对用TET-ON shCDK6-88、空(EV)载体或p53靶向shRNA 9sh-p53)转导并用DOX(1μg/ml)或帕博西尼(1μM)处理10天的BV173细胞进行膜联蛋白V染色监测到的凋亡；(图12B)EV或sh-p53转导的BV173细胞的p53的免疫印迹。

图13示出了CDK6沉默相对于酶促抑制对NSG小鼠中BV173细胞的植入的影响。在注射BV173TET-ON shCDK6-88细胞并保持未处理或者从细胞注射后7天开始用DOX(在饮用水中的2g/L)或帕博西尼饲料处理4周的NSG小鼠的治疗停止之后两周，进行外周血流式细胞术分析。

图14A至14D示出了在BV173细胞中由CDK6沉默而不是激酶抑制调节的基因子集。(图14A)示出了在Ph+BV173细胞中与帕博西尼处理相比，由CDK6沉默选择性调节的基因的热图；(图14B)由CDK6沉默选择性下调的8个基因的热图；(图14C)在Ph+BV173细胞中由CDK6沉默而不是帕博西尼处理差异性调节的所选基因的qPCR分析。数据表示三个独立实验的平均值+SD。统计分析：单因素ANOVA以及Bonferroni校正。*＜0.05**＜0.01，***＜0.001；(图14D)在122个Ph+ALL样品的组中CDK6和HDAC1或CDK6和SMARCD2的表达之间的相关性图(GSE13159；MILE，白血病中的微阵列创新)。

图15A至15D示出了帕博西尼和衍生物。(图15A)由于哌嗪-接头尾的适度变化，帕博西尼和衍生化合物在激酶抑制方面具有差异；(图15B)使用多种接头和VHL或Cereblon募集配体的数个PROTAC候选物；(图15C)在处理4小时之后YX-2-107(CRBN-帕博西尼PROTAC)选择性降解BV173细胞中的CDK6；(图15D)用于Cereblon E3连接酶募集和作为对照的CRBNE3-胺组分的合成。

图16示出了PROTAC YX-2-107合成中的示意性步骤。

图17A至17E示出了在经PROTAC YX-2-107处理的细胞中的蛋白酶体依赖性降解和CDK6稳定性。免疫印迹示出了在用以下处理的BV173细胞中的CDK6表达：(图17A)PROTACYX-2-107或帕博西尼；(图17B)在具有或不具有蛋白酶体抑制剂MG132的情况下的PROTACYX-2-107，持续4小时；(图17C)PROTAC YX-2-107(2μM)与指定浓度的帕博西尼或沙利度胺，持续4小时；以及(图17D)PROTAC YX-2-107，持续4小时，洗涤并在不具有YX-2-107的情况下培养1、2、4、6和24小时；(图17E)火山图举例说明了通过在经PROTAC处理或对照(DMSO处理)样品的所有三个重复中发现的至少两种独特肽确定的显著差异的丰富的蛋白质。-log10 p值是针对log2倍数变化(PROTAC/DMSO)绘制的。蓝点表示p＜0.05且绝对倍数变化＞2的蛋白质。

图18A至18C示出了PROTAC YX-2-233在Ph+ALL细胞系中的作用。(图18A)PROTACYX-2-233的结构；(图18B)24小时时的细胞周期分析；以及(图18C)经PROTAC YX-2-233处理(24小时)的BV173或SUP-B15细胞的免疫印迹。

图19A至19D示出了帕博西尼、YX-2-107和Cereblon-配体(CRBN-L)在Ph+BV173和SUP-B15细胞中的作用。(图19A＆19B)在用指定药物浓度处理48小时之后BV173细胞(图19A)和SUP-B15细胞(图19B)的细胞周期分析；(图19C＆19D)BV173细胞(图19C)和SUP-B15细胞(图19D)的免疫印迹，其示出了在用指定药物浓度处理72小时之后CDK6、CDK4、FOXM1和磷酸化-RB的表达。

图20A至20I示出了PROTAC YX-2-107在Ph+ALL细胞和正常造血祖细胞中的作用。(图20A＆20B)在用指定药物浓度处理48小时之后BV173细胞(图20A)和SUP-B15细胞(图20B)的细胞周期分析；(图20C＆20D)BV173细胞(图20C)和SUP-B15细胞(图20D)的免疫印迹，其示出了在用指定药物浓度处理72小时之后CDK6、CDK4、FOXM1和磷酸化-RB的表达；(图20E)在经YX-2-107处理的Ph+ALL细胞(样品＃004)中CDK4/CDK6表达的免疫印迹(左)和S期细胞的数目(以经药物处理细胞与未经处理细胞(作为100)的百分比表示)(右)；(图20F至20H)在经YX-2-107处理的正常造血祖细胞和BV173细胞中的CDK4/CDK6表达的免疫印迹和S期细胞的百分比；(图20I)用抗CDK4或抗CDK6 shRNA转导并用嘌呤霉素选择48小时或用帕博西尼(500nM；24小时)处理的CD34+HSPC的细胞周期谱。

图21A＆21B示出了CDK6降解PROTAC或帕博西尼对BV173细胞增殖的作用。(图21A)YX-2-107相关PROTAC的结构；(图21B)用指定浓度的PROTAC处理24小时的BV173细胞的免疫印迹；(图21C)通过对用如(图21B)中的PROTAC或用帕博西尼处理24小时的BV173细胞进行碘化丙啶染色的S期细胞的百分比。使用graphpad PRISM软件基于S期细胞的百分比降低来计算IC

图22A至22E示出了PROTAC YX-2-107代谢稳定性及其在Ph+ALL的小鼠异种移植物中的生物活性。(图22A)在小鼠肝微粒体中孵育的YX-2-107、帕博西尼和E3连接酶募集分子的半衰期；(图22B)以10mg/kg腹膜内注射到C57BL/6j小鼠中的YX-2-107的血浆浓度的时间过程及其药代动力学特性(左)；c至e)通过碘化丙啶染色进行的细胞周期分析(图22C)和对磷酸化-RB、FOXM1、CDK4和CDK6进行的免疫印迹(图22D)，以及对来自NSG小鼠的骨髓白血病细胞(通过流式细胞术检测＞90％CD19+CD10+)的CDK4和CDK6表达进行的密度测定(图22E)，所述NSG小鼠注射Ph+ALL细胞，并在外周血白血病细胞为50％时用帕博西尼或YX-2-107以150mg/kg/天连续处理3天(3只小鼠/组)。在停止药物治疗之后24小时纯化骨髓白血病细胞。

图23A＆23B示出了PROTAC AC-1-212或帕博西尼对Ph+ALL细胞增殖的体内作用。向小鼠注射人Ph+ALL细胞(样品＃004)并且，当外周血白血病细胞(CD19+CD10+)＞50％时，用载剂、PROTAC AC-1-21220mg/kg IP BID或帕博西尼150mg/Kg通过管饲连续3天处理。最后一次处理之后12小时，纯化骨髓细胞(＞90％CD19+CD10+)并评估S期细胞的百分比(图23A)或CDK4/6、磷酸化-RB和FOXM1的表达(图23B)。CDK4和CDK6水平的定量(基于图23B免疫印迹)在图23C中示出。

图24A至24D示出了PROTAC YX-2-107处理对正常小鼠造血的作用。将6只(2个月大)C57BL/6j小鼠连续10天每天用载剂(Veh)或PROTAC YX-2-107(107)150mg/kg IP处理。停止处理之后4天，收集外周血(peripheral blood，PB)和骨髓(bone marrow，BM)细胞并通过流式细胞术分析；(图24A)用于对干细胞和祖细胞进行定量的设门策略；(图24B)用于对B淋巴祖细胞进行定量的设门策略；(图24C)BM中祖细胞群的百分比，(图24D)PB中选择的造血细胞的数目。如果p值＞0.05，则认为p值不显著(non-significant，N.S.)。

图25A至25J示出了注射Ph+ALL原代样品并用PROTAC YX-2-107处理的小鼠的白血病负荷。五周之后(PRE)通过抗CD19流式细胞术测试注射了原代Ph+ALL-004(图25A至25E)或ALL-1222(图25F至25J)的NSG小鼠以评估外周血中白血病细胞的频率。随后，将小鼠连续10天用如下处理：载剂(图25A＆25F)、帕博西尼150mg/kg每天一次(图25B＆26G)、PROTACYX-2-107 125mg/kg(ALL-004)或150mg/kg(ALL-1222)每天一次(图25C＆25H)或PROTACYX-2-107每天两次每次注射半剂量(图25D＆25I)。然后，在第7周(POST)确定外周血中白血病细胞(CD19+)的百分比。(图25E＆25J)如上所示百分比的倍数变化。

图26A至26F示出了PROTAC YX-2-107对注射了TKI抗性Ph+ALL的NSG小鼠的外周血白血病负担的作用。NSG小鼠注射了原代人TKI抗性(BCR-ABL1T315I)Ph+ALL样品(＃557)。(图26A至26D)在细胞注射后第7周(pre)和用帕博西尼(混合在饮食中以达到150mg/kg/天的剂量)或以25mg/kg或50mg/kg YX-2-107 IP两次/天处理12和20天之后来分析外周血白血病负担。在这些小鼠中，分别在第14天和第21天测定外周血白血病细胞(CD19+)的百分比。(图26E＆26F)如上所示百分比的倍数变化。

图27示出了NLS-CDK4对通过PROTAC YX-2-107的降解具有抗性。免疫印迹示出了NLS-CDK4和CDK6在经PROTAC YX-2-107处理的NLS-CDK4-BV173细胞中的表达。

具体实施方式

本公开内容涉及包含经修饰接头基团的PROTAC。这些化合物相对于本领域已知的那些显示出提高的特性。特别地，本文中所述的具有CDK6或CDK4靶向配体的PROTAC可表现出本领域已知化合物的一种或更多种优点，包括但不限于显示出提高的效力、提高的选择性或显示出提高的生物利用度。不希望受任何理论的束缚，认为接头中的碱性基团可导致化合物的分子特性改善以及优于CDK4的对CDK6的选择性降解。

在一些实施方案中，这些化合物可能能够抵消在目前临床上使用的CDK4/6抑制剂的情况下所见的CDK6表达的补偿性提高(Yang et al.，2017)。另外，本文中所述的PROTAC还可具有优于共价抑制剂的动力学优势，因为PROTAC诱导的降解之后蛋白质功能的恢复需要靶蛋白再合成。此外，本文中所述的PROTAC可能能够通过诱导多个蛋白质泛素化事件表现出亚化学计量效应，并且司克服在需要高剂量的药物的情况下的潜在暴露问题。

I.CDK在癌细胞中的作用

A.在Ph+ALL细胞中对MYB的需求

使用多西环素(Doxycycline，DOX)-诱导型MYB-shRNA(Drabsch et al.，2008)，其表明在Ph+ALL细胞系(BV173、SUP-B15、Z181)中使MYB表达沉默显著地抑制了增殖、抑制了集落形成，并诱导了细胞周期阻滞(De Dominici et al.，2018)。注射有shMYB-BV173细胞的经DOX处理的NSG小鼠具有较低的白血病负担，并且比未经处理的小鼠存活长得多的时间(De Dominici et al.，2018)。

