一种耗氧型无机纳米酶治疗试剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米医药领域，涉及耗氧型无机纳米酶治疗试剂及其制备方法，以及所述的耗氧型无机纳米酶试剂在制备协同抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

目前，化疗仍旧是肿瘤治疗领域的主流治疗手段。最近，临床上开发出一类小分子乏氧激活型化疗药物，它可以有效利用肿瘤部位局部氧气不足的条件激活化疗药物产生毒性，进而特异性地杀伤癌细胞，这类化疗药物可以有效降低对正常细胞的毒副作用，减少可能产生的化疗并发症。例如，临床上已经使用的一类乏氧激活前药AQ4N(banoxantronedihydrochloride)，AQ4N本身并没有毒性，并可以在氧气浓度正常的环境中保持稳定，一旦将其置于低氧气浓度环境中(如肿瘤环境中)，AQ4N将发生化学变化产生具有细胞毒性的AQ4，AQ4可以共价连接到癌细胞的DNA片段上，造成不可逆的DNA损伤，最终实现特异性的癌细胞杀伤。由此可见，肿瘤部位的缺氧程度与AQ4N的疗效成正相关。而制约这类乏氧激活型化疗药物疗效的最大因素在于如何进一步提升肿瘤部位的乏氧程度。值得注意的是，降低肿瘤部位氧气浓度的策略需要具有特异性，即这种策略并不影响正常组织的氧气浓度，不会造成正常组织缺氧坏死。细胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase,CcO)是一类细胞呼吸终端酶，其能有效的接受来自细胞色素c(cytochrome c,Cytc)传递的电子给氧气，最终将氧气还原为水分子，实现对氧气的消耗。癌细胞具有无限增殖的特性，其对氧气的消耗是过量的，相较于正常细胞，癌细胞内CcO和Cytc的含量是过表达的。基于此，引入外源性的仿CcO无机纳米酶可以高效并特异性地加剧肿瘤部位乏氧，而正常组织不受影响。因此，设计并合成出具有CcO活性的无机纳米酶在实现增强乏氧激活前药疗效的领域上具有广阔前景。

仿CcO无机纳米酶还处在研究初期，已报道的仿CcO无机纳米酶均为合成结构和制备工艺相当复杂的单原子纳米酶，无法实现工艺的简化以及大规模制备的工艺要求。因此，制备工艺简单、结构明确、催化性能优异的新型仿CcO无机纳米酶是目前研究的一个重点。

发明内容

本发明的目的旨在通过在纳米尺度上制备可用于抗肿瘤的仿CcO纳米酶治疗试剂。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种耗氧型无机纳米酶治疗试剂，为仿CcO无机纳米酶治疗试剂，它是以多孔铜银合金纳米粒子(Cu-Ag NPs)为载体，在铜银合金纳米粒子的纳米级别孔道里负载乏氧激活化疗药AQ4N，并在铜银合金纳米粒子表面修饰亲水性氨基化聚乙二醇(NH

本发明的另一个目的是提供一种仿CcO无机纳米酶治疗试剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、合成铜银合金纳米粒子：以水为溶剂，将硝酸银、硝酸铜与聚乙烯吡咯烷酮溶解在水中得到混合溶液，加入含有L-抗坏血酸和氢氧化钠的水合肼溶液，反应得到铜银合金纳米粒子(Cu-Ag NPs)；

步骤(2)、以水为溶剂，铜银合金纳米粒子和氨基化聚乙二醇共沉淀得到Cu-Ag-PEG纳米材料；

步骤(3)、以水为溶剂，Cu-Ag-PEG纳米材料与AQ4N共沉淀得到AQ4N@Cu-Ag纳米材料(AQ4N@Cu-Ag NPs)。

步骤(1)中，所述的硝酸铜和硝酸银的摩尔比为1:1～1:3，优选为1:2。

所述的硝酸铜和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为0.05:1～0.1:1，优选为0.075:1。

