抗-αVβ6抗体和抗体-药物偶联物

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月5日提交的美国临时申请第62/943,959号和2020年4月20日提交的美国临时申请第63/012,584号的权益，其各自通过引用其全部内容纳入本文用于所有目的。

关于序列表的引用

本申请包括2020年11月16日创建的名为AVB6-00212_ST25的文件的电子序列表并且含有52KB，其通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及新型抗-αvβ6抗体和抗体-药物偶联物及使用这种抗-αvβ6抗体和抗体-药物偶联物治疗癌症的方法。

背景技术

αvβ6，也称为α-vβ-6，其为结合胞外基质蛋白(例如纤连蛋白)的细胞粘附受体。αvβ6由αv亚基和β6亚基构成，在多种癌症中上调，包括非小细胞肺癌(NSCLC)。

NSCLC是最常见的肺癌类型。在过去的一年里，超过20万人被诊断为肺癌，这是癌症死亡的主要原因。因此，需要改进对于NSCLC的治疗方法。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物和科技文献，均通过引用整体并入本文，就好像每个单独的参考文献均已明确地和单独地指出通过引用并入。

发明内容

本文提供了抗αvβ6抗体和αvβ6导向的抗体-药物偶联物(ADC)。本文还提供了使用抗αvβ6导向的抗体和ADC来治疗表达αvβ6的疾病(包括癌症)的方法。优选的抗-αvβ6抗体包含SEQ ID NO：31、32和33的重链CDR序列和SEQ ID NO：37、42和39的轻链CDR序列，如Kabat编号确定的。

附图说明

图1显示了用各种抗αvβ6抗体进行LAP阻断ELISA试验的结果。

图2显示了用鼠抗体克隆2A2(称为m2A2)对表达人和猕猴(cyno)αvβ6的293F细胞进行饱和结合研究的结果。

图3显示了亲本鼠mAb(称为m2A2)重链可变区与选择的人种系受体(称为hIGHV1-46/HJ4)和人源化重链变体的氨基酸序列的比对。星号表示由Kabat确定的CDR，十字表示由IMGT确定的CDR。

图4显示了亲本鼠mAb(称为m2A2)轻链可变区与选择的人种系受体(称为hIGKV1D-33/KJ2)和人源化轻链变体的氨基酸序列的比对。星号表示由Kabat确定的CDR，十字表示由IMGT确定的CDR。

图5显示了在表达人αvβ6的293F细胞上用具有LA和LB轻链的人源化抗体和亲本鼠和嵌合抗体(分别称为m2A2和c2A2)的竞争结合研究结果。

图6显示了在表达人αvβ6的293F细胞上用具有HA和HC重链的人源化抗体和亲本鼠和嵌合抗体(分别称为m2A2和c2A2)的竞争结合研究结果。

图7显示了在表达人αvβ6的293F细胞上用人源化抗体子集和亲本鼠抗体(称为m2A2)进行竞争结合研究的重复结果。

图8显示了用h2A2 HCLG人源化抗体和亲本鼠抗体(称为m2A2)对表达人和猕猴αvβ6的293F细胞进行饱和结合研究的结果。

图9显示了在表达人和猕猴αvβ6的293F细胞上用HCLG人源化抗体和ADC的竞争结合研究结果。

图10显示了用h2A2 HCLG人源化抗体通过ELISA对人αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8进行αvβ6特异性结合研究的结果。

图11显示，h2A2 HCLG抗αvβ6 vcMMAE ADC对表达αvβ6的癌细胞系表现出体外细胞毒性。

图12显示了Detroit 562头颈癌细胞系在裸鼠中的异种移植研究结果。图上标示了剂量和方案。

图13显示了HPAFII胰腺癌细胞系在裸鼠中的异种移植研究结果。图上标示了剂量和方案。

图14显示了BxPC-3胰腺癌细胞系在裸鼠中的异种移植研究结果。图上标示了剂量和方案。

图15显示了SW780膀胱癌细胞系在裸鼠中的异种移植研究结果。图上标示了剂量和方案。

图16显示了六种NSCLC细胞系在裸鼠中进行PDX研究的结果。ADC以3mg/kg q7dx3的剂量给予。

图17显示了六种卵巢癌细胞系在裸鼠中进行PDX研究的结果。ADC以5mg/kg q7dx3的剂量给予。

图18显示了h2A2 HCLG和h15H3在两个细胞系异种移植模型中的比较结果。ADC以3mg/kg的剂量给予一次。

发明详述

I.定义

为了可以更好地理解本发明，首先定义某些术语。如本申请所用，除本文另有描述外，以下每个术语应具有如下含义。在整个申请中描述了额外定义。

本文所用术语“和/或”应被视作具体公开了两种特征或组分的每一种，伴随或不伴随另一种。因此，在例如本文的短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。类似地，在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一种：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

应理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包含”，“组成”和“基本上由......组成”方面和实施方式。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本公开所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，《生物医药和分子生物学简明词典》(Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRCPress)；《细胞和分子生物学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；和《牛津生物化学和分子生物学辞典》(OxfordDictionary OfBiochemistry And Molecular Biology)，修订，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，向技术人员提供了本公开使用的很多术语的常用词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。本文提供的标题不是本公开各种方面的限制，可以参考说明书整体理解本公开的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。

