一种多模式聚集诱导荧光免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明属于快速免疫检测技术领域，具体涉及一种聚集诱导荧光颗粒、复合物、多模式层析试纸及其制备方法

背景技术

免疫层析试纸因具有简便、快速、成本低等优势，为目前现场快速检测分析的主要技术手段，广泛应用于临床疾病、食品安全、环境监测等技术领域。其基本原理是以硝酸纤维素膜作为层析反应膜，样本中的待测分析物与膜上检测区域固定的抗原或抗体发生特异性的免疫反应，分析检测区域免疫标记物的信号强度，实现对待测分析物的检测。传统免疫层析以胶体金作为标记物，检测结果裸眼即可读数不需要复杂的设备和医疗专业人员。尽管这种检测方式很容易获得定性或者半定量的结果，但基于比色法的免疫层析检测对于目标浓度的细微变化难以在颜色深浅上体现，因此无法实现精确定量和较高的灵敏度。

通过使用包括有机荧光团或量子点在内的荧光材料作为标记物，以获得更高的信号、更好的对比度和更低的背景干扰，可以改善免疫层析检测的定量性能。然而荧光材料的光吸收能力较低，因此荧光检测试纸条通常缺乏视觉检测能力。而且依赖额外的激发光源和传感设备进行信号读出也限制了荧光免疫层析检测的使用场景。比色法和荧光法的缺陷促使一种新的通用检测方法的出现，该方法具有独立的强可见/荧光双信号，适用于一系列应用场景。2020年Chongwen Wang等人报道了一种聚乙烯亚胺(PEI)介导的组装方法(Analytical Chemistry,2020,92(23):15542-15549.)，以SiO

传统的荧光材料存在聚集荧光淬灭现象(ACQ)：在稀溶液中呈现出较强的荧光，但在高浓度溶液中或者被制成固态时，其发光性能往往会减弱甚至完全消失。而聚集诱导发光(AIE)是唐本忠院士团队在2001年偶然发现的现象：材料在聚集状态发光增强，为解决传统ACQ材料的荧光淬灭问题提供了新的思路；AIE材料用于生物分子标记的优势主要体现在：低背景、信噪比高、灵敏度好等方面。2019年Weihua Lai等首次报道(Biosensors andBioelectronics,2019,135:173–180)，采用AIE荧光微球用于荧光免疫层析检测，与传统的荧光微球相比，AIE具有更大的斯托克斯位移、更高的荧光强度和荧光量子产率。2021年复旦大学李富有团队报道(ACS nano,2021,15(5):8996-9004.)，采用近红外Ⅱ区的AIE材料制备荧光微球用于免疫层析检测，该方法可降低样本的背景荧光干扰。近年来，据报道聚集诱导荧光材料也具有肉眼可见颜色，用于有机光电材料的开发。但现有的用AIE材料制备荧光微球主要利用的AIE材料的荧光特性，制备荧光免疫层析试纸，而限制其在现场裸眼检测的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供了一种稳定性好、灵敏度高的多模式聚集诱导荧光颗粒，聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物，和涂覆有所述聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物的免疫层析试纸及其制备方法。本发明制备方法简单，灵敏度高，重复性好，且对环境友好。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种聚集诱导荧光颗粒，其在透射电子显微镜下呈核壳结构，粒径为50～500nm，主要由兼具颜色和荧光特性的聚集诱导荧光材料和聚合物组成。较佳的，聚集诱导荧光颗粒表面还含有羧基官能团。

进一步地，所述兼具颜色和荧光特性的聚集诱导荧光材料选自四苯乙烯类AIE衍生物、噻咯类AIE衍生物、1,4-均二苯乙烯类AIE衍生物、五元杂环类AIE衍生物和呋喃类AIE衍生物中的一种或多种。

进一步的，所述聚合物选自聚苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物和聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物中的至少一种。

进一步地，所述聚合物的分子量为1500～40000。优选地，所述聚合物的分子量为1900～37000。

进一步的，所述聚集诱导荧光颗粒的表面具有羧基，羧基来自聚合物。本发明还提供一种聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物，其含有如上所述的聚集诱导荧光颗粒和抗体。