所述的混合溶液中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2～5g/L，优选为5g/L。所述的聚乙烯吡咯烷酮的分子量为10000～40000，具体的，可以选自分子量为10000的聚乙烯吡咯烷酮(K15)、分子量为40000的聚乙烯吡咯烷酮。聚乙烯吡咯烷酮可以有效控制铜银合金纳米粒子形成稳定均一的形貌，理论上，在本发明浓度范围内，浓度越高，合成的铜银合金纳米粒子的形貌稳定性更好，更加均一。

所述的氢氧化钠和L-抗坏血酸的摩尔比为3:1～1:1，优选为2.5:1。L-抗坏血酸起到还原Cu

本发明对肼的用量没有特殊要求，具体的，按照水合肼和体系的体积比为0.00009:1～0.0001:1加入水合肼；所述的水合肼的浓度为35wt％。

反应的温度为20～30℃，反应的时间为5～15min。

反应结束后，离心，用无水乙醇洗涤3次，干燥，得到铜银合金纳米粒子。

具体的：将硝酸银和硝酸铜溶解在水中，加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液得到混合溶液，或将硝酸银、硝酸铜分别溶解在水中得到硝酸银溶液、硝酸铜溶液，将硝酸银溶液、硝酸铜溶液和聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合得到混合溶液，或将硝酸银、硝酸铜和聚乙烯吡咯烷酮溶解在水中得到混合溶液；再往混合溶液中加入含有L-抗坏血酸和氢氧化钠的水合肼溶液，进行反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到铜银合金纳米粒子。

步骤(2)中，所述的铜银合金纳米粒子和氨基化聚乙二醇的质量比为1:10～1:40，优选为1:20。

具体的，氨基化聚乙二醇的分子量为2000(NH

共沉淀的温度为25～35℃，共沉淀的时间为12～24h。

具体的，将铜银合金纳米粒子超声分散于水中形成铜银合金分散液，和氨基化聚乙二醇水溶液混合，进行共沉淀，反应结束后，离心、洗涤、干燥得到Cu-Ag-PEG纳米材料。

所述的铜银合金分散液中铜银合金纳米粒子的浓度一般为0.1mg/mL。

具体的，采用用去离子水洗涤3次。

步骤(3)中，所述的Cu-Ag-PEG纳米材料和AQ4N的质量比为1:1～1:3。本发明中，控制AQ4N相对过量，就能实现最大负载效率，也能够控制成本，避免造成AQ4N浪费。

共沉淀的温度为30～40℃，共沉淀的时间为12～24h。该步骤共沉淀的温度略高于室温，既不会破坏AQ4N结构，也可以增强其在纳米粒子表面的负载。

具体的，将Cu-Ag-PEG纳米材料分散在去离子水中形成Cu-Ag-PEG分散液，加入AQ4N水溶液进行共沉淀，反应结束后，离心、用去离子水洗涤3次、干燥，得到AQ4N@Cu-Ag纳米材料(AQ4N@Cu-Ag NPs)。

所述的Cu-Ag-PEG分散液的浓度为1mg/mL；所述的AQ4N水溶液的浓度为10mg/mL。

铜银合金(Cu-Ag NPs)可以传递癌细胞中细胞色素c提供的电子给氧气，作为催化还原氧气的催化中心；在其表面修饰氨基化聚乙二醇可以增强铜银合金亲水性以便用于静脉注射；在其内部负载乏氧激活型前药AQ4N可以实现特异性化疗，提高乏氧激活型化疗药物的治疗疗效，满足临床治疗需求。对于抗肿瘤治疗而言，纳米尺度的AQ4N@Cu-Ag纳米粒子可以通过EPR效应有效地富集在肿瘤部位，与癌细胞内过表达的细胞色素c协同作用，通过电子还原反应将O

本发明的另一个目的是提供所述的仿CcO无机纳米酶治疗试剂在制备饥饿治疗/活性氧疗法/化疗协同肿瘤治疗药物的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果：

