一种生物样本保存系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说是涉及一种生物样本保存系统及其应用。

背景技术

对于分子诊断，最常用的临床检测方法是荧光定量PCR法。PCR (PolymeraseChain Reaction，聚合酶链式反应)是一种在生物体外放大扩增特定DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)片段的技术。PCR 在扩增DNA时一般需要经过高温解链反应、退火反应及延伸反应三个步骤，经过上述三个步骤后初始DNA分子数量增加一倍，此时为一个循环；倍增后的DNA分子继而成为下一个循环的模板，如此循环倍增下去，经过30-40个循环后，DNA分子数目将放大至初始值的近10

RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)反应，即反转录PCR，是PCR的一种，其需要RNA作为模板，RNA非常容易降解，常规的样本需要保存在高盐的裂解液中以防止样本中RNA模板的降解。后续RNA模板需要经过繁琐费时的提取过程才能获得。

因此，仍然迫切需要能够更简便的保存RNA，并使后续操作更简便的生物样本保存系统。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物样本保存系统，采集的样本可在常温保存72小时，且含有样本的保存液可直接作为模板进行后续的RT-PCR扩增，无需提取。

本发明的另外一个目的在于提供上述生物样本保存系统在保存生物样本中的应用。

本发明的另外一个目的在于提供一种使用上述生物样本保存系统保存生物样本的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种生物样本保存系统，其包括容器和容器中的保存液，所述容器包括容器本体和容器盖，所述容器本体的上端设置有开口，所述容器盖置于所述容器本体的开口上，所述容器本体内部横向或竖向设置有隔墙，所述隔墙将所述容器内空间分成互不连通的独立腔室；所述独立腔室内分别装有第一保存液和第二保存液；所述第一保存液为生物酶保存液，所述第二保存液为螯合剂保存液；或所述第一保存液为表面活性剂保存液，所述第二保存液为螯合剂保存液；或所述第一保存液为生物酶保存液，所述第二保存液为表面活性剂保存液。

在优选的实施方案中，当所述隔墙横向设置在容器内，所述容器可以横向拆分成上下两部分，所述隔墙由易撕材料构成。在优选的实施方案中，所述容器的上下两部分以螺纹或者卡扣连接。

在优选的实施方案中，所述容器本体和所述容器盖以螺纹或者卡扣连接。

在一个具体实施方案中，所述生物酶保存液包含缓冲液2～40mmol/L，可抑制蛋白活性的酶2～30mg/mL，金属离子1～20mmol/L，抑菌剂5～40％，任选地包含甘油20～100％；优选地，所述生物酶保存液包含缓冲液2～20 mmol/L，可抑制蛋白活性的酶2～20mg/mL，金属离子1～10mmol/L，抑菌剂5～25％，任选地包含甘油20～50％；更优选地，所述生物酶保存液包含缓冲液10～20mmol/L，可抑制蛋白活性的酶2～10mg/mL，金属离子 1～5mmol/L，抑菌剂5～15％，任选地包含甘油40～50％。

在一个具体实施方案中，所述表面活性剂保存液包含缓冲液5～100 mmol/L，可抑制蛋白活性的表面活性剂0.2～20％，抑菌剂5～40％，任选地包含核酸类物质5～150ug/mL；优选地，所述表面活性剂保存液包含缓冲液5～50mmol/L，可抑制蛋白活性的表面活性剂0.5～10％，抑菌剂 5～25％，任选地包含核酸类物质5～100ug/mL；更优选地，所述表面活性剂保存液包含缓冲液5～30mmol/L，可抑制蛋白活性的表面活性剂0.5～5％，抑菌剂5～15％，任选地包含核酸类物质5～30ug/mL。

在一个具体实施方案中，所述螯合剂保存液包含缓冲液5～100 mmol/L，螯合剂0.2～20mmol/L，核酸类物质5～150ug/mL，抑菌剂5～40％；优选地，所述螯合剂保存液包含缓冲液5～50mmol/L，螯合剂0.5～10 mmol/L，核酸类物质5～100ug/mL，抑菌剂5～25％；更优选地，所述螯合剂保存液包含缓冲液5～30mmol/L，螯合剂0.5～5mmol/L，核酸类物质 5～30ug/mL，抑菌剂5～15％。

所述可抑制蛋白活性的酶为任意可抑制核酸酶等蛋白活性的蛋白酶，如蛋白酶K、胰蛋白酶等；所述可抑制蛋白活性的表面活性剂为任意可抑制核酸酶等蛋白活性的表面活性剂，如SDS、Tritonx-100、Tween20、Brij58 等；所述金属离子为可激活蛋白酶的离子，如CaCl

在本发明中，第一保存液和第二保存液一起存放，会导致可抑制蛋白活性的酶如蛋白酶K和可抑制蛋白活性的表面活性剂如SDS不稳定，从而使得样本保存时间变短，本发明提供的生物样本保存系统包括两个互不连通的独立腔室，可以分开存放第一保存液和第二保存液，保持了蛋白酶 K和SDS的活性，从而延长了样本的保存时间。第一保存液的作用是灭菌、溶解与核酸结合的蛋白，使核酸脱离出来；第二保存液的作用是进一步溶解与核酸结合的蛋白，使核酸脱离出来，并保护核酸不被降解。

