2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
文献发布时间:2023-06-19 13:48:08
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域,具体涉及一种2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)拉姆达(Lambda)变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术
拉姆达(Lambda)变异株是2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)众多变异株中重要的毒株之一,目前已扩散至多个国家,其传播能力显著增强、严重程度进一步增加,已被升级为“需要关注”的变异病毒。
通过对SARS-CoV-2的核酸序列多样性分析发现,与野生型SARS-CoV-2相比,Lambda变异株最重要的改变是棘突蛋白(Spike protein)编码基因的核苷酸序列中发生多重碱基突变,其典型的突变位点有:G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q、F490S等。通过对GISAID EpiCoV数据库中的SARS-CoV-2序列多样性分析发现,其突变位点G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S同时发生,可以特异性地鉴别Lambda变异株。因此,开发一种准确、快速的基因突变分型检测试剂及其检测方法用于鉴定SARS-CoV-2棘突蛋白编码基因中的G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变,可以实现Lambda变异株的快速筛查,满足疫情防控的迫切需要。
目前针对SARS-CoV-2的核酸检测主要是基于荧光定量PCR检测平台,其检测方便快速、成本低,且检测结果准确可靠;但是,由于Lambda变异株是野生型SARS-CoV-2发生基因突变所致,其突变类型存在单碱基序列的点突变,因此在荧光定量PCR检测平台开发这样的检测试剂存在较大难度,目前市面上还没有出现这样的检测产品。现有基因检测方法针对Lambda变异株的分型检测主要是二代测序(NGS),其检测周期长、成本高、操作繁琐,不能满足临床大量样本的快速筛查需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法,该试剂及方法等有助于弥补现有技术的不足,实现快速、准确且低成本的Lambda变异株的快速检测,为疫情防控提供强有力的技术支持。
为了达到上述目的,本发明提供了一种2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂,包括针对Lambda变异株的棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点分别设计的特异性引物和探针:
本发明中,探针两端标记的报告荧光染料基团可选自常规的基团种类。作为优选,探针P1的5'端标记有报告荧光染料FAM,3'端标记有报告荧光染料BHQ;探针P2的5'端标记有报告荧光染料VIC,3'端标记有报告荧光染料BHQ;探针P3的5'端标记有报告荧光染料CY5,3'端标记有报告荧光染料BHQ。
作为优选,所述检测试剂进一步包括一步法RT-PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品;
其中,所述一步法RT-PCR反应液包括10x缓冲液、Mg
所述阳性对照品为携带Lambda变异株的棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点的RNA假病毒标准品,所述阴性对照品为DEPC水。
作为优选,所述一步法RT-PCR反应液包括2x的10x缓冲液、200μM Mg
本发明还提供了一种试剂盒,其包含上述任一项技术方案所述的2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂。
本发明还提供了一种2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测方法,采用上述任一项技术方案所述的检测试剂进行检测,包括以下步骤:
以提取的待测核酸样本为模板,同时使用阳性对照品、阴性对照品以及针对Lambda变异株的棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S分别设计的特异性引物和探针进行多重荧光定量PCR检测;
检测结束后,根据实际情况分别调节FAM、VIC和CY5通道的基线的Start值、End值以及阈值线的值,基于分析结果,得到FAM、VIC和CY5通道的Ct值;
根据各通道的Ct值进行有效性判读以及结果判读。
作为优选,进行多重荧光定量PCR检测的反应体系的总体积为25μl,具体包括:
一步法PCR反应液12.5μl、1μM引物和探针混合液5μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl和DEPC水2.5μl。
作为优选,进行多重荧光定量PCR检测的反应条件为:
50℃逆转录25min;95℃预变性2min;95℃变性10s,60℃退火和延伸40s并收集荧光,40个循环。
作为优选,Start值设置为5~10、End值设置为10~15,同时调整阴性对照品的扩增曲线平直或低于阈值线。