本发明仿CcO无机纳米酶治疗试剂结构明确，合成工艺简单，具有类细胞色素氧化酶活性，可与癌细胞内源性过表达的细胞色素c协同作用还原氧气，有效改造肿瘤微环境氧气浓度，产生大量活性氧物种，以及限制ATP(三磷酸腺苷)的生成，激活负载的乏氧激活前药AQ4N。在被动靶向作用下，纳米治疗试剂可以高效富集于肿瘤部位，产生饥饿效应，切断能量供应，产生毒性活性氧物种，以及激活AQ4N生成AQ4杀死肿瘤细胞，有效防止肿瘤的复发和转移。具体表现为：

(1)、本发明AQ4N@Cu-Ag纳米材料结构明确、合成方法简易、产率高；

(2)、本发明AQ4N@Cu-Ag纳米材料水分散性好，生物安全性高，可通过静脉注射被动靶向到小鼠肿瘤部位，实现精准及特异性肿瘤治疗。

(3)、本发明AQ4N@Cu-Ag纳米材料能够改造和利用微环境以创造最佳的乏氧以及ROS产生环境，达到短时间内对癌细胞化学以及氧化损伤，提高治疗疗效。

(4)、本发明的AQ4N@Cu-Ag纳米材料可按需多次注射，实现乏氧肿瘤的高效治疗。

附图说明

图1为Cu-Ag NPs的扫描电镜图片。

图2为Cu-Ag NPs的透射电镜图片。

图3为Cu-Ag NPs在不同条件下耗O

图4为Cu-Ag NPs在不同条件下产·O

图5为Cu-Ag NPs在不同条件下产·OH图谱；其中，横坐标为时间，纵坐标为探针的吸光度。

图6为4T1细胞氧气浓度荧光照片；其中，坐标尺：100μm。

图7为4T1细胞活性氧浓度荧光照片；其中，坐标尺：100μm。

图8为4T1细胞ATP浓度化学发光照片。

图9为流式细胞术表征不同情况下AQ4N@Cu-Ag引起4T1细胞凋亡机理图；Q1区域表示细胞处于机械性死亡，Q2，Q3表示细胞处于早期，晚期凋亡阶段，Q4区域表示细胞存活。

图10为接种4T1乳腺癌细胞的BALB/c小鼠在接受AQ4N@Cu-Ag抗肿瘤治疗后肿瘤体积变化。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

AQ4N@Cu-Ag NPs的合成

步骤(1)、将硝酸银溶液(1mL,0.2M)、硝酸铜溶液(1mL,0.1M)和聚乙烯吡咯烷酮K15溶液(100mL,5g/L)加入在500mL烧杯中，室温搅拌30min混合均匀得到混合溶液，往混合溶液中加入含有L-抗坏血酸和氢氧化钠的水合肼混合溶液(由100mL浓度为50mM的L-抗坏血酸水溶液、100mL浓度为5g/L的氢氧化钠水溶液和30μL浓度为35wt％的水合肼混合而成)，室温反应10min，离心，使用无水乙醇洗涤3次，干燥，得到铜银合金纳米粒子(Cu-AgNPs)，为棕灰色固体粉末；Cu-Ag NPs的扫描电镜图及透射电镜图分别见图1和图2，表明Cu-Ag NPs呈现多孔圆球状，且合成的Cu-Ag NPs尺寸约为100nm。

步骤(2)、在200mL烧杯中，将铜银合金纳米粒子(10mg)超声均匀分散在100mL去离子水中，得到铜银合金分散液；将铜银合金分散液和氨基化聚乙二醇水溶液(将200mg氨基化聚乙二醇溶解在水中配制而成，氨基化聚乙二醇分子量为2000)混合，室温搅拌12h进行共沉淀，离心，使用去离子水洗涤3次，干燥，得到Cu-Ag-PEG纳米材料，为棕灰色固体粉末；

步骤(3)、在温度37℃下，将Cu-Ag-PEG纳米粒子分散于水中得到Cu-Ag-PEG分散液(20mL，1mg/mL)，将AQ4N水溶液(2mL，10mg/mL)倒入Cu-Ag-PEG分散液中，搅拌24h，离心，使用去离子水洗涤3次，干燥，得到棕灰色AQ4N@Cu-Ag纳米材料(记为AQ4N@Cu-Ag NPs)。

