牡丹籽蛋白粉、制备方法、酵母修复精华霜及应用

技术领域

本申请涉及牡丹籽技术领域，尤其涉及牡丹籽蛋白粉、制备方法、酵母修复精华霜及应用。

背景技术

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科、芍药属植物，为中国国花，其分为观赏型牡丹与油用型牡丹，油用牡丹在提油过程中籽粕的产出率为25％～30％。牡丹籽粕含多种营养成分，粗蛋白含量高达28.12％，包含8种必需氨基酸，此外还含有黄酮、多糖等物质。牡丹籽蛋白具有较好的起泡性、持水性、乳化哇与乳化稳定性。此外，牡丹籽多肽还具有抗氧化、抗菌、降血压、降血糖和免疫调节等生物活性，开发利用前景广阔。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于充分开发牡丹籽相关活性成分，利用其各类化合物的相关性质以及组合性质拓宽其应用领域具有十分重要的意义。

第一方面，本申请实施例公开了一种牡丹籽蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

预备过筛的牡丹籽粉和果生假丝酵母菌株；

制备果生假丝酵母的活化平板；

将所述活化平板上的菌落接种至种子培养基中培养，以制备果生假丝酵母的种子液，所述种子培养基包含所述牡丹籽粉；

将所述种子液接种至发酵培养基中培养，以制得果生假丝酵母的发酵液，所述发酵培养基包含牡丹籽粉；

将所述发酵液进行提取，以制得所述牡丹籽蛋白粉。

在本申请实施例中，所述种子培养基包含200～25g/L蔗糖、30～75g/L牡丹籽粉、14～25g/L尿素、0.04～0.08g/L FeCL

在本申请实施例中，所述种子培养基包含200～25g/L蔗糖、30～75g/L牡丹籽粉、14～25g/L尿素、0.78～1.32g/L NH

在本申请实施例中，所述发酵培养基包含300g/L葡萄糖、100～150g/L牡丹籽粉、20～25g/L尿素、0.04～0.1g/L FeCL

在本申请实施例中，所述发酵培养基包含300g/L葡萄糖、100～150g/L牡丹籽粉、20～25g/L尿素、0.78～1.5g/L NH

在本申请实施例中，制备所述种子液的培养时间为15～20h，培养温度为30℃；制备所述发酵液的培养时间为30～35h，培养温度为30℃，培养至发酵液OD600值达到0.6～1.2之间收获。

在本申请实施例中，对所述发酵液进行提取的步骤包括：

取收获的发酵液，于105℃下处理15min后，采用石油醚和正已烷的有机溶剂处理，去除有机溶剂后的沉淀物按照料液比为1:15的比例将其加入至85％的乙醇溶液中，于10000r/min均质2min，再以磁力搅拌器搅拌2h后，再于8000r/min、4℃离心20min，取沉淀物；

将沉淀物以料液比为1:15的比例加入1M NaCl溶液中搅拌2h，再次于8000r/min、4℃离心20min，取沉淀物；

将沉淀物以料液比为1:15的比例加入75％的NaOH溶液中搅拌2h，再次于8000r/min、4℃离心20min，取沉淀物，冻干处理，即为牡丹籽蛋白的冻干粉。

第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的制备方法制得的牡丹籽蛋白粉，以Bradford检测方法计包含蛋白含量不低于70％，以SDS-PAGE检测方法计包含的蛋白组分分子量分布为60KD、45KD、40KD、20KD、15KD和10KD。

第三方面，本申请实施例公开了一种酵母修复精华霜，按重量份计包含第一方面所述的制备方法制得的牡丹籽蛋白冻干粉200～300份、栀子提取物50～80份、紫草提取物20～50份、草绿盐角草提取物20～50份、神经酰胺35～15份、裂裥菌素5～20份、1,3-丁二醇3～10份、1,2-戊二醇5～15份、白池花籽油20～50份和角鲨烷10～30份。

第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的制备方法制得的牡丹籽蛋白冻干粉、或第二方面所述的牡丹籽蛋白粉在制皮肤损伤修复或皮肤再生制品或化妆品中的应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：