还在注射有shMYB原代Ph+ALL细胞的小鼠中评估了MYB沉默的作用。与未经处理的小鼠相比，经DOX处理的小鼠的白血病负荷降低(De Dominici et al.，2018)，但由于其中MYB表达未沉默的GFP阳性降低的细胞的过度生长，该作用是短暂的(De Dominici et al.，2018)。

B.Ph+ALL系中MYB靶标的确定。

通过对未经处理的和经DOX处理的BV173和SUP-B15细胞进行微阵列分析，确定了在Ph+ALL中潜在重要的MYB靶标。包括LEF1、FOXM1、CCND3(细胞周期蛋白D3)、CDK6、BCL2和CDKN1A(p21)的79个基因在这两种系中表现出至少1.5倍的表达变化。MYB和CDK6的表达在Ph+ALL和高风险儿童ALL中高度相关。CDK6、CCDN3和CDKN1A水平的变化与MYB沉默的BV173细胞的细胞周期阻滞相关，并且具有生物学意义，如通过尽管CDK4水平未变化但CDK4/6依赖性RB磷酸化受到抑制所表明的。

C.Ph+ALL细胞增殖需要CDK6而不是CDK4。

CDK4和CDK6被认为在细胞周期中具有冗余的作用，并且在大多数Ph+ALL病例中易于检测到两种同种型的表达(De Dominici et al.，2018)。然而，使单独的CDK6沉默显著地抑制了Ph+ALL细胞中的增殖和磷酸化RB/FOXM1表达，而使CDK4表达沉默没有影响。该结果表明在这些细胞中CDK6发挥了不与CDK4共有的功能。有趣的是，CDK6主要定位于Ph+ALL细胞的细胞核中，而CDK4显示几乎仅是细胞质的。该发现可解释Ph+ALL细胞对CDK6的特定需求。事实上，细胞核定位的CDK4的表达挽救了MYB沉默的BV173细胞的细胞周期阻滞(DeDominici et al.，2018)。CDK4沉默对正常CD34+造血祖细胞的细胞周期没有影响；CDK6沉默将CD34+细胞的S期降低至对照细胞的约60％，但作用不如帕博西尼处理的细胞中的明显，表明CDK4表达部分补偿了CDK6的损失。

与这些数据一致，在CDK4沉默的细胞中，CDK6完全挽救了RB磷酸化和FOXM1水平，而在CDK6沉默的细胞中，CDK4的作用，特别是对S807-811磷酸化-RB的作用，仅是部分的。

D.恢复CDK6、细胞周期蛋白D3和BCL2的表达挽救了由MYB沉默诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡

细胞周期蛋白D3的异位表达没有挽救RB磷酸化、其靶标FOXM1的表达(Andersetal.，2011)，或MYB沉默的BV173细胞的细胞周期阻滞。相比之下，单独的CDK6的表达挽救了所有这三种表型，表明这些细胞表达足够的细胞周期蛋白D3或其他细胞周期蛋白D同种型来活化CDK6。细胞周期蛋白D3和CDK6的共表达比单独的CDK6更有效，但其促生长作用是短暂的，因为它不挽救由MYB沉默诱导的集落形成降低和细胞凋亡，可能是因为它对BCL2水平没有影响。事实上，BCL2的表达恢复了体外生长，抑制了细胞凋亡，并部分挽救了MYB沉默的细胞的克隆形成潜能。

E.用帕博西尼进行处理显著抑制了Ph+细胞的体外生长，但在体内具有短暂的作用

用帕博西尼(0.5μM)进行处理显著抑制了BV173细胞的生存力和S期的百分比(n＝8)以及原代Ph+ALL细胞的集落形成(n＝5)(De Dominici et al.，2018)。然而，在NSG小鼠中，原代Ph+ALL的帕博西尼依赖性生长抑制是短暂的，其中白血病负担在治疗终止之后30天恢复至在未经处理的小鼠中所见的水平。该结果表明治疗的持续时间可能不足够，并且该作用仅是细胞抑制性的。由于细胞周期蛋白D3和CDK6的共表达没有挽救由MYB沉默诱导的细胞凋亡和集落形成抑制，因此可通过同时靶向增殖途径和抗细胞凋亡途径来模拟MYB沉默的作用。事实上，帕博西尼/Sabutoclax(BCL2家族拈抗剂)组合比离体或在体内单独使用的药物更有效。由于Sabutoclax是泛BCL2抑制剂(Lu et al.，2006)但MYB沉默对BCL-XL和MCL-1表达没有影响，因此为了更接近地模拟MYB沉默，在Ph+ALL细胞中测试了帕博西尼与BCL2拈抗剂维奈托克(Venetoclax)组合(Souers et al.，2013)的离体作用。用帕博西尼和维奈托克共处理BV173和SUP-B15 Ph+细胞系比单独的任一种药物更有效地抑制细胞生长，并且该作用似乎是协同的(BV173细胞)或叠加的(SUP-B15细胞)。有趣的是，SUP-B15细胞比BV173细胞对维奈托克敏感得多(nM与μM)。

II.本公开内容的化合物

本公开内容的化合物例如在以下表1中、发明概述部分中和所附权利要求书中示出。它们可使用实施例部分中概述的合成方法来制备。这些方法可使用如本领域技术人员应用的有机化学的原理和技术进一步修改和优化。例如，在Smith，March’s AdvancedOrganic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，(2013)中教导了这样的原理和技术，其通过引用并入本文。另外，合成方法可使用本领域技术人员应用的工艺化学的原理和技术进一步修改和优化，以用于制备型、中试规模或大规模的生产(无论是分批还是连续的)。例如，在Anderson，Practical Process Research＆Development-A Guide forOrganic Chemists(2012)中教导了这样的原理和技术，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开内容的所有化合物可用于预防和治疗本文中或在其他方面讨论的一种或更多种疾病或病症。在一些实施方案中，本文中表征或例示为中间体、代谢物和/或前药的一种或更多种化合物也可用于预防和治疗一种或更多种疾病或病症。因此，除非明确地指出相反，否则本公开内容的所有化合物均被视为预期用作活性药物成分(active pharmaceutical ingredient，API)的“活性化合物”和“治疗性化合物”。人或兽医使用的实际适用性通常是使用临床试验方案和监管程序例如由食品和药物管理局(Foodand Drug Administration，FDA)管理的那些的组合来确定的。在美国，FDA负责通过确保人药和兽药、疫苗和其他生物制品以及医疗设备的安全性、有效性、质量和安全性来保护公众健康。

在一些实施方案中，本公开内容的化合物具有以下优点：它们可比现有技术中已知的化合物更有效，比现有技术中已知的化合物毒性更低，比现有技术中已知的化合物作用时间更长，比现有技术中已知的化合物更强效，产生比现有技术中已知的化合物更少的副作用，比现有技术中已知的化合物更易吸收，比现有技术中已知的化合物在代谢上更稳定，比现有技术中已知的化合物亲脂性更大，比现有技术中已知的化合物亲水性更大，和/或具有比现有技术中已知的化合物更好的药动学谱(例如，更高的经口生物利用度和/或更低的清除率)，和/或具有优于现有技术中已知的化合物的其他可用的药理、物理或化学特性，无论是否用于本文中或其他方面所述的适应证。

本公开内容的化合物可包含一个或更多个不对称取代的碳或氮原子，并且可以以光学活性或外消旋形式分离。因此，除非明确地指出具体的立体化学或异构形式，否则预期了化学式的所有手性、非对映体、外消旋形式、差向异构形式和所有几何异构形式。化合物可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、非对映体混合物和单独的非对映体存在。在一些实施方案中，获得单一非对映体。本公开内容的化合物的手性中心可具有S或R构型。在一些实施方案中，本发明化合物可包含两个或更多个具有确定的立体化学取向的原子

用于表示本公开内容的化合物的化学式通常仅示出了数种可能的不同互变异构体中的一种。例如，已知许多类型的酮基团与相应的烯醇基团平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基团与烯胺基团平衡存在。无论对于给定化合物描述了哪种互变异构体，并且无论哪一种是最普遍的，都预期了给定化学式的所有互变异构体。

另外，构成本公开内容的化合物的原子旨在包括这样的原子的所有同位素形式。本文中使用的同位素包括具有相同的原子序数但质量数不同的那些原子。作为一般实例而非限制，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括

在一些实施方案中，本公开内容的化合物以盐或非盐形式存在。关于盐形式，在一些实施方案中，形成本文中提供的化合物的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子并不重要，只要该盐作为整体是药理学上可接受的即可。可药用盐的另外的实例及其制备和使用方法在Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(2002)中给出，其通过引用并入本文。

表1：本公开内容的化合物

III.药物制剂和施用途径

在另一方面中，对于向有这样的治疗需要的患者施用，药物制剂(pharmaceuticalformulation)(也被称为药物制剂(pharmaceutical preparation)、药物组合物、药物产品、医药产品、药品、药物或药剂)包含与适合于指定施用途径的一种或更多种赋形剂和/或药物载体一起配制的治疗有效量的本文中公开的化合物。在一些实施方案中，本文中公开的化合物以适合于治疗人和/或兽医患者的方式配制。在一些实施方案中，制剂包含一种或更多种本文中公开的化合物与一种或更多种以下赋形剂的混合或组合：乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇。在一些实施方案中，例如，对于经口施用，可将药物制剂压片或包封。在一些实施方案中，可将化合物在水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化钠和/或多种缓冲剂中溶解或浆化。在一些实施方案中，药物制剂可进行药学操作例如灭菌，和/或可包含药物载体和/或赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、包封剂(例如脂质)、树枝状聚合物、聚合物、蛋白质(例如白蛋白)、核酸和缓冲剂。

药物制剂可通过多种方法施用，例如经口或通过注射(例如皮下、静脉内和腹膜内)施用。根据施用途径，本文中公开的化合物可用材料包被以保护化合物免受酸和其他可使化合物失活的自然条件的作用。为了通过肠胃外施用以外的方式施用活性化合物，可能需要用防止化合物失活的材料包被化合物或将化合物与防止其失活的材料共施用。在一些实施方案中，活性化合物可在合适的载体(例如脂质体或稀释剂)中向患者施用。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳剂以及常规脂质体。

本文中公开的化合物也可经肠胃外、腹膜内、椎管内或脑内施用。可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中，以及在油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。

适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性时)或分散体，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和植物油。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包含等张剂，例如糖、氯化钠或多元醇例如甘露醇和山梨醇。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶来实现。

本文中公开的化合物可例如与惰性稀释剂或可被吸收的可食用载体一起经口施用。所述化合物和其他成分也可封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接并入患者的饮食中。对于经口治疗性施用，本文中公开的化合物可与赋形剂一起并入并且可以以可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。当然，治疗性化合物在组合物和制剂中的百分比可变化。治疗性化合物在这样的药物制剂中的量是使得将获得合适的剂量。