术语“αvβ6”“avb6”“α-vβ-6”或“β6”在本文中可互换使用，除非另有说明，其包括人αvβ6的任何变体、同种型和物种同系物，它们一般由细胞表达或在转染有αvβ6基因的细胞上表达。

术语″免疫球蛋白″表示这样的一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成：一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链，所有四条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已经被充分表征。参见例如《基础免疫学》(Fundamental Immunology)第7章(Paul，W.，编，第2版，瑞文出版社(RavenPress)，纽约(1989))。简言之，各重链通常包含重链可变区(本文中缩写为V

术语“可变区”或“可变结构域”指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为V

在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有在典型的生理条件下与抗原特异性结合的能力，其半衰期的时间很长，例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时(h)、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时(h)、约24小时或更多、约48小时或更多、约3、4、5、6、7或更多天等、或任何其他相关的功能性定义的时间段(如足以诱发、促进、增强和/或调节与抗体结合至抗原相关联的生理反应的时间和/或足以使抗体招募效应物活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的成分(如C1q)，这是补体激活的经典途径中的第一成分。抗体可以是双特异性抗体、双抗体、多特异性抗体或相似分子。

本文所用术语“单克隆抗体”指用单个一级氨基酸序列重组产生的抗体分子的制品，从小鼠B细胞融合产生。单克隆抗体组合物针对特定表位显示单一的结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”指表现出单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括B细胞，所述B细胞获得自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因或转染色体非人动物(如转基因小鼠)，与永生化细胞融合。

“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如与αvβ6特异性结合的分离的抗体基本上不含与αvβ6以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与αvβ6特异性结合的分离的抗体可以具有与其他抗原(例如来自不同物种的αvβ6分子)的交叉反应性。另外，分离的抗体可以基本不含其他细胞物质和/或化学物质。在一个实施方式中，分离的抗体包括附接至另一试剂(例如，小分子药物)的抗体偶联物。在一些实施方式中，分离的抗αvβ6抗体包括抗αvβ6抗体和小分子药物(例如，MMAE或MMAF)的偶联物。

“人抗体”(HuMAb)是指可变区中FR和CDR均源自人种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已被嫁接到人框架序列上。术语“人抗体”和“完全人抗体”是同义使用的。

本文所用术语“人源化抗体”指遗传工程改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和经修饰以包含与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可以通过将6个非人抗体互补决定区(CDR)(它们一起形成抗原结合位点)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可以帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包含非人CDR序列，主要是人框架区，任选地包含向非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，以及完全人恒定区。任选地，可以应用其他氨基酸修饰(不一定是回复突变)以获得具有优选特性(如亲和力和生化特性)的人源化抗体。

本文所用术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中可变区衍生自非人类物种(例如，衍生自啮齿动物)并且恒定区衍生自不同物种，如人类。嵌合抗体可以通过抗体工程改造产生。“抗体工程改造”是针对不同种类的抗体修饰的通用术语，并且是本领域技术人员所熟知的方法。具体地，通过使用如Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A laboratory Manual)，纽约：冷泉港实验室出版社，第15章中所述的标准DNA技术可以生成嵌合抗体。因此，嵌合抗体可以是遗传或酶工程改造的重组抗体。产生嵌合抗体在本领域技术人员的知识范畴内，并且因此，可以通过除本文所述之外的其他方法产生根据本发明的嵌合抗体。开发了用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体免疫原性。它们通常包含对感兴趣的抗原具有特异性的非人(例如，鼠)可变区，和人恒定抗体重链和轻链结构域。在嵌合抗体的上下文中使用的术语“可变区”或“可变结构域”指包含免疫球蛋白重链和轻链二者的CDR和框架区的区域。

“抗抗原抗体”指结合至抗原的抗体。例如，抗αvβ6抗体是结合至抗原αvβ6的抗体。

抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保特异性留结合至被该完整抗体结合的抗原的能力。抗体片段(如抗原结合片段)的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)

相对于参比肽序列的“序列同一性百分数(％)”定义为：比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参比多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑将任何保守性取代作为部分序列同一性。为测定氨基酸序列同一性百分比的比对有多种公知的方法，例如BLAST、BLAST-2、SnapGene Align或ClustalW BioEdit等公开的计算机软件。本领域技术人员能够确定用于比对序列的合适参数，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。例如，给定氨基酸序列A与、和或针对给定氨基酸序列B的序列同一性％(也可以替代地表述为与、和或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定序列同一性％的给定氨基酸序列A)如下所示计算：

分数X/Y的100倍

其中X是在该程序的A和B的比对中记为被序列等同匹配的氨基酸残基的数量，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的序列同一性％将不等于B与A的序列同一性％。

在抗体与预定抗原结合的上下文中，本文所用术语“结合”、“接合”或“特异性结合”通常是在通过例如生物层干扰量度法(BLI)技术于Octet HTX仪器中使用抗体作为配体并使用抗原作为分析物确定时这样的结合，所述结合的亲和力对应于约10