实施例2

Cu-Ag NPs消耗O

使用便携式溶氧仪测试纳米粒子在不同条件下催化耗氧的能力，测试分为5组：第一组为空白对照组，为10mL去离子水溶液；第二组为Cytc对照组，为10mLCytc溶液(浓度为10μg/mL，采用去离子水配制，pH值为6.75)；第三组为Cu-Ag NPs对照组，为10mL Cu-Ag NPs分散液(浓度为100μg/mL，采用去离子水配制，pH值为6.75)；第四组为Cu-Ag+Cytc对照组，将10μL Cytc(10mg/mL)加入到10mL Cu-Ag NPs分散液(浓度为100μg/mL，采用去离子水配制，pH值为7.35，模拟正常组织的中性环境)中；第五组为Cu-Ag+Cytc组，将10μL Cytc(10mg/mL)加入到10mL Cu-Ag NPs分散液(浓度为100μg/mL，采用去离子水配制，pH值为6.75，模拟肿瘤部位的酸性环境)中。期间全程采用便携式溶解氧仪检测5组消耗的O

Cu-Ag NPs超氧自由基以及羟基自由基产生性能

利用超氧自由基商用探针DPBF(1,3-Diphenyliso benzofuran,10μL,10μM)检测Cu-Ag NPs在Cytc存在条件下的超氧自由基产生性能。采用去离子水分别配制浓度为100μg/mL的Cu-Ag NPs分散液、浓度为10mg/mL的Cytc溶液；分别取2mLCu-Ag NPs分散液、10μLCytc溶液，将两者混合，再加入10μL DPBF(10μM)溶液(将DPBF溶解在水和二甲亚砜体积比为9:1的混合溶剂中；DPBF在波长420nm处有特征吸收)，间隔5min检测DPBF的吸收变化情况。如图4所示，DPBF的吸收随着反应时间的增加而逐渐下降，表明Cu-Ag NPs和Cytc联合作用具有优异的产超氧自由基性能。

利用羟基自由基商用探针亚甲基蓝检测Cu-Ag NPs在Cytc存在条件下的羟基自由基产生性能。采用去离子水分别配制浓度为100μg/mL的Cu-Ag NPs溶液、浓度为10mg/mL的Cytc溶液；分别取2mLCu-Ag NPs溶液、10μL Cytc溶液，将两者混合，再加入10μL亚甲基蓝水溶液(100μM；亚甲基蓝在波长660nm处有特征吸收)，间隔5min检测亚甲基蓝的吸收变化情况。如图5所示，亚甲基蓝的吸收随着反应时间的增加而逐渐下降，表明Cu-Ag NPs和Cytc联合作用具有优异的产羟基自由基性能。

Cu-Ag NPs的细胞耗氧测试

选用4T1乳腺癌细胞进行耗氧实验，用红色氧气指示探针(RDPP，[Ru(dpp)

如图6所示，与对照组相比，从荧光信号可以看出4T1乳腺癌细胞内红色荧光信号增强，荧光强度与氧气浓度成负相关，说明Cu-Ag NPs可以有效消耗细胞内氧气。

Cu-Ag NPs的细胞产活性氧测试

选用4T1乳腺癌细胞进行产活性氧实验，用绿色活性氧指示探针(DCFH-DA)检测4T1乳腺癌细胞内活性氧浓度，检测过程为：先用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为100μg/mL的Cu-Ag NPs分散液；在37℃含5％二氧化碳环境下，4T1乳腺癌细胞在含有2mL1640培养基的培养皿中孵育24小时，加入活性氧指示探针(DCFH-DA,100μL,10μM,去离子水配制)、Cu-Ag NPs分散液(100μL)继续孵化24小时；除去培养基，生理盐水洗涤3次，用荧光倒置显微镜观察细胞内活性氧情况。另外，将只加入磷酸盐缓冲液培养的细胞作为对照组。