作为优选,进行有效性判读时,判为有效的标准为:
。
作为优选,进行结果判读时,判为阳性或阴性的标准为:
阳性判读:FAM通道CT≤39为G75V和T76I突变阳性;VIC通道CT≤39为Δ246-252和D253N突变阳性;CY5通道CT≤39为L452Q和F490S突变阳性;若FAM、VIC和CY5通道同时满足CT≤39,则判断为Lambda变异株;
阴性判读:阳性判读以外的其它结果,均判为阴性。
作为优选,在进行多重荧光定量PCR检测前,还包括使用核酸提取试剂,提取待测核酸样本的步骤。
作为优选,所述检测方法对于Lambda变异株的棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S上的敏感性达到2拷贝/μl。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
本发明充分利用了荧光定量PCR平台检测速度快、灵敏度高和成本低的优势,开发了一种新型的简单、快速、准确且低成本的2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测方法,弥补现有技术(二代测序,NGS)在Lambda变异株分型检测方面耗时长、成本高、操作过程复杂的缺陷,满足临床样本的检测需求,为疫情防控提供强有力的技术支持。
在具体实现上,本发明基于Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点首创且独特设计了特异性的扩增引物和探针,该引物和探针特异性好、灵敏度高,能够实现高效、精准的鉴别2019新型冠状病毒Lambda变异株;结合一步法RT-PCR反应液和反应体系配方,由于该配方可直接使用RNA为模板,且PCR扩增效率高,因此可有效提高目标序列的检测灵敏度。
附图说明
图1为依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法对携带Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点的RNA假病毒模拟样本的特异性检测结果;
图2为依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法对携带六种突变位点的RNA假病毒模拟样本中的G75V和T76I进行的RNA定量分析;其中,A、B、C、D的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对2000、20、2、0拷贝/μl的RNA假病毒模拟样本进行扩增检测的结果;
图3为依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法对携带六种突变位点的RNA假病毒模拟样本中的Δ246-252和D253N进行的RNA定量分析;其中,A、B、C、D的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对2000、20、2、0拷贝/μl的RNA假病毒模拟样本进行扩增检测的结果;
图4为依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法对携带六种突变位点的RNA假病毒模拟样本中的L452Q和F490S进行的RNA定量分析;其中,A、B、C、D的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对2000、20、2、0拷贝/μl的RNA假病毒模拟样本进行扩增检测的结果。
具体实施方式
本发明基于荧光定量PCR检测平台,在ARMS引物设计方法的基础上,针对SARS-CoV-2的Lambda变异株的棘突蛋白编码基因的G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点,设计特异性的引物和探针,用于这些突变位点的鉴定,从而判断是否为Lambda变异株。
在一个具体实施方式中,本发明提供的利用实时荧光PCR检测2019新型冠状病毒拉姆达变异株的试剂包括针对Lambda变异株的棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点设计的特异性引物和探针、一步法RT-PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中:(1)一步法RT-PCR反应液包括2x的10x缓冲液、200μM Mg
在一个优选实施方式中,其引物和探针序列如表1所示,一步法RT-PCR反应液如表2所示。
表1引物和探针列表
表2一步法RT-PCR反应液配方
在另一个优选实施方式中,本发明提供的2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测方法包括以下步骤:
(1)使用商业化的核酸提取试剂,提取病毒核酸样本,然后直接用于PCR检测。
(2)以上述提取的核酸样本为模板,同时使用阳性对照品和阴性对照品,使用Lambda变异株棘突蛋白编码基因突变位点G75V,T76I,Δ246-252,D253N,L452Q和F490S特异性引物和探针进行多重荧光定量PCR检测,反应体系及程序如表3-4所示,检测仪器使用ABI 7500。
表3反应体系
*1:引物和探针按照原始浓度稀释,配制成一管混合液,其中各引物和探针的终浓度均为1μM。例如,初始浓度为100μM的引物或探针,配制成体积为1mL的引物探针混合液,其中引物和探针分别加10μL。
表4反应程序