本发明还提供一种免疫层析试纸，其偶联垫上涂覆有如上所述的聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物。

本发明还提供了一种制备如上所述的聚集诱导荧光颗粒的方法，包括以下具体步骤：油相为溶于氯仿中的聚集诱导荧光材料和聚合物，其中聚集诱导荧光材料的浓度为1～20mg/mL，聚合物的浓度为5-100mg/mL；水相为质量浓度0.1～1％的表面活性剂水溶液；油相/水相混合体积比例为1︰3～6(即油相︰水相＝1︰3～6)，且用磁力搅拌1～10分钟后超声波探头乳化1～10分钟，得到微乳液；然后去除氯仿溶剂固化微乳液液滴，即得到聚集诱导荧光颗粒。

进一步地，固化微乳液滴后，将聚集诱导荧光颗粒离心，取沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤后，分散于磷酸盐缓冲液中备用。

进一步地，油相中聚集诱导荧光材料与聚合物的配比为1︰1～8。

进一步地，油相中聚集诱导荧光材料的浓度为2.5～5mg/mL；聚合物的浓度为20mg/mL。

进一步地，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、吐温20、吐温80和曲拉通X-100中的至少一种。

另一方面，本发明还提供了一种制备所述聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物的方法：将如上所述的聚集诱导荧光颗粒分散于pH 4～6的磷酸盐缓冲液中，加入活化剂，进行活化反应后，离心去上清后，将活化后的颗粒分散于磷酸盐缓冲液中，加入抗体，室温孵育反应，离心去上清，即去除游离的抗体，将沉淀颗粒-抗体偶联物分散于封闭液中孵育，得到聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物。

进一步地，活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；EDC的工作浓度为0.1～1mg/mL。

具体地，聚集诱导荧光颗粒分散于pH 4～6的磷酸盐缓冲液中，加入浓度0.1～1mg/mL的活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，活化反应20～40分钟(优选地为30分钟)，离心去上清后，将活化后的颗粒分散于磷酸盐缓冲液中，加入抗体，室温孵育反应1小时，然后离心去除游离的抗体，将沉淀颗粒-抗体偶联物分散于封闭液中，室温孵育2小时以上(包括2小时)，得到聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物。

进一步地，封闭后将得到的所述聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物加入质量浓度5％的牛血清蛋白(BSA)保存备用。

进一步地，封闭液为酪蛋白溶液。优选地，封闭液为浓度为5mg/mL的酪蛋白溶液。

本发明还提供了一种免疫层析试纸：包括在底板上依次搭接设置的样本垫、偶联垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；其中，偶联垫上涂覆有如上所述的聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物。

与现在的技术相比较，本发明具有以下优点：

1.与现有的胶体金为标记物的免疫层析检测方法比较，具有聚集诱导荧光层析检测灵敏度更高、批间差异小、标记物更稳定等特点。

2.与现有的有机荧光团或量子点在内的荧光材料为标记物的免疫层析检测方法比较，具有光吸收能力强，裸眼即可观测到；荧光强度高且不易淬灭；信噪比高、灵敏度好等特点。

3.本发明采用细乳液-溶剂挥发法制备聚集诱导荧光颗粒，静电自组装方法制备的颗粒比较，设备和工艺简单，制备得到的复合颗粒粒径均一、条件可控、重复性好、颗粒中材料浓度易于控制。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是不同放大倍数下的聚集诱导荧光颗粒的透射电子显微镜照片，大图标尺为500纳米，右下角小图标尺为50纳米。

图2是以兼具颜色和荧光特性的聚集诱导荧光颗粒为标记物的免疫层析检测C反应蛋白的结果，a是在紫外光激发下的结果，b是自然光下的结果。

图3是以时间分辨荧光微球为标记物的免疫层析检测白介素6的结果，a是自然光下的结果，b是在紫外光激发下的结果。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐释本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。

须知，本说明书附图示所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

实施例1：聚集诱导荧光颗粒的制备及标记C反应蛋白抗体方法：

A、配制油相组分：将四苯乙烯类AIE衍生物和聚苯乙烯-马来酸酐共聚物(分子量1900，购自Sigma-Aldrich)分散在氯仿溶液中，四苯乙烯类AIE衍生物的浓度为10mg/mL，聚合物的浓度为10mg/mL；