在优选的实施方案中，所述第一保存液包含Tris·HCl(PH7.5)2～20 mmol/L，蛋白酶K 2～20mg/mL，CaCl

在优选的实施方案中，所述第一保存液包含Tris·HCl(PH7.5)5～50 mmol/L，SDS0.5～10％，10％Tween20 0.5～10％，10％Proclin950 5～25％， pH为7～10；所述第二保存液包含Tris·HCl(PH8.0)5～50mmol/L， EDTA 0.5～10mmol/L，10％Proclin950 5～25％，tRNA 5～100ug/mL。

在优选的实施方案中，所述第一保存液包含Tris·HCl(PH7.5)2～20 mmol/L，蛋白酶K 2～20mg/mL，甘油20～50％，CaCl

在优选的实施方案中，所述易撕材料可以是聚丙烯薄膜、铝箔、易撕破的合成塑料薄膜。

在优选的实施方案中，所述容器带有识别系统，包括二维码、识别码。

在优选的实施方案中，所述容器与SBS标准板架配套。

根据本发明的另外一个目的，本发明提供了上述生物样本保存系统在保存生物样本中的应用。

根据本发明的另外一个目的，本发明提供了一种保存生物样本的方法，其包括：

(1)提供一种生物样本保存系统，其包括容器和容器中的保存液，所述容器包括容器本体和容器盖，所述容器本体的上端设置有开口，所述容器盖置于所述容器本体的开口上，所述容器本体内部竖向设置有隔墙，所述隔墙将所述容器内空间分成互不连通的独立腔室；所述独立腔室内分别装有第一保存液和第二保存液；所述第一保存液为生物酶保存液，所述第二保存液为螯合剂保存液；或所述第一保存液为表面活性剂保存液，所述第二保存液为螯合剂保存液；或所述第一保存液为生物酶保存液，所述第二保存液为表面活性剂保存液；

(2)用采样拭子采集生物样本后，浸入步骤1所述容器的第一保存液中浸润；

(3)将浸润后的采样拭子放入步骤1所述容器的第二保存液中保存。

根据本发明的另外一个目的，本发明提供了一种保存生物样本的方法，其包括：

(1)提供一种生物样本保存系统，其包括容器和容器中的保存液，所述容器包括容器本体和容器盖，所述容器本体的上端设置有开口，所述容器盖置于所述容器本体的开口上，所述容器本体内部横向设置有隔墙，所述隔墙将所述容器内空间分成互不连通的独立腔室；所述隔墙由易撕材料构成；所述独立腔室内分别装有第一保存液和第二保存液；所述第一保存液为生物酶保存液，所述第二保存液为螯合剂保存液；或所述第一保存液为表面活性剂保存液，所述第二保存液为螯合剂保存液；或所述第一保存液为生物酶保存液，所述第二保存液为表面活性剂保存液；

(2)用采样拭子采集生物样本后，浸入步骤1所述容器的第一保存液中浸润；

(3)用采样拭子捅破隔墙，使第一保存液和第二保存液混合；

(4)采样拭子在混合后的保存液中保存。

此外，本发明还提供了一种生物样本采集、保存套装，其包括本发明所述的容器和容器中的保存液。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种生物样本保存系统，能在一个装置内进行生物样本的灭活、核酸的释放及保护，能在72小时内有效保存样本中的核酸，使其不被降解，并且保存液可直接用于后续荧光定量 PCR的扩增，无需提取。

附图说明

图1表示本发明所述生物样本保存系统的第一种结构的正视图。

图2表示本发明所述生物样本保存系统的第二种结构的正视图。

图3表示本发明所述生物样本保存系统的第三种结构的正视图。

图4表示样本用A-1+A-2、B-1+B-2、C-1+C-2保存液采集后第0天 RNA的荧光定量PCR扩增所得的扩增曲线。

图5表示样本用A-1+A-2、B-1+B-2、C-1+C-2保存液采集后第1天 RNA的荧光定量PCR扩增所得的扩增曲线。

图6表示样本用A-1+A-2、B-1+B-2、C-1+C-2保存液采集后第2天 RNA的荧光定量PCR扩增所得的扩增曲线。

图7表示样本用A-1+A-2、B-1+B-2、C-1+C-2保存液采集后第3天 RNA的荧光定量PCR扩增所得的扩增曲线。

图8表示样本用D、E、F保存液采集后第0天RNA的荧光定量PCR 扩增所得的扩增曲线。

图9表示样本用D、E、F保存液采集后第1天RNA的荧光定量PCR 扩增所得的扩增曲线。

图10表示样本用D、E、F保存液采集后第2天RNA的荧光定量PCR 扩增所得的扩增曲线。

图11表示样本用D、E、F保存液采集后第3天RNA的荧光定量PCR 扩增所得的扩增曲线。

其中，各编号代表：1-第一管盖；2-第一保存管；3-第二保存管；4- 第一螺纹；5-第一保存液；6-第二保存液；7-隔离膜；8-第二螺纹；9-第三螺纹；10-第二管盖；11-第三保存管；12-隔断；13-第三管盖；14-第四保存管；15-第四螺纹。