(3)数据处理:反应结束后,根据实际情况分别调节FAM、VIC和CY5通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在5~10、End值建议设在10~15,同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis获得分析结果,得到FAM、VIC和CY5通道的Ct值。
(4)有效性判读:阴性和阳性对照品检测结果需满足表4要求,否则,本次实验结果无效。
表5阴性和阳性对照品
(5)结果判读:
阳性判读:FAM通道CT≤39,G75V和T76I突变阳性;VIC通道CT≤39,Δ246-252和D253N突变阳性;CY5通道CT≤39,L452Q和F490S突变阳性;若FAM、VIC和CY5通道同时满足CT≤39,则判断为Lambda变异株。
阴性判读:阳性判读以外的其它结果,均判为阴性。
首先,本发明采用Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V,T76I,Δ246-252,D253N,L452Q和F490S突变位点特异性的扩增引物和探针,该引物和探针序列为首创且设计独特,特异性好,灵敏度高,能够实现高效、精准的鉴别2019新型冠状病毒Lambda变异株。其次,本发明采用一步法RT-PCR反应液和反应体系配方,该配方可直接使用RNA为模板,且PCR扩增效率高,有效提高目标序列的检测灵敏度。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明,均为可从商业渠道购买得到的产品。
实施例1:引物和探针的设计
根据2019新型冠状病毒Lambda变异株棘突蛋白编码基因的突变位点分别设计特异性引物和探针,特异性引物和探针分别是针对G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点设计且能够区别未突变的2019新型冠状病毒和其他病毒株。其中,特异性引物和探针如下:
引物F1(SEQ ID NO.1):TGTCTCTGGGACCAATGTTATTAA
引物R1(SEQ ID NO.2):TGTTTTTGTGGTAATAAACACCCAA
探针P1(FAM-SEQ ID NO.3-BHQ):
FAM-CTAACATAATAAGAGGCTGGATT-BHQ
引物F2(SEQ ID NO.4):TACTTGCTTTACATAATTCTTCT
引物R2(SEQ ID NO.5):AACAATAGATTCTGTTGGTTGGACT
探针P2(VIC-SEQ ID NO.6-BHQ):
VIC-AACTGGAACCATTACAGATGCTGTA-BHQ
引物F3(SEQ ID NO.7):TGGTGGTAACTATAATTACCAGT
引物R3(SEQ ID NO.8):GACCATATGATTGTAAAGGAGAGT
探针P3(CY5-SEQ ID NO.9-BHQ):
CY5-CAACTGAAATCTATCAGGCCGT-BHQ
实施例2:2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸的检测
(1)材料、试剂、仪器:提取试剂使用菲鹏生物股份有限公司的磁珠法病毒核酸提取试剂,引物和探针(按照实施例1设计)委托上海捷瑞生物工程有限公司合成,RNA假病毒委托生工生物工程(上海)股份有限公司定制合成,荧光定量PCR仪器采用美国赛默飞ABI7500。
(2)标本准备:阳性标本为人感染2019新型冠状病毒拉姆达变异株后的灭活病毒咽拭子样本;阴性对照标本为健康人的咽拭子样本。以上样本均来源于某临床单位。
(3)核酸提取:使用商业化的磁珠法病毒核酸提取试剂盒,分别提取阴/阳性标本、阳性对照品、阴性对照品的核酸,然后用于PCR检测。
(4)PCR扩增:
a.引物和探针:按照实施例1设计并进行合成。
b.阳性对照:
本方法中的阳性对照为携带Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变的RNA假病毒,用DEPC水进行10
c.一步法RT-PCR反应平台:
PCR反应体系(总体积25μl)包括:一步法PCR反应液12.5μl、1μM引物和探针混合液5μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl和DEPC水2.5μl。
PCR扩增反应条件:50℃逆转录25min;95℃预变性2min;95℃变性10s,60℃退火和延伸40s(收集荧光),40个循环。
d.一步法RT-PCR反应:以上述提取的核酸样本为模板,同时使用阳性对照品和阴性对照品,使用Lambda变异株棘突蛋白编码基因突变位点G75V,T76I,Δ246-252,D253N,L452Q和F490S特异性引物和探针进行多重荧光定量PCR检测。
e.数据处理:反应结束后,根据实际情况分别调节FAM、VIC和CY5通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在5~10、End值建议设在10~15,同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis获得分析结果,得到FAM、VIC和CY5通道的Ct值。
f.有效性判读:阴性和阳性对照品检测结果需满足表4要求,否则,本次实验结果无效。
g.结果判读:
阳性判读:FAM通道CT≤39,G75V和T76I突变阳性;VIC通道CT≤39,Δ246-252和D253N突变阳性;CY5通道CT≤39,L452Q和F490S突变阳性;若FAM、VIC和CY5通道同时满足CT≤39,则判断为Lambda变异株;