治疗性化合物还可表面施用于皮肤、眼、耳或黏膜。表面施用的治疗性化合物可包括作为表面用溶液剂、洗剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、泡沫剂、透皮贴剂或酊剂的化合物制剂。当治疗性化合物配制成用于表面施用时，可将化合物与提高化合物通过其所施用的组织之渗透性的一种或更多种药剂组合。在另一些实施方案中，考虑了将表面施用施用于眼。这样的施用可应用于角膜、结膜或巩膜的表面。不希望受任何理论束缚，认为向眼的表面施用允许治疗性化合物到达眼的后部部分。眼表面施用可被配制成溶液剂、混悬剂、软膏剂、凝胶剂或乳剂。最后，表面施用还可包括施用至黏膜，例如口的内部。这样的施用可直接至黏膜内的特定位置，例如齿、疮(sore)或溃疡。或者，如果期望局部递送至肺，则治疗性化合物可通过吸入干粉或气雾剂制剂施用。

在一些实施方案中，为了便于施用和剂量均一性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物可以是有利的。本文中使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗患者的单位剂量的物理分散单元；每个单元包含经计算以与所需药用载体联合产生期望治疗效果的预定量的治疗性化合物。在一些实施方案中，本公开内容的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于以下：(a)治疗性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及(b)对用于在患者中治疗选定病症的这样的治疗性化合物进行复配的领域中的固有局限性。在一些实施方案中，活性化合物以足以治疗与患者中的病症相关的病症的治疗有效剂量施用。例如，化合物的效力可在可预测在人或另一种动物中治疗疾病的效力的动物模型系统中评价。

在一些实施方案中，治疗性化合物的有效剂量范围可从在动物研究中确定的对多种不同动物的有效剂量来推断。在一些实施方案中，以mg/kg计的人当量剂量(humanequivalent dose，HED)可根据下式计算(参见例如Reagan-Shaw et al.，FASEB J.，22(3)：659-661，2008，其通过引用并入本文)：

HED(mg/kg)＝动物剂量(mg/kg)×(动物K

在转换中使用K

治疗性组合物的精确量取决于从业者的判断并且对每个个体具有特异性。尽管如此，计算出的HED剂量提供了通用指导。影响剂量的其他因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标以及特定治疗制剂的效力、稳定性和毒性。

施用于患者的本公开内容的化合物或包含本公开的化合物的组合物的实际剂量可通过例如以下的物理和生理因素来确定：所治疗的动物类型、年龄、性别、体重、病症严重程度、待治疗的疾病类型、先前或同时的治疗性干预、患者的特发病(idiopathy)以及施用途径。这些因素可由技术人员确定。负责施用的从业者通常将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体患者的适当剂量。在任何并发症的情况下，剂量可由个体医师调整。

在一些实施方案中，持续一天或数天的每天的一个或更多个剂量施用中的治疗有效量通常将从约0.001mg/kg至约1000mg/kg、从约0.01mg/kg至约750mg/kg、从约100mg/kg至约500mg/kg、从约1mg/kg至约250mg/kg、从约10mg/kg至约150mg/kg变化(取决于施用方式的过程和上述讨论的因素)。其他合适的剂量范围包括每天1mg至10,000mg、每天100mg至10,000mg、每天500mg至10,000mg和每天500mg至1,000mg。在一些实施方案中，所述量少于每天10,000mg，范围为每天750mg至9,000mg。

在一些实施方案中，药物制剂中活性化合物的量为约2至约75重量百分比。在这些实施方案的一些中，所述量为约25至约60重量百分比。

考虑了药剂的单剂量或多剂量。本领域普通技术人员可仅使用常规实验确定用于递送多剂量的期望时间间隔。作为一个实例，可以以约12小时的间隔每天向患者施用两个剂量。在一些实施方案中，每天施用一次药剂。

可按照常规时间表施用药剂。本文中使用的常规时间表是指预定的指定时间段。常规时间表可涵盖长度相同或不同的时间段，只要时间表是预定的即可。例如，常规时间表可包括每天两次、每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间的任何设定天数或周数的施用。或者，预定的常规时间表可包括在第一周每天两次施用，随后是每天施用，持续数月等。在另一些实施方案中，本公开内容提供了可经口服用并且其时间依赖或不依赖于食物摄入的药剂。因此，例如，可每天早晨和/或每天晚上服用药剂，而不管患者何时已经进餐或将要进餐。

IV.化学定义

当用于化学基团的情况时：“氢”意指-H；“羟基”意指-OH；“氧代”意指＝O；“羰基”意指-C(＝O)-；“羧基”意指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO

在化学式的情况下，符号“-”意指单键，“＝”意指双键，以及“≡”意指三键。符号“----”表示任选键，其如果存在的话是单键或双键。符号

当环体系上的变量被描述为“浮动基团(floating group)”时，例如，下式中的基团“R”：

则所述变量可替代与任何环原子连接的任何氢原子，包括示出的、暗含的或明确限定的氢，只要形成稳定的结构即可。当稠环体系上的变量被描述为“浮动基团”时，如例如下式中的基团“R”：

则除非另有说明，否则该变量可替代与任一稠环的任何环原子连接的任何氢。可替代的氢包括示出的氢(例如，上式中与氮连接的氢)、暗含的氢(例如，上式的未示出但被理解为存在的氢)、明确限定的氢以及其存在取决于环原子的身份的任选的氢(例如，当X等于-CH-时，与基团X连接的氢)，只要形成稳定的结构即可。在描述的实例中，R可位于稠环体系的五元环或六元环上。在上式中，紧跟着括在括号内的R的下标字母“y”表示数值变量。除非另有说明，否则该变量可以是0、1、2或大于2的任何整数，这仅受环或环体系的可替代氢原子的最大数目限制。

对于化学基团和化合物类别，基团或类别中碳原子的数目如下所示：“Cn”或“C＝n”限定了在该基团/类别中碳原子的确切数目(n)；“C≤n”限定了可在基团/类别中的碳原子的最大数目(n)，且最小数目对于所讨论的基团/类别尽可能小。例如，可理解，在基团“烷基

当术语“饱和的”用于修饰化合物或化学基团时意指该化合物或化学基团不含碳-碳双键并且不含碳-碳三键，除如下所述之外。当该术语用于修饰原子时，其意指该原子不是任何双键或三键的一部分。在饱和基团的经取代形式的情况下，可存在一个或更多个碳氧双键或碳氮双键。并且当存在这样的键时，则不排除可作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构的一部分而存在的碳-碳双键。当术语“饱和的”用于修饰物质的溶液时，其意指不能有更多的该物质可溶解在该溶液中。

术语“脂族”表示经如此修饰的化合物或化学基团是无环或环状但非芳族的化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳族环(脂环)连接在一起。脂族化合物/基团可以是饱和的，即，通过碳-碳单键连接(烷烃/烷基)；或者是不饱和的，具有一个或更多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或更多个碳-碳三键(炔烃/炔基)。

术语“芳族”表示经如此修饰的化合物或化学基团在完全共轭的环状π体系中具有4n+2个电子的平面不饱和原子环。芳族化合物或化学基团可描述为单一共振结构；然而，对一个共振结构的描述也被认为是指任何其他共振结构。例如：

芳族化合物也可使用圆圈描述以表示完全共轭环状π体系中电子的离域性质，其两个非限制性实例在下面示出：

术语“烷基”是指单价饱和脂族基团，其以碳原子作为连接点，具有直链或支链的无环结构，并且不含碳和氢之外的原子。以下基团是烷基的一些非限制性实例：-CH

术语“环烷基”是指单价饱和脂族基团，其以碳原子作为连接点(所述碳原子形成一个或更多个非芳族环结构的一部分)，不含碳-碳双键或三键，并且不含碳和氢之外的原子。一些非限制性实例包括：-CH(CH

术语“芳基”是指单价不饱和芳族基团，其以芳族碳原子作为连接点，所述碳原子形成一个或更多个芳族环结构(每一个具有6个全部均为碳的环原子)的一部分，并且其中所述基团不由碳和氢之外的原子组成。如果存在多于一个环，则环可以是稠合或非稠合的。非稠合的环用共价键连接。本文中使用的术语芳基不排除存在与第一芳族环或者存在的任何另外芳族环连接的一个或更多个烷基(碳数目限制允许)。芳基的一些非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C

“芳烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是芳基，如该术语在上文定义的。苯和甲苯是芳烃的非限制性实例。

术语“芳烷基”是指单价基团-链烷二基-芳基，其中术语链烷二基和芳基各自以与以上提供的定义一致的方式使用。一些非限制性实例是：苯基甲基(苄基，Bn)和2-苯基-乙基。

术语“杂芳基”是指单价芳族基团，其以芳族碳原子或氮原子作为连接点，所述碳原子或氮原子形成一个或更多个芳族环结构(每个具有三至八个环原子)的一部分，其中芳族环结构的至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中杂芳基不由碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫之外的原子组成。如果存在多于一个环，则环是稠合的；然而，术语杂芳基不排除存在与一个或更多个环原子连接的一个或更多个烷基或芳基(碳数目限制允许)。杂芳基的一些非限制性实例包括苯并

术语“杂环烷基”是指单价非芳族基团，其以碳原子或氮原子作为连接点，所述碳原子或氮原子形成一个或更多个非芳族环结构(每个具有3至8个环原子)的一部分，其中非芳族环结构的至少一个环原子为氮、氧或硫，并且其中杂环烷基不由碳、氢、氮、氧和硫之外的原子组成。如果存在多于一个环，则环是稠合的。本文中使用的该术语不排除存在与一个或更多个环原子连接的一个或更多个烷基(碳数目限制允许)。此外，该术语不排除在环或环体系中存在一个或更多个双键，前提是所得基团仍然是非芳族的。杂环烷基的一些非限制性实例包括：氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、吡喃基、氧杂环丙烷基和氧杂环丁烷基。术语“N-杂环烷基”是指以氮原子作为连接点的杂环烷基。N-吡咯烷基是这样的基团的一个实例。“杂环烷烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R为杂环烷基。

术语“杂环链烷二基”是指二价环状基团，其以两个碳原子、两个氮原子或者一个碳原子和一个氮原子作为两个连接点，所述原子形成一个或更多个环结构的一部分，其中非芳族环结构的至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中二价基团不由碳、氢、氮、氧和硫之外的原子组成。如果存在多于一个环，则环是稠合的。本文中使用的术语杂环链烷二基不排除存在与一个或更多个环原子连接的一个或更多个烷基(碳数目限制允许)。此外，该术语不排除在环或环体系中存在一个或更多个双键，前提是所得基团仍然是非芳族的。杂环链烷二基的一些非限制性实例包括：

当化学基团与“经取代”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子在每种情况下独立地被以下替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”结合使用时，使用未用数量词修饰的名词可意指“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义相一致。

在本申请通篇，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的装置、方法的固有误差变化、或者在研究对象或患者之间存在的变化。

“活性成分”(active ingredient，AI)或活性药物成分(API)(也被称为活性化合物、活性物质、活性剂、药物剂、药剂、生物活性分子或治疗性化合物)是在药物中具有生物活性的成分。

术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连系动词。这些动词中一个或更多个的任何形式或时态同样是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或更多个步骤的任何方法并不限于只拥有这一个或更多个步骤，并且还包括其他未列出的步骤。

