AOL-S00006g439基因在调控少孢节丛孢菌产捕器中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及AOL-S00006g439基因在调控少孢节丛孢菌产捕器中的应用。

背景技术

植物寄生线虫每年给全球粮经作物的安全造成了巨大威胁和经济损失。线虫化学防治由于易造成抗药性、农产品和畜产品化学残留及生态环境破坏，使用量逐渐减少，因此线虫生物防治受到社会广泛关注。在自然界中，捕食线虫真菌主要是在线虫和蛔苷、氨、尿素等化合物刺激下产生捕食器，发挥捕食作用。

少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)是捕食线虫真菌的模式种，目前有报道氨基酸、多肽、蛔苷、氨、尿素等能诱导其产生捕食器捕杀线虫。申请人前期研究还发现副氧化微杆菌的发酵液可有效诱导少孢节丛孢产生捕食器官(CN112522115A)。现有研究多是通过外源诱导的方法诱导少孢节丛孢产生捕食器，而对少孢节丛孢内源调控基因的研究，相关报道较少。

发明内容

本发明主要目的在于提供Npr1基因在调控少孢节丛孢产捕器中的应用。本发明首次发现少孢节丛孢Npr1基因可调控捕食器的产生，通过此基因工程手段对少孢节丛孢进行改造使其自发产生捕器成为可能，为农业线虫病害提供了高效生防菌株。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供AOL-S00006g439(Gene ID:22888974)基因在调控少孢节丛孢产捕器中的应用。

本发明还提供一种少孢节丛孢菌产捕食器的方法，采用基因工程方法敲除少孢节丛孢菌中AOL-S00006g439基因，将敲除菌株进行培养，敲除菌株自发产生捕食器。

进一步地，将敲除菌株在25-30℃条件下培养48h及以上。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明首次发现少孢节丛孢菌中AOL-S00006g439基因可影响捕器的形成，敲除该基因后少孢节丛孢无需线虫、蛔苷等的诱导，可自发生产大量捕器且能够有效捕食线虫，由此通过基因工程手段对少孢节丛孢菌进行改造使其自发产生捕器成为可能。

附图说明

图1为野生型Wide-type与敲除菌株ΔAoNpr1的捕器显微观察图；

图2为野生型Wide-type与敲除菌株ΔAoNpr1菌株捕器数目统计图；

图3为野生型Wide-type与敲除菌株ΔAoNpr1菌株诱捕线虫显微观察图；

图4为野生型Wide-type与敲除菌株ΔAoNpr1菌株的捕食率统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

为便于论述，将AOL-S00006g439基因命名为Npr1基因，其敲除菌株命名为ΔAoNpr1

实施例

一、材料及方法

1、培养基

WA培养基：琼脂质量比为15％，余量为去离子水。

CMY培养基：玉米粒30g沸水煮30min，纱布过滤后加入7g酵母粉、15g琼脂，去离子水定容至1000mL，灭菌后备用。

WA培养基用于少孢节丛孢野生型Wide-type和敲除株ΔAoNpr1的培养及捕器观察；CMY培养基用于野生型Wide-type和敲除株ΔAoNpr1孢子的培养。

2、实验菌株和线虫

本实验所用少孢节丛孢野生型YMF1.01883保存于中国西南野生生物种质资源库-云南大学微生物分库，敲除株ΔAoNpr1为本课题组敲除少孢节丛孢Npr1基因所得菌株；实验用线虫为全齿复活线虫。

采用In-fusion同源融合快速构建敲除载体的方法构建敲除载体，相关引物如下所示：

5’flank：

Npr1-5F:GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGACACGTTCCCACCTGCTC

Npr1-5R:ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACCACCCTCGGTTGGTCTGT

3’flank：

Npr1-3F:CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACAAAGAGGGAAATGGTATGA

Npr1-3R:GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCAATGTAAATGGGTCAGGTT

验证引物：

Npr1-F:GTCACAATACTTTCTATCTC

Npr1-R:CTGCGGAGATCCGGCCATTC

具体构建方法参照：徐梓斐.少孢节丛孢中PKS/TPS杂合生源类化合物生物合成基因的鉴定[D].云南大学,2016.

3、实验方法

3.1少孢节丛孢野生型Wide-type和敲除株ΔAoNpr1捕器的观察

倒WA培养基于直径90mm培养皿中，用无菌水将事先于CMY培养基上培养好的Wide-type和ΔAoNpr1孢子洗下并计数，每皿加入6000个Wide-type或ΔAoNpr1孢子，涂布均匀后于28℃培养48h，观察捕器形成情况，实验重复三次。

3.2杀线虫活性的测定

待菌株产大量捕器后加入100-150条全齿复活线虫，观察ΔAoNpr1和Wide-type对线虫的捕食情况，并计算捕食率，实验重复三次。

二、实验结果

1、ΔAoNpr1敲除株能够自发产生捕食器

培养48h后，ΔAoNpr1敲除株能够自发产生大量的捕器，而Wide-type不能产生捕器，说明Npr1基因在调控捕器形成过程中发挥重要作用，见图1和2。

2、ΔAoNpr1敲除株能够有效捕食线虫

加入线虫10min后，发现ΔAoNpr1敲除株在线虫爬过时能黏住线虫并利用捕器捕食线虫，2h左右捕食率可达80％以上；而Wide-type对线虫无影响，见图3和4。

由此可知，AOL-S00006g439基因可影响捕器的形成，敲除该基因后少孢节丛孢无需线虫的诱导，可自发生产大量捕器且能够有效捕食线虫。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。