如图7所示，与对照组相比，从荧光信号可以看出4T1乳腺癌细胞内绿色荧光信号增强，荧光强度与活性氧浓度成正相关，说明Cu-Ag NPs可以在细胞内有效产生活性氧。

Cu-Ag NPs的细胞抑制ATP生成测试

选用4T1乳腺癌细胞进行抑制ATP生成实验，用ATP检测试剂盒(S0026，南京碧云天)检测4T1乳腺癌细胞内ATP浓度，检测过程为：先用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为100μg/mL的Cu-Ag NPs分散液；在37℃含5％二氧化碳环境下，4T1乳腺癌细胞在含有2mL1640培养基的培养皿中孵育24小时，加入ATP检测试剂(100μL,10μM,去离子水配制)、Cu-Ag NPs分散液(100μL)继续孵化24小时；除去培养基，生理盐水洗涤3次，用化学发光检测仪观察细胞内ATP情况。另外，将只加入磷酸盐缓冲液培养的细胞作为对照组。

如图8(左侧的为明场图片，右侧的为与之对应的化学发光图片)所示，从化学发光信号可以看出4T1乳腺癌细胞内化学发光信号增强，化学发光强度与ATP浓度成正相关，说明Cu-Ag NPs可以在细胞内有效抑制ATP的产生。

实施例3

AQ4N@Cu-Ag NPs的细胞凋亡测试

为探究AQ4N@Cu-Ag NPs的细胞凋亡机理，对4T1乳腺癌细胞进行流式细胞术测试，实施方式如下：预先用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为100μg/mL的AQ4N@Cu-AgNPs分散液、浓度为100μg/mL的Cu-Ag NPs分散液、浓度为100μg/mL的AQ4N溶液；在37℃含5％二氧化碳环境下，4T1乳腺癌细胞在含有2mL1640培养基的六孔板中孵育24小时，之后对4T1乳腺癌细胞进行不同处理：i)空白对照组(Control)：加入100μL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；ii)第一处理组(AQ4N)：加入100μL 100μg/mLAQ4N溶液；iii)第二处理组(Cu-AgNPs)：加入100μL 100μg/mL Cu-Ag NPs分散液；iv)第三处理组(AQ4N@Cu-Ag NPs)：加入100μL 100μg/mL AQ4N@Cu-Ag NPs分散液。继续将4T1乳腺癌细胞在37℃含5％二氧化碳环境下孵育24小时，采用碘化丙啶(PI)红色染料染死细胞，FITC染料标记活细胞。

如图9所示，AQ4N@Cu-Ag NPs组发生早期凋亡的细胞占83％，Cu-Ag NPs组占15.3％,AQ4N组占7.72％，表明AQ4N@Cu-Ag NPs具有最强的癌细胞致死率，且主要通过早期凋亡方式导致细胞死亡。

AQ4N@Cu-Ag NPs肿瘤治疗性能

用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为100μg/mL的AQ4N@Cu-Ag NPs分散液、浓度为100μg/mL的Cu-Ag NPs分散液、浓度为100μg/mL的AQ4N溶液。

选取20只皮下接种4T1乳腺癌细胞的BALB/c小鼠作为肿瘤模型，随机分成4组，尾静脉药物注射接受不同治疗：第一组为空白对照组(Control)，尾静脉注射100μL pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液；第二组为AQ4N对照组，尾静脉注射100μL浓度100μg/mL的AQ4N溶液；第三组为Cu-Ag NPs对照组，尾静脉注射100μL浓度100μg/mL的Cu-Ag NPs分散液；第四组为AQ4N@Cu-Ag NPs治疗组，尾静脉注射100μL浓度100μg/mL的AQ4N@Cu-Ag NPs分散液。每隔两天测量肿瘤体积，16天后处死，以每组小鼠肿瘤原始体积为基准计算相对肿瘤体积变化。

如图10所示，AQ4N@Cu-Ag NPs治疗组小鼠肿瘤模型在接受治疗后肿瘤基本消失，可以有效抑制肿瘤生长，16天后AQ4N@Cu-Ag NPs治疗组小鼠肿瘤体积趋近为0mm