术语“有效的”如该术语在说明书和/或权利要求书中使用的意指足以实现期望的、预期的或所需的结果。当在用化合物治疗患者或对象的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指当向对象或患者施用以治疗或预防疾病时化合物的量是足以实现疾病的这样的治疗或预防的量。

“赋形剂”是与药物、药物组合物、制剂或药物递送系统的活性成分一起配制的可药用物质。赋形剂可用于例如使组合物稳定、使组合物增大(bulk up)(因此当用于此目的时通常被称为“填充剂(bulking agent)”、“填料”或“稀释剂”)，或者赋予最终剂量形式中的活性成分以治疗性增强，例如促进药物吸收、降低黏度或增强溶解度。赋形剂包括抗黏剂、黏合剂、涂料、着色剂、崩解剂、矫味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸着剂、甜味剂和载剂的可药用形式。充当输送活性成分的介质的主要赋形剂通常称为载剂。赋形剂也可用于制造过程，例如除了有助于体外稳定性(例如防止在预期的货架期内变性和聚集)之外，还例如通过促进粉末流动性或非黏性性质来有助于活性物质的处理。赋形剂的适用性将通常根据施用途径、剂量形式、活性成分以及其他因素而变化。

本文中使用的术语“IC

第一化合物的“异构体”是一种独立化合物，其中每个分子与第一化合物包含相同的构成原子，但是其中这些原子的三维构型不同。

本文中使用的术语“患者”或“对象”是指活的哺乳动物生物体，例如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或对象是灵长类。人患者的一些非限制性实例是成人、青少年、婴幼儿和胎儿。

本文中通常使用的“可药用”是指与合理的效益/风险比相称的在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织、器官和/或体液接触而无过度的毒性、刺激性、变应性应答或者其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

“可药用盐”意指本文中公开的化合物的盐，其是如上文定义的可药用的，并且其具有期望的药理学活性。这样的盐包括与以下形成的酸加成盐：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，例如1，2-乙二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4，4’-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂族单羧酸和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲磺酸、黏康酸、邻(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。可药用盐还包括碱加成盐，其可在存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时形成。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应意识到，形成本公开内容的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子并不重要，只要该盐作为整体是药理学上可接受的即可。可药用盐的另外的实例及其制备和使用方法在以下中给出：Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(P.H.Stahl＆C.G.Wermuth编辑，Verlag Helvetica Chimica Acta，2002)。

“可药用载体”、“药物载体”或简称“载体”是与活性成分药物一起配制的可药用物质，其参与携带、递送和/或运输化学药剂。药物载体可用于改善药物的递送和有效性，包括例如控释技术以调节药物生物利用度、降低药物代谢和/或降低药物毒性。一些药物载体可提高药物递送至特定靶部位的有效性。载体的一些实例包括：脂质体、微球(例如，由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物制成)、白蛋白微球、合成聚合物、纳米纤维、蛋白质-DNA复合体、蛋白质缀合物、红细胞、病毒微体(virosome)和树枝状聚合物。

“药用药物”(也被称为药物(pharmaceutical)、药物制剂、药物组合物、药物制剂、药物产品、医药产品、药品、药物、药剂，或简称为药物、药剂或制剂)是用于诊断、治愈、治疗或预防疾病的组合物，其包含活性药物成分(API)(如上定义)并任选地包含一种或更多种非活性成分，其也被称为赋形剂(如上定义)。

“预防”或“防止”包括：(1)抑制可具有患病风险和/或易于患病但尚未经历或表现出疾病的任何或全部病理或症状的对象或患者中疾病的发生，和/或(2)减慢可具有患病风险和/或易于患病但尚未经历或表现出疾病的任何或全部病理或症状的对象或患者中疾病的病理或症状的发生。

“立体异构体”或“光学异构体”是给定化合物的异构体，其中相同原子键合到相同的其他原子，但其中这些原子的三维构型不同。“对映体”是给定化合物的彼此互为镜像的立体异构体，就像左手和右手。“非对映体”是给定化合物的不是对映体的立体异构体。手性分子包含手性中心，也称为立体中心或立体源中心，其为带有基团的分子中的任何点(但未必是原子)，以使得任意两个基团的交换得到立体异构体。在有机化合物中，手性中心通常是碳原子、磷原子或硫原子，但是其他原子也可能是有机化合物和无机化合物中的立体中心。分子可具有多个立体中心，向其提供许多立体异构体。在立体异构是由四面体立体源中心(例如，四面体碳)引起的化合物中，假设可行的立体异构体的总数将不超过2

“治疗”包括：(1)抑制正在经历或表现出疾病的病理或症状的对象或患者中的疾病(例如阻止病理和/或症状的进一步发展)，(2)改善正在经历或表现出疾病的病理或症状的对象或患者中的疾病(例如逆转病理和/或症状)，和/或(3)在正在经历或表现出疾病的病理或症状的对象或患者中产生该疾病或其症状的任何可测量的降低。

术语“单位剂量”是指化合物或组合物的制剂，使得该制剂以足以在单次施用中向患者提供单次治疗有效剂量的活性成分的方式制备。可使用的这样的单位剂量制剂包括但不限于单个片剂、胶囊剂或其他经口制剂，或者具有可注射液体或其他可注射制剂的单个小瓶。

以上定义替代通过引用并入本文的任何参考文献中任何相矛盾的定义。然而，定义了某些术语的事实不应视为指示任何未定义的术语是不确定的。相反地，认为所使用的所有术语描述本公开内容，以使得普通技术人员能够理解本公开内容的范围和实践。

V.实施例

包括以下实施例以说明本公开内容的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本公开内容的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成了用于本公开内容实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，对所公开的具体实施方案作出许多变化而仍然获得相同或相似的结果。

实施例1-CDK4/6-抑制性PROTAC的合成和表征

方案1.YX-2-79的合成路线

将帕博西尼(224mg，0.5mmol)和丁-3-炔酸(50mg，0.5mmol)在DMF(10ml)中的混合物用DIPEA(166μL，1.0mmol)并然后用HATU(190mg，0.5mmol)处理并在环境温度下搅拌1小时。在这之后，将反应混合物用H

将2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙醇(3.0g，16.9mmol)溶解在t-BuOH(30ml)中，并且然后在环境温度下将KOt-Bu(3.9g，33.8mmol)添加至反应物。1小时之后，将2-溴乙酸叔丁酯(6.6g，33.8mmol)缓慢添加至反应混合物并在50℃下搅拌5小时。除去反应溶剂并且用H

将VHL-配体(430mg，1.0mmol)和YX-2-9(233mg，1.0mmol)在DMF(10ml)中的混合物用DIPEA(360μL，2.0mmol)并然后用HATU(380mg，1.0mmol)处理并在环境温度下搅拌2小时。在这之后，将反应混合物用H

将CuSO

方案2.YX-2-99的合成路线

将Celebron-配体(502mg，1.0mmol)溶解在MeOH(8Ml)中并用二氧六环/HCl(4.0M，1.0mL)处理。在室温下搅拌2小时之后，除去反应溶剂，并且将粗制产物直接用于下一步。将胺和2-叠氮基乙酸(100mg，1.0mmol)在DMF(10ml)中的混合物用DIPEA(360μL，2.0mmol)并然后用HATU(380mg，1.0mmol)处理并在环境温度下搅拌2小时。然后将反应混合物用H

将帕博西尼-炔烃YX-2-76(26mg，0.05mmol)和Celebron-叠氮化物(24mg，0.05mmol)在DMF/H

方案3.YX-2-107的合成路线

在0℃下将氯乙酰氯(144μL，1.2mmol)添加至帕博西尼(448mg，1.0mmol)和DMAP(催化量)在无水二氯甲烷中的混合物中。反应混合物在室温下搅拌3小时。除去二氯甲烷，然后将乙酸乙酯添加至混合物中。过滤悬浮液，并且将固体用乙酸乙酯进行洗涤并在真空下干燥，得到YX-2-177(498mg，95％产率)。LC-MS RT＝1.42，ES+ve 524。

将帕博西尼-氯化物YX-2-177(52mg，0.1mmol)和Celebron-胺YX-2-188(40mg，0.1mmol)添加至DMF(5mL)中，并然后用三乙胺(41μL，0.3mmol)处理。将混合物加热至40℃过夜。完成之后，除去溶剂，并将粗制产物直接通过二氧化硅上色谱进行纯化，得到YX-2-107(9.0mg，10％产率)。

(使用类似的途径制备AC-1-027)。

方案4.YX-2-196的合成路线

将VHL配体(934mg，2.0mmol)和6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸(508mg，2.2mmol)在DMF(15mL)中的混合物用DIPEA(720μL，4.0mmol)处理。添加HATU(769mg，2.0mmol)并将反应混合物在环境温度下搅拌1小时。然后将反应混合物用H

将上述化合物溶解在DCM(10ml)中并用TFA(2ml)处理，搅拌2小时，并且然后除去溶剂。将粗制产物(61mg，0.095mmol)和YX-2-177(49.7mg，0.095mmol)添加至DMF(12ml)中并用三乙胺(38μL，0.3mmol)处理。将混合物加热至45℃过夜。完成之后，除去溶剂并将粗制产物直接通过二氧化硅上色谱进行纯化，得到标题化合物YX-2-196(3.6mg，4％产率)。LC-MS RT＝1.36，ES+ve 1031。

方案5.YX-2-233的合成路线

将YX-2-177(100mg，0.2mmol)和(甲基氨基)甲基氨基甲酸叔丁酯(34mg，0.4mmol)在DCM(8ml)中的混合物用TEA(100μl，0.8mmol)处理并且然后回流过夜。蒸发DCM并将粗制产物通过二氧化硅上色谱进行纯化，得到YX-2-226(40mg，30％产率)。LC-MS RT＝1.32，ES+ve 662。

将YX-2-226(20mg，0.03mmol)溶解在DCM(1mL)中并用TFA(0.1mL)处理，搅拌2小时。接着，除去反应溶剂，并将粗制产物和YX-2-23溶解在DMF(3mL)中并用DIPEA(10μl，0.06mmol)和HATU(12mg，0.03mmol)处理。混合物在室温下搅拌2小时。完成之后，将混合物用乙酸乙酯和水处理。分离有机相并蒸发至干燥，并且将产物通过二氧化硅上色谱进行纯化，得到YX-2-233(6mg，17％产率)。

方案6.YX-2-233的合成路线

将IAP配体(80mg，0.13mmol)和2-氯乙酸甲酯(40μL，0.52mmol)在DMF(4mL)中的溶液用碳酸钾(50mg，0.52mmol)处理并将混合物在室温下搅拌过夜。将粗制产物直接通过二氧化硅上色谱进行纯化，得到YX-2-216(40mg，44％产率)。将YX-2-216(230mg，0.33mmol)溶解在MeOH(2mL)中并用NaOH/H

将YX-2-226(20mg，0.03mmol)溶解在DCM(1mL)中并用TFA(0.1mL)处理，之后在室温下搅拌2小时。然后除去溶剂，并将粗制产物直接用于下一步。将粗制产物和YX-2-224(20mg，0.025mmol)在DMF中的混合物用DIPEA(20μL，0.05mmol)并然后用HATU(12mg，0.025mmol)处理，并将混合物在环境温度下搅拌1小时。然后将反应混合物用H