本申请实施例通过对牡丹籽进行深度开发，利用果生假丝酵母进行发酵制得了以牡丹籽蛋白粉，为以此牡丹籽蛋白为基础的酵母修复精华霜。该牡丹籽蛋白粉和酵母修复精华霜，相对于直接用牡丹籽提取的蛋白粉而言，具有更好的乳化性能和抗氧化性能，并且具有抑菌性能，制得酵母修复精华霜具有明显的加速愈合开放性伤口愈合，并具有修复愈合后疤痕的功效，具有在疤痕修复领域的应用前景。

附图说明

图1为本申请实施例提供的牡丹籽冻干粉蛋白的SDS-PAGE图，从左至右图的泳道依次为标品，实施例1～7。

图2为本申请实施例提供的牡丹籽冻干粉蛋白的SDS-PAGE图，从左至右图的泳道依次为标品，实施例8～11和对比例1～3。

图3为本申请实施例提供的牡丹籽冻干粉蛋白的抑菌图，A为对比例2提供的1.0％供试品溶液大肠杆菌抑菌图，B为对比例2提供的1.0％供试品溶液金黄色葡萄糖球菌抑菌图，C为对比例3提供的1.0％供试品溶液大肠杆菌抑菌图，D为对比例3提供的1.0％供试品溶液金黄色葡萄糖球菌抑菌图，E为实施例1提供的1.0％供试品溶液大肠杆菌抑菌图，F为实施例1提供的1.0％供试品溶液金黄色葡萄糖球菌抑菌图。

图4为本申请实施例提供的典型大鼠开放性损伤圆孔愈合前后对比图，右图为愈合后圆孔形态，其中圆圈为愈合后的疤痕面积。

图5为本申请实施例提供的大鼠开放性损伤圆孔愈合后皮肤HE染色图，A\B为实验组中实施例1和对比例1提供的酵母修复精华霜作用后图，C\D为对照组中实施例1和对比例1提供的牡丹籽蛋白粉作用后图对比图，图中“1”表示再生表皮，“2”表示胶原纤维，“3”表示新生毛细血管。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

一、材料与方法

1、材料

牡丹籽，甘肃中川牡丹产业有限公司，研磨成粉，50目过筛。果生假丝酵母，货号B98036，明舟生物。

2、菌株活化

活化培养基采用YM培养基：酵母膏，3.0g麦芽提取物，3.0g葡萄糖，10.0g蛋白栋，5.0g琼脂，20.0g蒸馏水1000mL，pH 6.2±0.2，121℃，15min。用0.5mL的无菌水溶解冻干管，冻干首次活化，干粉要全部用完，不能保留，接种至上述的YM平板上，培养温度：25～28℃，好氧培养7天，即可得到活化平板。

3、菌株培养

一个具体的实施例1的培养实施过程如下：

将活化的平板菌落接种至装量为300mL三角瓶装50mL种子培养基，摇床转速200r/min，培养温度30℃，培养时间18h。用血球法计算培养液的酵母菌浓度，并配至1×10

将种子液按照5v/v％体积比接种至300mL发酵培养基中，摇床转速200r/min，培养温度30℃，培养时间30～35h，测定其OD600值达到0.6～1.2之间即可收获发酵液。其中，发酵培养基包含：葡萄糖300g/L，牡丹籽粉100g/L、尿素25g/L、FeCL