阴性判读:阳性判读以外的其它结果,均判为阴性。
(5)特异性与灵敏性检测试验结果:
a.特异性检测结果:
将携带G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变的RNA假病毒模拟样本、甲型流感病毒的RNA假病毒模拟样本、乙型流感病毒的RNA假病毒模拟样本、支原体、人类基因组(293T细胞系来源)以及阴性样本(DEPC水)分别通过以上检测方法进行测试,特异性检测结果见图1。
如图1所示,依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法对Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点具有较好的特异性,对携带这六种突变位点的RNA假病毒模拟样本的检测结果显示阳性,对其它病原体、人类基因组和空白对照(以DEPC水为样本,经过核酸提取后得到的样本)等均无交叉反应。
b.灵敏性检测结果:
将携带这些突变位点的RNA假病毒模拟样本使用病毒核酸快速提取试剂进行核酸提取,然后使用Qubit 4.0仪器测定RNA浓度,按照定制的RNA假病毒产品说明书中的换算公式计算出样本的拷贝数,从而进行RNA定量分析,然后将其分别稀释至2000、20、2、0拷贝/μl,用本发明建立的荧光RT-PCR方法进行检测。灵敏性检测结果见图2A-2C。如图2(G75V和T76I)、图3(Δ246-252和D253N)、图4(L452Q和F490S)所示,结果表明荧光RT-PCR方法检测Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V、T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变位点的敏感性达到2拷贝/μl。
实施例3:临床样本的验证
(1)材料、试剂、仪器:参照实施例2。
(2)标本准备:收集10例临床上做核酸检测的疑似患者的灭活病毒咽拭子样本作为待测样本,同时收集1例已确诊感染2019新型冠状病毒拉姆达变异株的灭活病毒咽拭子样本作为阳性参考品,采集5例健康人的咽拭子样本作为阴性参考品。以上样本均来源于某临床单位。
(3)核酸提取:使用磁珠法病毒核酸提取试剂盒,分别提取待测样本、阳性参考品、阴性参考品的核酸,然后用于PCR检测。
(4)PCR扩增:参照实施例2。
(5)对比试剂:使用市售的2019新型冠状病毒核酸检测试剂(上海之江生物科技股份有限公司,新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法),25人份/盒,国械注准20203400057)作为对比试剂对以上临床样本的检测结果进行验证,同时通过二代测序方法(委托第三方医学检验单位做的新冠病毒测序项目)对检测结果做进一步验证。
(6)检测结果:如表6所示,本发明开发的检测试剂对临床样本的检测结果与市售的对比试剂和二代测序结果完全吻合。其中,二代测序方法所用检测周期约为两周,检测费用在3000-4000元/例;而本发明使用的检测方法所需检测周期在一天以内,检测费用低于50元/例。
由此说明,本发明开发的2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)拉姆达(Lambda)变异株核酸检测试剂及方法的检测效果准确可靠,既弥补了市售的2019新型冠状病毒对比试剂无法鉴别拉姆达变异株的缺陷,又避免了二代测序检测周期长、成本贵、操作复杂的缺陷。
表6临床样本检测结果
序列表
<110> 北京艾瑞克阳医疗科技有限公司
<120> 2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> G75V/T76I 正向引物(人工序列)
<400> 1
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> G75V/T76I 反向引物(人工序列)
<400> 2
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> G75V/T76I 探针P1(人工序列)
<400> 3
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> Δ246-252/D253N 正向引物(人工序列)
<400> 4
<210> 5
<211> 25
<212> RNA
<213> Δ246-252/D253N 反向引物(人工序列)
<400> 5
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> Δ246-252/D253N 探针P2(人工序列)
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> L452Q/F490S 正向引物(人工序列)
<400> 7
<210> 8
<211> 24
<212> RNA
<213> L452Q/F490S 反向引物(人工序列)
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> L452Q/F490S 探针P3(人工序列)
<400> 9
- 2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测试剂盒及检测方法
- 2019新型冠状病毒德尔塔变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法