实施例2-生物数据

预期与E3连接酶募集分子相连的有效CDK6激酶抑制剂可与CDK6结合并降解该蛋白质，其可能提供比目前小分子抑制剂可能提供的更特异和持久的抑制。最初CDK4/6靶向PROTAC的设计由与CDK6复合的帕博西尼的X射线晶体结构(PDB代码：2euf)(Lu et al.，2006)指导。接头附着的位点对于维持配体亲和力是重要的。帕博西尼的哌嗪尾部从活性位点(ATP袋)向溶剂突出，表明其可耐受接头附着至多种E3连接酶募集分子(Wang et al.，2016)。进行了数种化合物的合成以了解可耐受哪些。CRBN E3-胺(方案7)是使用已发表程序(Winter et al.，2015)的略微改变来合成的。帕博西尼与氯乙酰氯反应，随后用CRBNE3-胺进行烷基化以产生帕博西尼-PROTAC，YX-2-107(方案3和7)。还合成了对照化合物YX-2-115(方案7；在Wang et al.，2016中描述的化合物4d)。

方案7.产生YX-2-107和YX-2-115的合成顺序概述

针对帕博西尼衍生物抑制CDK4和CDK6激酶活性的能力评估了以下三种帕博西尼衍生物：YX-2-79(方案1)、YX-2-107和YX-2-115。化合物YX-2-115和PROTAC YX-2-107有效抑制CDK6和CDK4。YX-2-79的效力低40倍(图1和表2)。接下来，在Ph+BV173和SUP-B15细胞中测试了YX-2-107的作用，并且发现其抑制进入S期、RB磷酸化和FOXM1表达，但与帕博西尼相比在更高的浓度下(图2A至2D)。

表2：YX-2-79、YX-2-107和YX-2-115对CDK4和CDK6激酶活性的抑制

一个关键发现是帕博西尼处理诱导了CDK4，并且尤其是CDK6的表达提高；相比之下，在YX-2-107处理的细胞中CDK4表达没有提高并且CDK6的水平显著降低(图2A至2D)。由Celebron配体和接头组成的对照化合物(CRBN-L)没有作用(图2A至2D)。早在用YX-2-107处理之后1小时就检测到在Ph+BV173细胞中CDK6下调，并且在4小时时CDK6的水平被显著抑制(图3A)。然而，用蛋白酶体抑制剂MG132的处理恢复了在未处理细胞水平的CDK6表达(图3B)，强烈表明在YX-2-107处理的Ph+ALL细胞中CDK6被靶向通过依赖于Celebron的泛素化进行蛋白酶体降解。在体内研究中，NSG小鼠(三个/组)用原代Ph+ALL细胞进行注射，并当外周血CD19+细胞达到＞50％时，用帕博西尼或YX-2-107处理(连续3天)，或者不处理；然后，纯化骨髓细胞(＞90％CD19+/CD10+)并评估细胞周期活性以及磷酸化RB、FOXM1和CDK4/CDK6水平。帕博西尼和YX-2-107在抑制S期细胞以及消除RB磷酸化和FOXM1表达上无法区分(图4A至4C)。然而，用YX-2-107的处理抑制了CDK4和CDK6水平，而帕博西尼反而上调了CDK6表达。为了扩展CDK4/6靶向PROTAC的平台，通过将帕博西尼衍生物YX-2-115(方案7)与MDM2拈抗剂RG7112(Tovar et al.，2013)连接来合成PROTAC YX-2-233(图5A)，以募集MDM2 E3连接酶。使用BV173和SUP-B15 Ph+ALL细胞系的离体实验显示，用YX-2-233的处理诱导了S期细胞数目和RB磷酸化显著降低(图5B和5C)。与YX-2-107相比，用YX-2-233的处理诱导了CDK4和CDK6水平显著降低(图5C)。

通过组合CDK4/6结合分子、不同长度和疏水性的系链以及利用多种E3连接酶募集分子，开发了另外的PROTAC以优化结合亲和力和细胞效力。合成了与YX-2-107密切相关的维持激酶抑制剂效力的类似物，作为直接测量结合亲和力的替代物。开发了测定以评价PROTAC衍生物与其所靶向E3连接酶的结合亲和力。YX-2-233(图5A)利用抑制CDK6的结构要求(Lu et al.，2006)靶向至少3至4种另外的CDK6抑制剂(帕博西尼除外)，并且使用这些作为配体与E3连接酶募集分子缀合。使用结合测定优化E3连接酶募集分子可改善三元复合物的形成(Wurz et al.，2018和Galdeano et al.，2014)。E3连接酶募集分子包括cIAP配体和VHL配体(Sato et al.，2008，Lai and Crews，2017，和Burslem and Crews，2017)。VHL E3连接酶募集配体(Galdeano et al.，2014，Galdeano et al.，2012，和Matyskiela et al.，2018)用于募集为靶向HIF-1a进行降解的VHL E3连接酶的底物识别亚基的von Hippel-Lindau蛋白(pVHL)。合成了VHL募集配体PROTAC，YX-2-196(方案4)，并其表现出类似的磷酸化RB抑制(图6)。在CDK6水平降低上的差异可能是与YX-2-107相比使用YX-2-196没有使CDK6有效泛素化的结果。cIAP募集配体重新引导通常降解胱天蛋白酶蛋白的E3连接酶cIAP的功能，以使CDK6泛素化并降解。合成了含有cIAP的化合物AC-1-027。YX-2-107和AC-1-027的作用的比较在图7中显示。可耐受各种系链，包括烷基和PEG接头，以及更短和更长的接头。还制备了由酰胺键或三唑构建的系链(Wurz et al.，2018)以证明组分的相容性。计划了用于针对靶标的效力、用于募集E3连接酶的效力以及分子特性的进一步SAR。如通过合成在体内有效的化合物证明的，优化的分子虽然通常比正常药物更大但可透过细胞并且具有足够的代谢稳定性。相对于竞争性抑制剂，PROTAC可提供另外的选择性层(Lai and Crews，2017)。这种效果通过CDK6比CDK4优先降解凭经验观察到。

比较用每日IP注射帕博西尼和YX-2-107处理10天后对白血病载量的作用的体内实验在图8中显示。YX-2-107在阻断白血病发展上是有效的并且未见副作用。该效果与帕博西尼相当。注意到i)YX-2-107组在处理开始时的白血病载量与帕博西尼组相比更高；和ii)与125mg/kg的YX-2-107相比，使用150mg/kg的帕博西尼。考虑到帕博西尼的M.W.低于YX-2-107，YX-2-107的实际浓度甚至更低。

YX-2-107在Ph+BV173和SUP-B15细胞中的另外的作用在图9中显示。YX-2-107抑制RB磷酸化并且相对于CDK4选择性地降低CDK6蛋白水平。YX-2-107与帕博西尼相比略弱，但具有降低CDK6蛋白水平的优势，其中CDK6蛋白水平在用帕博西尼处理后提高。

实施例3-用于选择性降解CDK6的PROTAC

A.材料和方法

细胞系、Ph+原代ALL样品和细胞培养物。SUP-B15细胞系(Ph+ALL)购自ATCC；BV173细胞系(Ph+CML-淋巴样母细胞危象)(Pegoraro et.al JNCI，1983)由N.Donato博士(NIH，Bethesda，MD)友情提供。细胞系在37℃，5％CO

原代成人Ph+ALL细胞由Luke F.Peterson博士(密歇根大学(UniversityofMichigan))友情提供，并从托马斯杰斐逊大学恶性血液病部门(Division ofHematological Malignancies of Thomas Jefferson University)获得。TKI抗性Ph+ALL样品(＃557)之前表征为携带T315I ABL1激酶结构域突变(Minieri et al.，2018)。原代Ph+ALL细胞在补充有SCF(40ng/mL)、Flt3L(30ng/mL)、IL3(10ng/mL)、IL-6(10ng/mL)和IL-7(10ng/mL；PeproTech)的StemSpan SFEM(Stem Cell Technology＃09650)中培养。来自健康供体的G-CSF动员的外周血CD34+原代细胞从托马斯杰斐逊大学骨髓移植部门获得，并且在补充有StemSpan CC100(Stem Cell Technologies＃＃02690)的StemSpan SFEM(StemCell Technology＃09650)中培养。

凋亡和细胞周期分析。通过膜联蛋白V染色测量凋亡：将100,000个细胞在室温(RT)下在50μL的包含1.5μLCy-5.5-膜联蛋白V(BD Bioscience＃559933)的膜联蛋白V结合缓冲液(10mM HEPES、140mM NaCl和2.5mM CaCl

针对细胞周期分析，将细胞与0.1％柠檬酸钠、0.1％Triton、50μg/mL碘化丙啶一起孵育5分钟，并且随后在BD FACS Celesta流式细胞仪上进行分析。

慢病毒的产生和细胞转导。针对CDK4/6的组成型沉默，赋予嘌呤霉素抗性并表达针对CDK6的shRNA(TRCN0000010082[82]，TRCN0000000486[86]，TRCN0000000488[88]，TRCN0000010473[73])或针对CDK4的shRNA(TRCN0000000363)的pLKO.1慢病毒载体从TheRNA Consortium，GE Dharmacon获得。混乱shRNA pLKO.1载体从Addgene(Addgene质粒＃1864)获得。针对慢病毒的产生，通过磷酸钙方法用pLKO.1质粒以及第二代慢病毒包装质粒pMD2.G(Addgene质粒12259)和psPAX2(Addgene质粒＃12260)瞬时转染293T细胞。24小时之后，收集感染性上清液并用于通过两个循环的旋转孵育(1000g，45分钟，37℃)转导Ph+ALL细胞，随后在37℃下孵育24小时。然后，用3μM嘌呤霉素筛选细胞72小时，并通过在Ficoll-Paque层(GE Healthcare，17544202)上离心来去除死细胞。然后将细胞培养96小时，之后通过流式细胞术评估凋亡和细胞周期。针对诱导型CDK6沉默，将靶向CDK6的shRNA-88克隆到Tet-pLKO-puro载体(Addgene质粒21915)的AgeI-EcoRI位点中。如上所述进行慢病毒的产生。慢病毒上清液通过超速离心浓缩，并通过三个循环的旋转孵育用于转导Ph+ALL细胞系。使用1μg/mL盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride)(RPI Corp.＃D43020-100.0)诱导shRNA。如(De Dominici et a.，2018)所述，将CDK6 cDNA克隆到pUltra-Chili慢病毒载体(Dr.Malcolm Moore；Addgene质粒＃48687)中。为了获得shRNA抗性CDK6 cDNA，将shRNA-88的靶位点通过PCR扩增用引入多个同义点突变的引物进行诱变(密码子88至94：acCgaTCgGgaGacAaaGTtG，大写字母对应于引入的突变)。将线性PCR产物自连接，转化到大肠杆菌(E.coli)中并测序。如上所述在Ph+ALL细胞中转导质粒。