一个具体的实施例2的培养实施过程中，种子培养基包含200g/L蔗糖、牡丹籽粉75g/L、尿素14g/L、FeCL

一个具体的实施例3的培养实施过程中，种子培养基包含200g/L蔗糖、牡丹籽粉30g/L、尿素25g/L、NH

一个具体的实施例4的培养实施过程中，种子培养基包含200g/L蔗糖、牡丹籽粉75g/L、尿素14g/L、NH

一个具体的实施例5的培养实施过程中，种子培养基包含200g/L蔗糖、牡丹籽粉75g/L、尿素14g/L、NH

一个具体的实施例6的培养实施过程中，发酵培养基包含300g/L蔗糖、牡丹籽粉150g/L、尿素20g/L、FeCL

一个具体的实施例7的培养实施过程中，发酵培养基包含300g/L蔗糖、牡丹籽粉100g/L、尿素25g/L、NH

一个具体的实施例8的培养实施过程中，发酵培养基包含300g/L蔗糖、牡丹籽粉100g/L、尿素25g/L、NH

一个具体的实施例9的培养实施过程中，发酵培养基包含300g/L蔗糖、牡丹籽粉150g/L、尿素20g/L、NH

一个具体的实施例10的培养实施过程中，发酵培养基包含300g/L蔗糖、牡丹籽粉150g/L、尿素20g/L、NH

一个具体的实施例11的培养实施过程中，种子培养基包含250g/L蔗糖、牡丹籽粉30g/L、尿素25g/L、NH

一个具体的对比例1的培养实施过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其种子培养基不包含牡丹籽粉。

一个具体的对比例2的培养实施过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其发酵培养接不包含牡丹籽粉。

4、提取

具体的实施例1的提取实施过程如下：

取上述实施例1收获的发酵液，于105℃下处理15min，3000rpm离心15min，取沉淀物按料液比为1:20的比例添加石油醚和正已烷(体积比为7:3)，处理8h后，去除溶液，沉淀物置于通风橱挥干溶剂；准确称取10g脱脂粉置于高速均质机中，加入85％乙醇溶液，料液比1:15，10000r/min均质2min，再以磁力搅拌器搅拌2h，将匀浆转移到刻度离心管中，8000r/min、4℃离心20min，取沉淀物；将沉淀物以料液比为1:15的比例加入1M NaCl溶液中搅拌2h，再次于8000r/min、4℃离心20min，取沉淀物；将沉淀物以料液比为1:15的比例加入75％的NaOH溶液中搅拌2h，再次于8000r/min、4℃离心20min，取沉淀物，冻干处理，即为牡丹籽蛋白的冻干粉。

实施例2～11以及对比例1～2的初步提取方法均与实施例1相同。

一个具体的对比例3的提取实施过程中，其采用上述牡丹籽粉作为原料，采用与实施例1相同的提取步骤制得牡丹籽蛋白的冻干粉。

5、牡丹籽蛋白的分离及含量检测

准确称取牡丹籽蛋白的冻干粉3.0g，溶于100mL 0.5M NaCL溶液，7000r/min离心15min后，静置10min，取上清液，采用Bradford试剂盒检测其中含量，根据检测的蛋白含量，计算牡丹籽蛋白冻干粉中的蛋白含量(质量百分比wt％)。

6、牡丹籽冻干粉蛋白的乳化性能

取上述实施例1～11和对比例1～3分别制得的冻干粉，分别用pH7.00.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制0.1％(w/v)牡丹籽蛋白样品溶液，取1mL样品溶液与5mL大豆油混合，使用均质机以10000r/min在室温下均质2min，于0min和10min用0.1％(w/v)SDS溶液按1:100稀释，在500nm处测定吸光度，每个样品重复三次。乳化活性指数(EAI)和乳化稳定指数(ESI)按照以下公式计算：

7、牡丹籽冻干粉蛋白的抗氧化性能

参照“王宁，张叶韬，芦晓芳；黑豆异黄酮的提取分离及其对DPPH自由基的清除能力[J]安徽农业科学，公开于2022.01.08”的方法，计算DPPH自由基清除率，并计算牡丹籽冻干粉蛋白溶液基于DPPH自由基清除率的IC50。

参照“马娇，施志凡，张海芬，那吉，高云涛；7种云南可食用昆虫醇提液对ABTS+自由基清除作用[J]化学工程师，公开于2021.01.32”的方法，计算ABTS+·自由基清除率，并计算牡丹籽冻干粉蛋白溶液基于ABTS+·自由基清除率的IC50。