B、配制水相组分：将十二烷基磺酸钠和曲拉通X-100配制成水溶液，十二烷基磺酸钠的质量浓度为0.1％，曲拉通X-100的质量浓度为0.5％；

C、将油相加入水相溶液中，磁力搅拌至均匀，然后使用超声波破碎仪将混合液进行超声处理2分钟，即可得到均匀稳定的微乳液；

D、室温下，将微乳液置于敞口容器，磁力搅拌下，使溶剂逐渐挥发，挥发时间为16小时，离心洗涤，沉淀用超声分散得到材料-聚合物复合颗粒；电镜照片如图1，乳液照片如图2；

E、活化颗粒表面羧基：颗粒分散在pH 4.0的磷酸盐酸磷酸盐缓冲液中，颗粒浓度20mg/mL，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，浓度1.0mmol/L，室温下孵育30分钟；

F、孵育结束后离心去上清，沉淀加入磷酸盐缓冲液分散，然后将C反应蛋白抗体(购自杭州伊佰新生物技术有限公司)加入到磷酸盐缓冲液中，C反应蛋白抗体浓度为30μg/ml，接着将聚集诱导荧光颗粒溶液加入到C反应蛋白抗体溶液中，室温下孵育30分钟；

G、孵育后离心去除多余抗体，加入酪蛋白超声分散，浓度为5mg/mL，室温下封闭(孵育)2小时以上；

H、封闭后加入质量浓度5％的BSA，即得到偶联了C反应蛋白抗体的聚集诱导荧光颗粒。

实施例2：聚集诱导荧光颗粒的制备及标记羊抗兔免疫球蛋白(IgG)抗体方法：

A、配制油相组分：将四苯乙烯类AIE衍生物和聚苯乙烯-丙烯酸共聚物(分子量37000，购自Sigma-Aldrich)分散在氯仿溶液中，四苯乙烯类AIE衍生物的浓度为10mg/mL，聚合物的浓度为10mg/mL；

B、配制水相组分，将十二烷基磺酸钠配制成水溶液，十二烷基磺酸钠的质量浓度为0.5％；

C、将油相加入水相溶液中，磁力搅拌至均匀，然后使用超声波破碎仪将混合液进行超声处理5分钟，即可得到均匀稳定的微乳液；

D、室温下，将微乳液置于敞口容器，磁力搅拌下，使溶剂逐渐挥发，挥发时间为24小时，离心洗涤，沉淀用水超声分散得到材料-聚合物复合颗粒；电镜照片如图1，乳液照片如图2；

E、活化颗粒表面羧基：颗粒分散在pH 4.0的磷酸磷酸盐缓冲液中，颗粒浓度20mg/mL，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，浓度1.0mmol/L，室温下孵育30分钟；

F、孵育结束后离心去上清，沉淀加入磷酸盐缓冲液分散，然后将羊抗兔IgG多克隆抗体(购自杭州隆基生物有限公司)加入到磷酸盐缓冲液中，羊抗兔IgG抗体浓度为50ug/ml，接着将聚集诱导荧光颗粒溶液加入到羊抗兔抗体溶液中，室温下孵育30分钟；

G、孵育后离心去除多余抗体，加入酪蛋白超声分散，浓度为5mg/mL，室温下封闭24小时以上；

H、封闭后加入质量浓度5％的BSA保存，即得到偶联了羊抗兔IgG抗体的聚集诱导颗粒。

实施例3：C反应蛋白样本检测

用实施例1中标记了C反应蛋白抗体的聚集诱导荧光颗粒(即聚集诱导荧光颗粒-C反应蛋白抗体复合物)和实施例2中标记了羊抗兔IgG抗体的聚集诱导颗粒(即聚集诱导荧光颗粒-羊抗兔IgG抗体复合物)制备得到高灵敏的C反应蛋白聚集诱导荧光颗粒多模式免疫层析试纸，试纸制作步骤如下：