RNA测序。BV173细胞以5×10

进行基因集富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis，GSEA)以评价在所得差异表达列表中的基因本体生物学过程(Gene Ontology Biological Process，GOBP)术语。DESeq2测试统计量被用作在预排序模式下执行GSEA的排序度量，具有零碱基均值或“NA”测试统计值的基因被过滤掉以避免向GSEA提供大量重复值。使用“加权”富集统计学进行GSEA预排序分析。对选定的基因进行cytoscape分析，以使用Reactome功能相互作用网络检查其网络图样。

蛋白质分析。计数细胞并在补充有5％β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中以10,000/μL的密度裂解细胞。裂解物在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(Biorad，＃4561095)上解析，并使用半干转印迹转移池(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜(Santa Cruz Biotechnology，＃sc-3718)上。然后将膜在5％脱脂奶粉/TBS-T中封闭，并用以下一抗孵育：CDK6(兔，CST＃13331)、CDK6(鼠，CST＃3136)、CDK4(兔，CST＃12790)、CDK4(兔，Bethyl Laboratories＃A304-224)、FOXM1(兔，Santa Cruz Biotechnology＃sc-502)、磷酸化-RB Ser-780(兔，CST＃9307)、磷酸化-RB Ser-897-811(兔，CST＃9308)、β-肌动蛋白(小鼠，CST＃3700)。

将膜与1∶10,000 HRP缀合的二抗(Thermo Fisher Scientific，抗小鼠-HRP＃31430，或抗兔-HRP＃31460)一起孵育，并使用SuperSignal West Pico(Thermo FisherScientific＃34580)或Dura(Thermo Fisher Scientific＃34075)化学发光底物通过化学发光反应使信号可视化。当使用不同的抗体探测相同的硝酸纤维素膜时，通过在室温下与0.5％叠氮化钠孵育10分钟或者通过在62mM Tris-HCL pH 6.8、2％SDS、0.7％β-巯基乙醇中在50℃下剥离20分钟去除先前的信号。针对受试PROTAC的降解常数(DC

蛋白质组学分析。将15×10

使用MaxQuant 1.6.3.3(Cox and Mann，2008)鉴定肽序列。使用完全胰蛋白酶特异性(具有最多两个错过的切割、Cys的静态甲酰胺甲基化以及Met的可变氧化和蛋白质N末端乙酰化)针对UniProt人蛋白质数据库(10/01/2018)检索MS/MS谱。通过无标记定量(label-free quantitation，LFQ)对蛋白质进行定量。“运行之间的匹配”特征用于帮助跨实验转移鉴定，以使缺失值最小化。针对反向序列数据库以<1％的错误发现率(falsediscovery rate，FDR)过滤肽和蛋白质鉴定。缺失的LFQ蛋白质值用数据集最小值除以2来输入。通过要求在任一样品的所有三个重复中用至少2个独特的肽来鉴定蛋白质，对蛋白质列表进行过滤以去除低置信度的鉴定。使用这些标准对总共3,682个蛋白质组群进行了定量。如果绝对倍数变化＞2且学生t检验p值＜0.05，则认为两个样品之间的蛋白质水平有显著差异。

动物。小鼠实验是根据托马斯杰斐逊大学动物保护和使用委员会机构(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC，协议号00012)的指南进行的。针对白血病生成测定，将2×10

在外周血或骨髓中白血病细胞的百分比通过使用BD FACS Celesta流式细胞仪检测人CD19(通过来自BD Bioscience的抗体＃555415)或CD10抗原(通过来自BD Bioscience的抗体＃555375)进行评估。

PROTAC在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性。将受试和对照化合物以0.5μM与0.5mg/mL肝微粒体和NADPH再生系统(辅因子溶液)在磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中孵育。在0、5、15、30和45分钟时，取等分试样，并用包含内标的乙腈溶液淬灭反应。作为对照，还检查了缺乏辅因子溶液的样品。在实验结束时，通过液相色谱与质谱(LC-MS/MS)分析样品。内在性清除率(intrinsic clearance，Clint)通过非线性回归由一阶消除常数来确定。该分析由Alliance Pharma(Malvem，PA)执行。

PROTAC YX-2-107在CD-1小鼠中的药动学分析。在18只CD-1小鼠(n＝3只小鼠/时间点)中进行了1-臂PK研究。向动物腹膜内(intraperitoneally，IP)注射单剂量(10mg/kg)的溶解在10％DMSO、10％Solutol、80％PBS的溶液中的PROTAC YX-2-107。在IP注射之后0.25、0.5、1、2、4和6小时时收集血浆样品，并通过LC-MS/MS进行分析。PROTAC YX-2-107的浓度通过线性回归分析计算。该分析由Alliance Pharma(Malvern，PA)执行。

在PROTAC YX-2-107处理的BV173细胞中的CDK6 DC50测定。通过对用多种剂量PROTAC处理的细胞中CDK6进行免疫印迹分析评估CDK6的半数最大降解(DC50)的PROTACYX-2-107浓度。CDK6水平使用ImageJ软件通过密度分析进行测量，并通过β-肌动蛋白水平进行归一化。DC

定量PCR分析。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，Limburg，TheNetherlands)从未处理、帕博西尼处理(500ng/ml；48小时)或强力霉素处理(2.5μg/ml；48小时)的shCDK6-88 BV173细胞中分离RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)进行逆转录(2μg)。使用以下引物使用QuantStudio 12k Flex(Life Technologies)仪器和QuantStudio 12K Flex软件进行定量PCR：

HDCA1 FW，5’-CATGCTGTGAATTGGGCTG-3’(SEQ ID NO：1)；RV，5’-CCCTCTGGTGATACTTTAGCAGT-3’(SEQ ID NO：2)；SMARCD2 FW，5’-GCATGCTGCCCGGACC-3’(SEQID NO：3)；RV，5’-ACATGCCAGGTCGCTGGT-3’(SEQ ID NO：4)；JAK1 FW，5’-TCCGCGACGTGGAGAATATC-3’(SEQ ID NO： 5)，RV，5’-TGGTGTGGTAAGGACATCGC-3’(SEQ IDNO：6)；HADHA FW，5’-TCAACATGTTAGCCGCTTGC-3’(SEQ ID NO： 7)；RV，5’-ATGGCAACCTCAAGTCCTCC-3’(SEQ ID NO：8)；ACSL1FW，5’-GGAACTACAGGCAACCCCAA-3’(SEQID NO：9)；RV，5’-TCATCTGGGCAAGGATTGACT-3’(SEQ ID NO：10)；GOT2 FW，5’-TTGAAGAGTGGCCGGTTTGT-3’(SEQ ID NO：11)；RV，5’-TGCAGAAAACTGGCTCCGAT-3’(SEQ IDNO：12)；NFATC2 FW，5’-AGACGAGCTTGACTTCTCCA-3’(SEQ ID NO：13)；RV，5’-TGCATTCGGCTCTTCTTCGT-3’(SEQ ID NO：14)；HACD1 FW，5’-TGCCTTGCTTGAGATAGTTCAC-3’(SEQ ID NO：15)；RV，5’-TCACTTGGACCCCAGTCACA-3’(SEQ ID NO：16).

统计学分析。表示为三个实验的平均值±s.d的数据通过未配对的双尾学生t检验分析统计学显著性。P＜0.05被认为是统计学显著的。使用GraphPad Prism 6.0软件生成针对小鼠生存实验的Kaplan-Meier图。通过对数秩检验评估生存差异。通过Pearson检验分析mRNA水平相关性，并通过学生t分布计算显著性。

C.合成和表征

方案8.产生AC-1-212和AC-1-277的合成顺序概述

AC-1-212和AC-1-277的一般合成：将帕博西尼-接头(1当量)、Celebron-配体酸(1当量)、EDCI(2.0当量)、HOBT(2.0当量)、DIPEA(4当量)填充50mL圆底烧瓶并且溶解在DMF中以制备12mmol溶液。将反应在室温搅拌过夜，然后用15mL水稀释。分离各相，并将水层用DCM萃取3次。将有机级分合并，然后用水(20mL)洗涤3次，用Na

AC-1-212：N-(2-(4-(6-((6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-基)乙基)-2-(((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺用帕博西尼-接头X1(93mg，0.20mmol)、Celebron-配体酸X(69mg，0.20mm0l)、EDCI(73mg，0.40mmol)、HOBT(58mg，0.40mmol)和DIPEA(0.13mL，0.80mmol)按照一般合成进行制备，得到60mg(39％)的作为黄色固体的AC-1-212：CDCl

LCMS m/z[M+H

AC-1-277：N-(6-(4-(6-((6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-基)己基)-2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-7，3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺用帕博西尼-接头X2(65mg，0.12mmol)、Celebron-配体酸X(43mg，0.12mmol))、EDCI(45mg，2.4mmol)、HOBT(36mg，0.24mmol)和DIPEA(0.08mL，0.47mmol)按照一般合成进行制备，得到46mg(45％)的作为黄色固体的AC-1-277：

LCMS m/z[M+H

C.结果

在免疫缺陷型小鼠中，CDK6沉默比CDK4/6酶促抑制更有效地抑制Ph+ALL。增殖、CDK4/6依赖性RB磷酸化和FOXM1(Sherr et al.，2016；Anders et al.，2011)在CDK6沉默的Ph+ALL细胞系中显著降低，而CDK4沉默则没有这样的效应(De Dominici et al.，2018)。然而，尚不清楚CDK6沉默是否抑制小鼠中的Ph+ALL，以及这些效应是否与CDK4/6酶促抑制相当或优于CDK4/6酶促抑制。

确定在Ph+BV173细胞中的CDK6沉默诱导凋亡细胞频率显著提高，这在用CDK4/6抑制剂帕博西尼处理之后或在CDK4沉默之后未检测到(图10A至10C)。为了进一步评估由CDK6沉默诱导的凋亡是否具有特异性，将shCDK6-88克隆至四环素调节的Tet-pLKO-puro载体中并转导至BV173细胞中，随后用经改造以防止结合shRNA的表达CDK6 cDNA的载体或用空载体(EV)转导。如图10D所示，shRNA抗性形式的CDK6的表达挽救了在BV173细胞中由CDK6敲低诱导的凋亡，而用帕博西尼的处理在两种细胞系中均具有适度但相似的作用。在这些细胞中，shRNA抗性CDK6的表达还挽救了DOX诱导的CDK6和磷酸化-RB水平以及S期细胞数目的降低(图11A和11B)。总之，这些数据表明激酶非依赖性效应可涉及由CDK6沉默诱导的凋亡。

由于CDK6被报道通过增强p53拈抗剂的转录来调节p53的活性(Bellutti et al.，2018)，因此评估了p53在由CDK6沉默诱导的凋亡中具有的任何作用。p53表达的下调仅适度地(即使显著)挽救了由CDK6沉默诱导的凋亡(图12A)，表明在Ph+ALL细胞中由CDK6沉默诱导的凋亡主要地为p53非依赖性的。