参照“龚永欢，刘霞，周海霞，李伟，马林；中药及复方水提物对DPPH·和·OH的清除作用[J]湖北农业科学，公开于2013.10.20”的方法，计算·OH自由基清除率，并计算牡丹籽冻干粉蛋白溶液基于·OH自由基清除率的IC50。

参照“张以忠，李红梅，邓琳琼；大野荞不同器官水提液清除·OH、O2-·和H

8、体外抑菌实验

从-80℃中取出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(中国兽药监察所)放入室温融化备用，用MH液体培养基培养于25cm

样品液：用pH7.00.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制0.10％(w/v)、0.25％、0.50％、1.0％、2.5％、5.0％和10％的牡丹籽蛋白样品溶液作为样品液

抑菌试验：用10

9、统计学分析

所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。

二、结果

如图1和2所示，实施例1～11制得的牡丹籽蛋白的冻干粉，其中蛋白组分分子量分布于40～70KD和10～20KD之间，具体为60KD、45KD、40KD、20KD、15KD和10KD；而对比例1和3的牡丹籽蛋白的冻干粉分组量分布于40～180KD之间，具体为180KD、130KD、100KD、70KD和35KD；对比例2的牡丹籽蛋白的冻干粉分组分出于50KD可见浓度较低的条带，其他未见清晰的条带，说明对比例2中牡丹籽蛋白含量较低，进一步的蛋白含量见表1所示。

表1

表1中还示出了实施例1～11和对比例1～3制得的蛋白的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定指数(ESI)，可见实施例1～11制得的蛋白的EAI和ESI值均显著高于对比例1～3，说明实施例1～11制得的牡丹籽蛋白的乳化性能显著高于对比例1～3。

具体而言，对比例1相对于实施例1，其采用相同牡丹籽粉和果生假丝酵母发酵，然而其在种子培养基中并未条件牡丹籽粉，使得果生假丝酵母的种子液培养过程中氮源不足，从而导致果生假丝酵母生长受限，种子液活力不足，将此种活力不足的种子液接种即使含有牡丹籽粉的发酵培养基中进行培养，仍然导致发酵不足，发酵液中的蛋白含量与对比例3相当，并未对牡丹籽粉中自身含有的蛋白成分进行含量的提升和乳化性能的改变。而对比例2相对于实施例1，由于在发酵培养基中并未添加牡丹籽粉，同样使得发酵过程氮源不足，发酵液中蛋白含量成分偏低，最终的冻干粉的乳化性能偏弱。

表2 IC50(mg/mL)

表2列出了实施例1～11和对比例1～3分别制得的牡丹籽蛋白的抗氧化性能，其中“－”表示未检出。由表2可知，实施例1～11制得的牡丹籽蛋白的基于DPPH、ABTS+·、·OH和O2-·清除率的IC50均显著低于对比例1～3，说明本申请实施例1～11制得的牡丹籽蛋白具有更优的抗氧化性能。

具体而言，对比例1由于在种子培养基中并未使用牡丹籽粉，使得果生假丝酵母的种子液培养过程中氮源不足，从而导致果生假丝酵母生长受限，种子液活力不足，将此种活力不足的种子液接种即使含有牡丹籽粉的发酵培养基中进行培养，仍然导致发酵不足，使得最终制得的冻干粉的抗氧化性能与对比例3相当。而对比例2相对于实施例1，由于在发酵培养基中并未添加牡丹籽粉，同样使得发酵过程氮源不足，发酵液中蛋白含量成分偏低，最终的冻干粉的抗氧化性能偏弱，甚至不能抵抗DPPH、·OH和O2-·的氧化作用。

具体而言，相对于实施例1，实施例3～5在种子培养基中添加了NH

表3抑菌圈大于6mm时的最低样品液浓度

表3示出了实施例1～11和对比例1～3制得的牡丹籽蛋白冻干粉对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌实验结果，结果为平板抑菌圈大于6mm时的最低样品液浓度，其中“－”表示未检出。由表3可知，实施例1～11制得的牡丹籽蛋白冻干粉对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果显著优于对比例1～3。