将聚集诱导荧光颗粒-C反应蛋白抗体复合物和聚集诱导荧光颗粒-羊抗兔IgG抗体复合物涂覆在偶联垫上备用；用磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)分别调节C反应蛋白另一株抗体、抗兔抗体浓度为1.0mg/mL；

将C反应蛋白另一株抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部作为检测线(T线)，将兔IgG喷涂于上部作为质控线(C线)，划膜速度1μL/cm，然后37℃烘干处理备用；

最后在底板上搭接样本垫、偶联垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，用刀切成合适宽度后得到C反应蛋白聚集诱导荧光颗粒多模式免疫层析试纸。

检测原理及过程如下：

检测原理：夹心法检测阳性样本时，标记物偶联抗体和T线所划线抗体是针对同一种抗原不同位点的两株抗体，待测抗原首先与偶联了对应抗体的标记物结合，这样抗原-抗体复合物经过T线时，再与T线上的另一株抗体结合，形成抗体-抗原-抗体的夹心结构，因此检测阳性样本T线显色。相反，阴性样本中没有待测抗原与标记物上的抗体结合，故标记物经过T线时不可以和T线上的抗体结合从而导致T线不显色。

检测过程：吸取5μL血清/血浆样本(或8.5μL的全血样本)，将样本加入磷酸盐缓冲液中，充分混匀30s～1min。用移液器从上述溶液中吸取75μL加入到免疫层析试纸的样本垫上，等待加样反应2～8min，裸眼观察试纸的结果(图2a)或者用激光荧光读取仪扫描试纸荧光强度计算定量结果(荧光激发：图2b)

结果中试纸条上面一条线为质控线(C线)，下面一条线为检测线(T线)。由于C反应蛋白为大分子抗原，采用的是夹心法检测，所以随着检测浓度的提高T线颜色越来越深。而独立C线固定的兔IgG与标记了羊抗兔IgG抗体的聚集诱导荧光颗粒进行免疫结合反应，所以C线的颜色保持不变。

对比例1：时间分辨荧光微球标记白介素6抗体的方法

A、将购买的时间分辨荧光微球成品分散在pH4.0的磷酸磷酸盐缓冲液中，颗粒浓度为20mg/mL，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，浓度1.0mmol/L，室温下孵育30分钟；

B、孵育结束后离心去上清，沉淀加入磷酸盐缓冲液分散，然后将白介素6抗体加入到磷酸盐缓冲液中，抗体浓度为50ug/ml，接着将时间分辨荧光微球加入到白介素6抗体溶液中，室温下孵育30分钟；

C、孵育后离心去除多余抗体，加入酪蛋白超声分散，浓度5mg/mL，室温下封闭24小时以上；

D、封闭后加入保存液质量浓度5％的BSA(购自国药集团化学试剂有限公司)，即得到偶联了白介素6抗体的时间分辨荧光微球。

对比例2：白介素6样本的检测

利用对比例1中得到的标记了白介素6抗体的时间分辨荧光微球(即时间分辨荧光微球-白介素6抗体复合物)制备得到高灵敏度的白介素6免疫层析试纸，试纸制作步骤如下：

将时间分辨微球-白介素6抗体复合物涂覆在偶联垫上备用；

用PBS溶液调节白介素6另一株抗体浓度为1.0mg/mL；

将白介素6另一株抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部作为检测线划膜速度0.5μL/cm，然后37℃烘干处理备用；

最后在底板上搭接样本垫、偶联垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，用刀切成合适宽度后得到白介素6免疫层析试纸。

检测原理同实施例3。

检测过程：取100μL白介素6质控品加到试纸条的样本垫上，等待加样反应2～8分钟，裸眼观察试纸的结果(图3a)或者用激光荧光读取仪扫描试纸荧光强度计算定量结果(荧光激发结果：图3b)。

结果中试纸条下面一条线为检测线(T线)，因为只是作为实施例3的对比，所以没有设置质控线(C线)。由于白介素6为大分子抗原，采用的是夹心法检测，所以随着检测浓度的提高T线颜色越来越深。不同于实施例3中两种模式下都可以观测到检测结果，对比例2只有在激发光激发下才能看到检测结果，裸眼无法观测到检测结果。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。