为了评估离体的由CDK6沉默诱导的凋亡的增强是否可与体内Ph+BV173细胞生长降低相关，向NSG小鼠注射了DOX诱导型shCDK6-BV173细胞，并置于未处理或在细胞注射之后7天开始用在饮用水中的DOX处理。另一组小鼠用在食物中给予的帕博西尼进行处理，以直接比较CDK6沉默与CDK6酶促抑制的作用。4周之后终止处理，并在两周之后通过流式细胞术分析外周血以评估CD19+白血病细胞的百分比。这样的细胞在DOX处理的小鼠中未检出或几乎未检出，而其在帕博西尼处理的动物中占总白细胞的约10％(范围：2.4至16％)(图13)，表明白血病载量被CDK6沉默显著抑制。这些关于白血病负荷的数据与DOX处理小鼠与帕博西尼处理小鼠的显著不同的生存相关。

与未处理的小鼠相比(中位生存＝42.5天)，帕博西尼处理的鼠表现出生存的显著延长(中位生存＝70.5天，p＜0.001)。然而，用DOX处理以使CDK6表达沉默甚至更有效地导致比由帕博西尼处理诱导的生存更长的生存(中位生存＝86天，p＝0.0002；图I0E)。因此，CDK6的选择性沉默相对于非选择性CDK4/6酶抑制剂(例如帕博西尼)提供了优势。

通过CDK6沉默诱导的生长抑制与特定的基因表达标签相关。与帕博西尼处理的注射shCDK6-BV173细胞的NSG小鼠相比，DOX处理的NSG小鼠存活时间更长，表明激酶非依赖性效应参与了通过CDK6沉默诱导的更显著的白血病抑制。为了寻找可能解释这些效应的激酶非依赖性通路，比较了帕博西尼处理和CDK6沉默的(DOX处理；48小时)BV173细胞的基因表达谱。值得注意的是，CDK4的选择性沉默对Ph+ALL细胞系的增殖和磷酸化RB水平没有作用(De Dominici et a.，2018)，表明抑制CDK4酶促活性对帕博西尼的作用没有贡献。

正如所料，大多数基因被CDK6酶促抑制和沉默类似地调控；然而，与帕博西尼处理的细胞相比，80个基因在CDK6沉默的细胞中显示至少1.5倍的表达变化(图14A)。在CDK6沉默选择性调控的基因中，下调的那些基因中有数个(图14B和14C)可能功能性地与CDK6沉默的BV173细胞的凋亡敏感性有关。特别地，JAK1和NFATC2的表达降低可影响促生存信号传导，而SMARCD2和HDAC1的较低水平可影响染色质重建，这可能影响促生存基因的转录调控。

如HACD1、ACSL1和HADHA基因的表达降低所提示的，CDK6沉默也可影响脂肪酸代谢。这些基因编码参与长链脂肪酸延伸(HACD1)、通过合成脂肪酸酰基辅酶A酯的脂肪酸活化(ACSL1)和线粒体脂肪酸β氧化(HADHA)的酶。

最后，基于编码线粒体天冬氨酸转氨酶(苹果酸-天冬氨酸穿梭的组分，其用于NADH从细胞溶胶转移到线粒体中)的GOT2基因的表达降低，CDK6沉默也可影响氧化磷酸化。

为了进一步研究“CDK6沉默标签”是否可能具有临床显著性，在122个Ph+ALL样品的数据集中分析了CDK6及其假定靶标的mRNA水平；观察到CDK6和HDAC1表达之间显著正相关(P＝0.00000012)，并且CDK6和SMARCD2表达之间显著相关(P＝0.005)(图14D)。CDK6的表达与其余的假定靶标没有发现显著的相关性。

总之，这些基因表达的变化，特别是潜在损害染色质重建的这些可解释CDK6沉默的Ph+ALL细胞经历凋亡的倾向。

选择性降解CDK6的有效CDK4/6靶向PROTAC的开发。基于图10所示的离体和体内数据，在利用Ph+ALL的CDK6依赖性方面，选择性降解CDK6的化合物预期比CDK4/6酶抑制剂更有效且副作用更少。

不希望受到任何理论的约束，认为与E3连接酶募集分子相连的有效CDK4/6激酶抑制剂可与CDK6结合并降解该蛋白，这可能提供比目前用小分子抑制剂可能的更加特异性且持久的抑制。因此，靶向CDK4/6的PROTAC是在与CDK6复合的帕博西尼的X射线晶体结构(PDBid：2EUF和5L2T)(Lu et al.，2006；Chen et al.，2016)的指导下设计的。帕博西尼的哌嗪尾从活性位点(ATP袋)向溶剂突出，表明它可耐受接头附着到多种E3连接酶募集分子(Luet a1.，2006)。首先，用多种接头合成了几种帕博西尼衍生物；图15A中示出了一个小的代表性集合。发现这些缀合物的激酶抑制活性变化显著，这并不是基于其中与接头缀合的哌嗪尾(图15A)将进入溶剂的区域中的晶体结构显示的看似大体积溶剂暴露空间所预测的(Lu et al.，2006)。值得注意的是，与AC-1-079相比，YX-2-115(45)中的单个甲基变化导致激酶活性抑制降低100倍(图15A)。因此，必须将每个分子作为一个整体来考虑并进行相应的优化，而不是试图优化单个组分来指导最终化合物的组装，因为这种方法不一定会产生最佳的PROTAC。图15B示出了具有不同接头和VHL或Cereblon募集配体的几种潜在的PROTAC(Winter et al.，2015；Buckley et al.，2012)。这些化合物代表当在体外测试抑制周期蛋白D3/CDK6或周期蛋白D1/CDK4依赖性RB磷酸化的能力时缺乏有效激酶抑制的衍生物。相比之下，基于CDK6条带强度的密度测定，Cereblon募集PROTAC YX-2-107被鉴定为体外CDK4或CDK6激酶抑制剂的有效抑制剂(IC

早在YX-2-107处理之后一小时，就检测到Ph+BV173细胞中CDK6表达下调，并且在4小时时CDK6水平显著降低(图17A)。用蛋白酶体抑制剂MG132处理使CDK6的表达恢复到未处理的细胞的水平(图17B)，表明在YX-2-107处理的Ph+ALL细胞中，CDK6通过依赖于Cereblon的泛素化被靶向蛋白酶体降解。用帕博西尼或沙利度胺联合处理以分别阻断PROTAC YX-2-107与CDK6或Cereblon的结合，阻止了CDK6的下调，表明通过YX-2-107诱导的CDK6降解需要形成由CDK6+PROTAC+Cereblon组成的三元复合物(图17C)。CDK6在PROTAC YX-2-107处理的BV173细胞中的表达在至少6小时内非常低，在从培养基中洗涤PROTAC之后12小时恢复到未处理的细胞的水平(图17D)，这与该PROTAC比CDK4/6酶抑制剂帕博西尼具有更持久的抑制作用一致。

YX-2-107诱导的蛋白质降解具有高度特异性，因为基于蛋白质LFQ强度，与对照(DMSO处理的)细胞相比，YX-2-107处理4小时的BV173细胞的蛋白质组学分析揭示，在3682个检测的蛋白质中，仅CDK6显著下调(图17E)。高迁移率族核小体结合域1蛋白(HighMobility Group Nucleosome Binding Domain 1protein)HMGN1在YX-2-107处理的细胞中的表达显著高于在对照BV173细胞中的表达(图17E)，这可能反映了其蛋白质水平在CDK6降解之后发生继发变化。

由于CDK4仅定位于Ph+ALL细胞的细胞质中，而CDK6主要是细胞核的(De Dominiciet al.，2018)，有人问这种差异定位是否可以解释Cereblon优先降解CDK6，据报道Cereblon也定位于细胞核中(Wada et al.，2016)。因此，用PROTAC YX-2-107处理表达核定位的CDK4蛋白的BV173衍生系(NLS-CDK4-BV173)(De Dominici et al.，2018)4小时，然后通过western印迹评估NLS-CDK4的水平。如图27所示，异位表达的核NLS-CDK4没有被PROTACYX-2-107降解，这强烈表明CDK4或CDK6的核定位(内源性或工程化)并不决定它们被PROTACYX-2-107靶向。根据这些结果，结论为：在Ph+ALL细胞中，与CDK4相反，CDK6主要定位于细胞核，这并不能解释CDK6相对于CDK4优先被PROTAC YX-2-107降解的原因。

除了含有VHL或Cereblon配体的PROTAC外，还合成了PROTAC YX-2-233(图18)，它是与源自RG7112的MDM2招募配体缀合的帕博西尼衍生物(Tovar et al，2013)。这种PROTAC有效抑制Ph+ALL细胞的S期和RB磷酸化(图18B和18C)；然而，它降解了CDK4和CDK6(图18C)，表明由PROTAC募集的E3连接酶可影响靶向的蛋白质的选择性降解。

PROTAC YX-2-107在Ph+ALL细胞系和正常造血祖细胞(HPC)中的作用。在Ph+ALL细胞系中，离体评估CDK6降解性PROTAC的分子和生物学作用。用YX-2-107处理抑制了Ph+BV173和SUP-B15细胞中的S期进入、RB磷酸化和FOXM1表达(图19A-19D)。一项发现是帕博西尼处理诱导CDK4，尤其是CDK6的表达增加；相比之下，在YX-2-107处理的细胞中，CDK4的表达没有增加，而CDK6的水平显著降低(图19B和19C)。仅由Cereblon E3连接酶募集配体组成的对照化合物CRBN E3胺(CRBN-L；图15D)没有作用(图19A-19D)。

在YX-2-107处理的母细胞中也观察到CDK6的选择性降解和S期的抑制，这些母细胞来自具有新发Ph+ALL的患者(样品＃004)(图20E)。由于通过流式细胞术分析在该原代Ph+ALL样品中S期细胞仅为6.5％，因此用EdU脉冲标记独立评价PROTAC YX-2-107的作用。该测定揭示，EdU阳性细胞在未经处理的样品中为4.8％，在经帕博西尼处理的细胞中为0.5％，在经1或2μM YX-2-107处理的细胞中分别为1.6％和0.7％，证实了流式细胞术分析的结果。

在正常的CD34+造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitorcell，HSPC)中，YX-2-107处理24小时也抑制了CDK6的表达，而对CDK4水平没有影响；然而，这种处理并没有像在BV173细胞中那样有效地抑制S期或降低磷酸化RB(图20F-20H)。相比之下，用帕博西尼处理对CDK4/6酶促活性的药理学抑制在BV173和正常CD34+HSPC中具有相似的生长抑制作用(图20H)。这些发现表明，与Ph+ALL细胞不同，正常的CD34+HSPC依赖于CDK4和CDK6二者来生长。该假设通过以下观察证实：单独沉默CDK4不降低CD34+S期细胞的百分比，而选择性的CDK6沉默与用双重CDK4/6抑制剂帕博西尼处理相比仅产生部分效果，后者反而诱导CD34+S期细胞的完全抑制(图20I)。

在优化过程中，对另外的PROTAC进行评估，以建立结构-活性关系(structure-activity relationship，SAR)。例如，在BV173细胞中测试PROTAC AC-2-011、AC-1-212和AC-1-277(图21)。这三种PROTAC全部都抑制RB磷酸化并显著降低S期细胞的百分比，但AC-12-011显示没有作为有效的CDK6降解剂发挥作用，因为它仅在高浓度下降解CDK6和CDK4(图21A)。相比之下，AC-1-212，尤其是AC-1-277选择性地且有效地降解CDK6，并且以与帕博西尼相似或更高的效力抑制BV173 S期细胞的数量(图21B)。