具体而言，对比例1由于在种子培养基中并未使用牡丹籽粉，使得果生假丝酵母的种子液培养过程中氮源不足，从而导致果生假丝酵母生长受限，种子液活力不足，将此种活力不足的种子液接种即使含有牡丹籽粉的发酵培养基中进行培养，仍然导致发酵不足，使得最终制得的冻干粉的对金黄色葡萄球菌核大肠杆菌的抑菌性能均显著弱于实施例1。

而对比例2相对于实施例1，由于在发酵培养基中并未添加牡丹籽粉，同样使得发酵过程氮源不足，发酵液中蛋白含量成分偏低，对比例3仅仅对牡丹籽粉进行了蛋白提取，使得对比例2、3最终制得的冻干粉对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无抑菌性能(如图3所示)。结果上述对实施例1～11和对比例1～3制得的蛋白SDS-PAGE结果分析发现，由于对比例2中仅含有50KD蛋白组分，对比例3含有180KD、130KD、100KD、70KD和35KD，说明这些蛋白组分均与实施例1～11不同，从而导致其不具有抑菌作用。

为此，本申请利用上述制得的牡丹籽蛋白粉制作了一种酵母修复精华霜，该精华液具有缓解敏感症状、修复受损肌肤的作用。

为此，本申请公开了一种酵母修复精华霜，所述酵母修复精华霜按重量份计包含实施例1～11分别制得的牡丹籽蛋白冻干粉200～300份、栀子提取物50～80份、紫草提取物20～50份、草绿盐角草提取物20～50份、神经酰胺35～15份、裂裥菌素5～20份、1,3-丁二醇3～10份、1,2-戊二醇5～15份、白池花籽油20～50份和角鲨烷10～30份。其中，术语“份”可以指任意重量，仅用来区分上述组份之间的重量比例关系，并不对具体的重量产生限定作用。

为此，本申请实施例还公开了上述的酵母修复精华霜的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述的组方分为A相、B相和C相，A相包括5～15份神经酰胺3、5～20份裂裥菌素、3～10份1,3-丁二醇、5～15份1,2-戊二醇和水；B相包括50～80份栀子提取物、20～50份紫草提取物、20～50份草绿盐角草提取物、20～50份白池花籽油和10～30份角鲨烷；C相包括150～250份牡丹籽蛋白冻干粉；

(2)按照上述重量配比，将A相的药品依次加入至去离子水中，充分搅拌至澄清状，可在搅拌过程中于50～80℃温度范围内促进组方溶解，直至澄清透明随后降至室温，即得到A相溶液。

(3)向A相溶液中依次加入50～80份栀子提取物、20～50份紫草提取物和20～50份草绿盐角草提取物，依次B相组分充分分散和溶解。同样在分散和溶解过程中，可置于50～80℃温度条件中进行。

(4)向A相和B相的混合物中缓慢加入C相的150～250份牡丹籽蛋白冻干粉，于0.78W/cm

其中，涉及的相关物质来源为栀子提取物，斯诺特生物，CAS24512-63-8；紫草提取物，货号SNT1151，扶风斯诺特生物科技有限公司；草绿盐角草提取物，西安宜珺生物科技有限公司；神经酰胺3，CAS:100403-19-8，上海克琴科技有限公司；裂裥菌素，CAS:9050-67-3，BOC Sciences；白池花籽油，CAS:153065-40-8，四川省维克奇生物科技有限公司；角鲨烷，CAS:111-01-3，上海迈瑞尔化学技术有限公司。

一个具体的酵母修复精华霜的制备过程为：例如，准确称取10g神经酰胺3、15g裂裥菌素、10g 1,3-丁二醇和8g 1,2-戊二醇，溶解于2L去离子水中，直至溶液呈澄清状；于80℃水浴，0.78W/cm