应理解，附图仅出于示例目的来绘制，不应视为是对本发明的限制。

具体实施方式

在本发明中，除非另有明确说明，术语“连接”等应被广义地理解为包括固定连接和可拆卸连接，也可以是直接相连或通过中间元件间接相连。出于方便描述的目的，术语“上端”、“下端”、“底部”“竖向”和“横向”的使用仅仅是关于附图中示出的朝向的示例性描述，而不对本发明构成限制。

为更好地理解本发明，下文将结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但应理解的是，实施例和附图仅为对本发明进行示例性说明，而非意在限制本发明。下列实施例中未注明具体实验方法的，按照常规条件和方法或试剂制造商提供的方法。

实施例1本发明所述生物样本保存系统的第一种结构

本发明所述生物样本保存系统的第一种结构是带有管盖的微量离心管，如图1所示，包括第一保存管2、第二保存管3、第一管盖1，第一保存管2的上端设置有第三螺纹9，第一管盖1内部设置有与第三螺纹9 相匹配的螺纹(图中未示出)，第一保存管2与第一管盖1通过螺纹连接，第一保存管2的下端设置有第一螺纹4，第二保存管3的上端设置有第二螺纹8，第一螺纹4与第二螺纹8相匹配，第一保存管2和第二保存管3 通过螺纹连接；第一保存管2的底部设置有隔离膜7，隔离膜7由易撕材料组成。

隔离膜7没有撕破前，第一保存液5储存在第一保存管2中，第二保存液6储存在第二保存管3中，隔离膜7撕破后，第一保存液5和第二保存液6混合。

本发明所述生物样本保存系统的第一种结构的使用方法包括：用采样拭子采集生物样本后，浸入第一保存管2的第一保存液5中浸润；用采样拭子捅破隔离膜7，使第一保存液5和第二保存液6混合；采样拭子在混合后的保存液中保存。

实施例2本发明所述生物样本保存系统的第二种结构

本发明所述生物样本保存系统的第二种结构如图2所示，包括第三保存管11、与第三保存管11连接的第二管盖10，第二管盖10通过卡扣的方式置于第三保存管11的开口上。隔断12竖向设置在第三保存管11的中间，将第三保存管11分成两个独立腔室，腔室内分别装有第一保存液 5和第二保存液6。

本发明所述生物样本保存系统的第二种结构的使用方法包括：用采样拭子采集生物样本后，浸入第三保存管11的第一保存液5中浸润；将浸润后的采样拭子放入第三保存管11的第二保存液6中保存。

实施例3本发明所述生物样本保存系统的第三种结构

本发明所述生物样本保存系统的第三种结构如图3所示，包括第四保存管14、第三管盖13，第四保存管14的上端设置有第四螺纹15，第三管盖13内部设置有与第四螺纹15相匹配的螺纹(图中未示出)，第四保存管14与第三管盖13通过螺纹连接置于第四保存管14的开口上。隔断 12竖向设置在第四保存管14的中间，将第四保存管14分成两个独立腔室，腔室内分别装有第一保存液5和第二保存液6。

本发明所述生物样本保存系统的第三种结构的使用方法包括：用采样拭子采集生物样本后，浸入第四保存管14的第一保存液5中浸润；将浸润后的采样拭子放入第四保存管14的第二保存液6中保存。

实施例4采用一次性使用无菌采样拭子采集口腔样本，保存于保存液中然后直接进行PCR

1.实验材料和试剂

注：保存液A-1、B-1、C-1均为第一保存液，保存液A-2、B-2、C-2均为第二保存液。保存液D、E、F为市面上购买的产品。

2.实验步骤和结果

本PCR实验中扩增的目的片段为B2M基因。

PCR反应体系中的引物探针详细信息如下表：

(1)样品采集

使用一次性无菌采样拭子采样后分别浸入保存液A-1，B-1，C-1中浸润并分别转移至保存液A-2、B-2、C-2中保存，完成采样。

使用一次性无菌采样拭子采样后分别浸入保存液D、E、F中保存，完成采样。

(2)样本处理

常温保存放置。于第0/1/2/3天测试RNA的扩增情况。在每次上样时将样本震荡混匀，取出一定量体积，98℃，3min灭活蛋白酶K，平衡至室温。

(3)扩增

将PCR反应管置于仪器上，按照如下反应程序进行扩增，结果见图 4至图11。

扩增结果：

结论：保存液D、E、F扩增Ct均大于40或无扩增，说明保存液中 RNA存在降解情况，这三种保存液无法在72小时内完好保存样本中的 RNA；保存液A-1+A-2、B-1+B-2、C-1+C-2均能在72小时内Ct值无明显变化，说明保存液中RNA无降解，这三种保存液能在72小时内完好保存样本中的RNA。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。