PROTAC YX-2-107在小鼠中具有生物可利用性，并且在抑制Ph+ALL增殖方面具有药理学活性。为了评估CDK6选择性PROTAC作为体内药物的潜在用途，首先评估了YX-2-107在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性，并将其与帕博西尼和4-羟基-沙利度胺(AC-1-158)进行比较，使用咪达唑仑作为阳性对照(图22A)。预计半衰期大于20-30分钟的化合物在血浆中具有合理缓慢的清除和可接受的药代动力学暴露。与小鼠肝微粒体孵育后YX-2-107具有良好的代谢稳定性，显示35分钟的半衰期，与帕博西尼的表现为56分钟的半衰期相当。阳性对照化合物咪达唑仑(稳定性差)的半衰期仅有约2分钟。另一些衍生物显示差(即AC-1-027(图15B)，其半衰期仅为2分钟)或中等的稳定性(即AC-1-212(图21)，半衰期为10分钟)，强调需要在体内评价之前对这些化合物进行优化。接下来在小鼠药代动力学(PK)研究中以10mg/kg IP剂量评价YX-2-107(图22B)。血浆水平显示C

为了评估PROTAC YX-2-107在体内是否具有药理学活性，在Ph+ALL异种移植物中进行短期处理后测试其效果。在该实验中，对小鼠(n＝9；三只/组)注射原代Ph+ALL细胞，监测外周血中白血病细胞(CD19+/CD10+)的存在，并且当这些细胞＞50％时用帕博西尼、YX-2-107或用仅载剂处理(连续三天)。随后，纯化骨髓细胞(＞90％CD19+/CD10+)并评估细胞周期活性、磷酸化RB、FOXM1和CDK4/CDK6水平。帕博西尼和YX-2-107在抑制S期细胞百分比方面(图22C)，和在降低磷酸化RB和FOXM1的表达方面(图22D)无法区别。然而，用PROTACYX-2-107处理降低了CDK6水平，并且在较小程度上降低了CDK4水平，而相反地，帕博西尼上调了CDK6的表达(图22E)。用PROTAC AC-1-212也进行了类似的初步研究。用这种PROTAC处理抑制了原代Ph+ALL S期细胞的百分比、CDK4/6调控的p-RB的表达，并在较小程度上抑制FOXM1，并诱导CDK6的选择性降解。然而，AC-1-212的效果不如YX-2-107，并且其效果不是剂量依赖性的(图23)，这可能反映了其在小鼠肝微粒体中的次最佳药代动力学暴露(10分钟半衰期)。

CDK6降解剂PROTAC YX-2-107在Ph+ALL的患者源性异种移植物(PDX)中的作用。在YX-2-107的这些令人鼓舞的体内数据的基础上，进一步研究了YX-2-107及其在Ph+白血病模型中的作用。首先，评估了YX-2-107的体内处理是否对正常造血作用产生显著毒性。为此，将6只2个月大的C57BL/6j小鼠用YX-2-107进行处理，每日剂量为150mg/kg，连续进行10天。在处理过程中，小鼠没有表现出痛苦或体重减轻的迹象。终止处理之后4天，处死小鼠，纯化外周血和骨髓细胞。骨髓细胞的流式细胞术分析显示干细胞与祖细胞的百分比和B细胞前体的百分比没有显著变化。同样，除了血小板和网织红细胞的数量中等增加外，外周血细胞计数显示YX-2-107对大多数细胞亚群没有作用(图24)。

由于正常小鼠对YX-2-107的这样的相对长时间的处理耐受良好，比较了帕博西尼和YX-2-107对NSG小鼠的外周血白血病载量(CD19+CD10+细胞％)的作用，这些小鼠注射了来自两名患者的原代Ph+ALL细胞，然后用帕博西尼(150mg/kg，管饲)或YX-2-107(125mg/kg或150mg/kg，i.p；一次/天；或两次/天，一半剂量/注射)处理(连续10天)。如图25所示，在抑制外周血白血病负荷方面用YX-2-107处理与帕博西尼一样有效。令人感兴趣的是，用YX-2-107进行两次/天的处理显示比单剂量/天的处理方案更有效，至少在注射了ALL样品＃1222的小鼠中是这样，这与血浆暴露的药代动力学相一致，其中化合物在大约4小时后被清除。然而，中止使用任一药物的处理后，白血病生长迅速恢复。

最后，对NRG-SGM3小鼠(其在骨髓生态位中产生人细胞因子SCF、GM-CSF和IL-3)的外周血白血病载量(CD19+CD10+细胞％)进行评估，该小鼠注射了TKI抗性(BCR-ABL1T315I)原代Ph+ALL样品，并用帕博西尼(饮食中150mg/kg)或YX-2-107(25mg或50mg/kg，两次/天，IP)处理(连续20天)。如图26所示，在处理12或20天之后，YX-2-107显示比帕博西尼显著更有效地抑制这种TKI抗性Ph+ALL的体内生长。

D.讨论

在本公开内容中，开发了由针对CDK4/6的高亲和力小分子配体组成的蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)，并且对于E3泛素连接酶Cereblon，通过不同结构和/或尺寸的接头连接。在Ph+ALL细胞中，大多数募集Cereblon的PROTAC能够相对于CDK4选择性降解CDK6。相比之下，使用MDM2配体RG7112作为E3泛素连接酶招募剂(Tovar et al，2013)的PROTAC YX-2-233以同样的效率降解CDK4和CDK6。Cereblon募集PROTAC对CDK6的选择性降解可以通过三元复合物的形成来解释，三元复合物产生新的蛋白质-蛋白质接触，这允许相对于CDK4对CDK6进行选择性赖氨酸泛素化，然后是26S蛋白酶体降解。

本公开内容与最近一项研究的发现一致，该研究表明，通过CDK4/6靶向的Cereblon募集PROTAC在活细胞中与CDK6和Cereblon快速形成三元复合物，但不与CDK4和Cereblon形成三元复合物(Brand et al.，2019)。CDK6的选择性降解剂是Ph+ALL中有吸引力的治疗剂，因为Ph+ALL细胞的生长依赖于CDK6的表达，而CDK4的功能是不必要的(DeDominici et al.，2018)。此外，CDK6具有激酶非依赖性生长促进作用(Fujimoto et al.，2007；Kollman et al.，2013；Scheicher et al.，2015；Buss et al.，2012；Handschick etal.，2014；Uras et al.，2019；Belluti et al.，2018)，这可在治疗上被诱导CDK6降解的药物而不会仅被CDK6激酶活性的选择性抑制剂利用。

事实上，CDK6沉默的Ph+ALL细胞比帕博西尼处理的对应细胞更容易凋亡，并且在NSG小鼠中表现出更慢的疾病进展(图10)，可能是由于参与细胞存活、染色质重建和线粒体能量产生代谢通路的基因的表达降低。令人感兴趣的是，CDK6和HDAC1的表达在122例Ph+ALL患者样品的数据集中高度相关(图14D)，表明CDK6-HDAC1通路可以用于CDK6沉默的Ph+ALL细胞的生长抑制/凋亡。同样值得注意的是，据报道，HDAC1的遗传或药理学抑制诱导数个B-ALL细胞系的凋亡，尽管Ph+细胞系不在受测细胞系之列(Stubbs et al.，2015)。总之，CDK6沉默的Ph+细胞的这些特征支持CDK6降解剂可以是比CDK4/6酶抑制剂更有效的治疗剂的观点。

在本发明的CDK6降解性PROTAC中，一种称为YX-2-107的化合物被详细研究。除了它的激酶依赖性作用(抑制磷酸化RB和FOXM1的表达和S期)外，这种PROTAC还能够促进Ph+ALL细胞中CDK6相对于CDK4的优先降解。在依赖于CDK4和CDK6两者的表达/活性以增殖的正常CD34+人造血祖细胞中(图20I)，用PROTAC YX-2-107处理诱导CDK6的选择性降解，但不显著抑制这些细胞的S期(图20F和20H)，意味着在临床上，选择性CDK6降解剂对正常造血细胞的毒性比CDK4/6双重酶抑制剂更低。在这方面，在用双重CDK4/6抑制剂帕博西尼或瑞博西尼治疗的雌激素受体(ER)+乳腺癌患者中，中性粒细胞减少是最常见的不良事件(60-70％)(Turner et al.，2018；Im et al.，2019)。这种不良事件可能与急性白血病患者临床上相关，在这些患者中，由于白血病细胞的骨髓替代，正常白细胞计数通常低，这强调了使用选择性CDK6抑制剂以保护正常造血祖细胞的重要性。

与帕博西尼类似，当在小鼠肝微粒体中孵育时YX-2-107表现出相对较长的半衰期，预期这与有效的体内活性相关。然而，在小鼠PK研究(图22B)中，当IP施用时，YX-2-107的半衰期为1小时，表明PK的进一步改善是必要的。

短期处理具有进展性Ph+ALL的NSG小鼠足以显著抑制骨髓中S期细胞的比例，显著抑制CDK4/6底物磷酸化RB和FOXM1的表达，并诱导CDK6相对于CDK4优先降解。对注射新发或TKI抗性原发性Ph+ALL的NSG小鼠进行长期(2-3周)处理诱导显著抑制了外周血白血病载量，这与用帕博西尼处理诱导的相当或甚至更好。在表达人细胞因子的NRG小鼠中，在抑制TKI抗性Ph+ALL的生长方面PROTAC YX-2-107也同样有效或优于帕博西尼。这个发现表明，无论是对TKI的药理学抗性，还是暴露于人微环境中存在的细胞因子，都不会损害基于PROTAC的CDK6降解剂的治疗效果。令人感兴趣的是，经连续10天高剂量(150mg/Kg)YX-2-107处理的正常小鼠在正常造血祖细胞和成熟细胞中没有表现出显著变化(图24)，这与离体发现一致，显示对YX-2-107处理的人CD34+细胞的S期没有显著影响(图20H)。

这些体内效应可代表靶向展现出激酶依赖性和非依赖性作用的致癌蛋白的PROTAC的治疗效力的首次证明。YX-2-107可能不具备最佳的体外、离体和体内特性以取代现有的CDK4/6酶抑制剂；然而，PROTACYX-2-107的衍生物已经产生，它们在抑制S期和诱导CDK6降解方面更高效或具有更好的代谢稳定性。进一步的开发有望产生第二代PROTAC，其结合优越的离体活性(抑制CDK6调控的S期；CDK6降解)与改善的药代动力学特性，这可使这些药物成为具有新作用机制的真正的抗癌治疗剂。

***

根据本公开内容，可以在不进行过度实验的情况下作出和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤序列施加变化。更具体地，显而易见的是，某些化学上和生理学上都相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时可以实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改被视为在所附权利要求书限定的本公开内容的精神、范围和概念内。

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<140> 未知

<141> 2019-10-30

<150> US 62/755,038

<151> 2018-11-02

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

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