为进一步验证本申请实施例公开的酵母修复精华霜的修复功能和相关功效，本申请将实施例1～11和对比例1～3分别制得的牡丹籽蛋白冻干粉均按照此酵母修复精华霜的实施过程，其中的A相、B相、C相的组方比例均相同，依次制得不同的酵母修复精华霜以作为相关修复动物实验的供试品，另外还将设置实施例1、对比例1、2和3分别提供的牡丹籽蛋白冻干粉分别作为对照组的对照品1～4。具体实验如下：

1、大鼠皮肤开放性损伤模型构建

雌性SD大鼠(货号J001，南京君科生物工程有限公司)，经无水乙醚麻醉后，用过毒的剃毛对大鼠背部件剃毛处理，在大鼠背部形成无毛区，可以进行多次处理，待新长出的毛发可揉磨脱毛膏再次处理，形成的无毛区，用消毒后的皮肤活检打孔器在无毛区打取3个直径6mm

2、分组实验

将上述构建的开放性皮肤损伤的SD大鼠分为模型组、实验组和对照组，另外设置正常的SD大鼠作为正常组。将实验组SD大鼠的无毛区开发损伤区分别涂抹以上述实施例1～11和对比例1～3分别制得的酵母修复精华霜，每一圆孔在生理盐水和酒精效果后涂抹约0.25g左右，对照组分别涂抹对照品1～4。正常组SD大鼠正常饲养不做处理。模型组SD大鼠在圆孔中的滴加生理盐水并进行消毒处理，防止感染即可。各组每日给药处理，连续给药直至伤口愈合，单笼饲养。

3、疤痕残留率测定

待各组大鼠无毛区的伤口愈合后，将圆孔的疤痕面积用相机拍照后描述在计算机中，计算其疤痕面积面积(如图4)，疤痕残留率＝疤痕面积/原始圆孔面积×100％，实验还统计各组大鼠伤口愈合的时间。

4、疤痕区域组织形态学观察

取各组大鼠无毛区的圆孔区域皮肤，于用％多聚甲醛溶液固定，经过乙醇梯度脱水处理，浸蜡和包埋后，进行HE染色，封片固定后，显微镜观察。

5、统计学分析

所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。

二、结果

表4

表4示出了各组大鼠的疤痕残留率和修复时间，“－”表示正常组未进行处理。相对于模型组，实施例1～11提供的酵母修复精华霜涂抹大鼠开放性损伤的圆孔后，其疤痕残留率均显著低于模型组，说明本申请实施例提供的酵母修复精华霜具有明显的开放性疤痕修复功能。而相对于模型组，对比例2、3提供的双侧修复精华霜对大鼠的开放性损伤圆孔无明显的疤痕修复作用，至少伤口愈合时间稍有降低。另外，本申请实施例1、对比例1～3制得的牡丹籽蛋白粉直接涂抹大鼠开放性损伤的圆孔伤口后，实施例1提供的牡丹籽蛋白粉具有明显的减少伤口愈合时间和对疤痕的修复作用，而对比例1～3无明显作用。

为此，本申请还对各组大鼠的愈合后伤口皮肤取样，制作石蜡切片，进行HE染色观察，结果如图5所示。图5中，虽然实验组提供的酵母修复精华霜和对照组提供的牡丹籽蛋白粉均对伤口愈合的皮肤中均有胶原纤维和毛细血管产生；但是实施例1提供的牡丹籽蛋白粉和酵母修复精华霜作用大鼠损伤皮肤后，其伤口皮肤表面平整，结构清晰，而且胶原纤维排列更加整齐和紧密，从而导致其新生表皮和原有皮肤有很好的贴合，疤痕修复效果更佳

综上，本申请实施例通过对牡丹籽进行深度开发，利用果生假丝酵母进行发酵制得了以牡丹籽蛋白粉，为以此牡丹籽蛋白为基础的酵母修复精华霜。该牡丹籽蛋白粉和酵母修复精华霜，相对于直接用牡丹籽提取的蛋白粉而言，具有更好的乳化性能和抗氧化性能，并且具有抑菌性能，制得酵母修复精华霜具有明显的加速愈合开放性伤口愈合，并具有修复愈合后疤痕的功效，具有在疤痕修复领域的应用前景。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。