本文所用术语“K

术语“ADC”是指抗体-药物偶联物，其在本发明的上下文中指与本申请中所述的药物部分(例如，MMAE或MMAF)偶联的抗αvβ6抗体。

缩写“vc”和“val-cit”是指二肽缬氨酸-瓜氨酸。

缩写VKG是指三肽接头缬氨酸-赖氨酸-甘氨酸。

缩写“PAB”是指自毁型间隔物(self-immolative spacer)：

缩写“MC”是指延伸体(stretcher)马来酰亚胺基己酰基：

缩写“MP”是指延伸体(stretcher)马来酰亚胺基丙酰基：

如本文所用的“PEG单元”是由重复的亚乙基-氧基亚单元(PEG或PEG亚单元)构成的有机部分，可以是多分散的、单分散的或离散的(即具有离散数目的亚乙基-氧基亚单元)。多分散PEG是大小和分子量的异质混合物，而单分散PEG通常是从异质混合物中纯化的，因此提供了单一的链长度和分子量。优选的PEG单元包括离散PEG，即以分步方式而不是通过聚合过程合成的化合物。离散PEG提供具有确定和指定链长的单个分子。

本文提供的PEG单元包括一个或多个聚乙二醇链，每个聚乙二醇链由一个或多个亚乙基氧基亚单元构成，彼此共价附接。聚乙二醇链可以连接在一起，例如，以线性、支化的或星形构型。通常，在纳入喜树碱偶联物之前，至少有一条聚乙二醇链的一端被亲电基团取代的烷基部分衍生化，以共价附接至亚甲基氨基甲酸酯单元的氨基甲酸酯氮上(即代表R的一个例子)。通常，每个聚乙二醇链中不参与与接头单元其余部分共价附接的末端亚乙基氧基亚单元用PEG封端单元修饰，通常是任选地取代的烷基，如-CH

“癌症”指一大组各种各样的疾病，其特征是体内异常细胞的不受控制的生长。“癌症”或“癌组织”可包括肿瘤。不受控制的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，其侵入相邻组织，并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远端。转移后，远端肿瘤可以说是“源自”转移前肿瘤。

术语″抗体依赖性细胞毒性″，或ADCC，是一种诱导细胞死亡的机制，它取决于抗体包被的靶细胞与具有裂解活性的免疫细胞(也被称为效应细胞)的相互作用。这种效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞。效应细胞通过其抗原结合位点附接至与靶细胞结合的Ig的一个或多个Fc效应结构域上。由于效应细胞的活动，被抗体包被的靶细胞发生死亡。

术语″抗体依赖性细胞吞噬″，或ADCP，是指抗体包被的细胞全部或部分被与Ig的Fc效应结构域(一个或多个)结合的吞噬性免疫细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)所内化的过程。

术语″补体依赖性细胞毒性″，或称CDC，是指一种诱导细胞死亡的机制，其中与靶标结合的抗体的Fc效应结构域激活了一系列酶促反应，最终在靶细胞膜上形成孔。通常，抗原-抗体复合物，如抗体包被的靶细胞上的复合物，结合并激活补体成分Clq，这反过来又会激活补体级联，导致靶细胞死亡。补体的激活也可能导致补体成分在靶细胞表面沉积，通过结合白细胞上的补体受体(如CR3)促进ADCC。

″细胞抑制效应″是指细胞增殖的抑制。″细胞抑制剂″是指对细胞有细胞抑制作用的试剂，从而抑制特定细胞亚群的生长和/或扩增。细胞抑制剂可以偶联至抗体或与抗体组合给予。

对象的“治疗”或“疗法”是指对对象实施的任何类型的干预或过程，或向对象给予活性剂，其目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。在一些实施方式中，所述疾病是癌。

“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、以及啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠。在一些实施方式中，对象是人。术语“对象”和“患者”和“个体”在本文中可互换使用。

“有效量”或“治疗有效量”或“治疗有效剂量”的药物或治疗剂是任何量的药物，当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护对象免于疾病的发作或促进疾病消退，其由疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或者由于疾病的折磨而造成的障碍或残疾的预防来证明。可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评价治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间的人对象中，在预测人中的功效的动物模型系统中，或者通过在体外试验中测定该药剂的活性。

例如，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的对象(例如，一个或多个未治疗的对象)，治疗有效量的抗癌剂在经治疗的对象(例如，一个或多个经治疗的对象)中抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％、至少约99％的细胞生长或肿瘤生长。在一些实施方式中，相对于未治疗的对象(例如，一个或多个未治疗的对象)，治疗有效量的抗癌剂在经治疗的对象(例如，一个或多个经治疗的对象)中抑制100％的细胞生长或肿瘤生长。

在本公开的其他实施方式中，可以观察到肿瘤消退并且持续至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约60天的时间。

治疗有效量的药物(例如抗αvβ6抗体-药物偶联物)包括“预防有效量”，其是当单独或与抗癌剂联合给予有癌症发展的风险(如患有恶性前病症的对象)或因癌症的复发而受苦的对象时的药物的任何量，其会抑制癌症的发展或复发。在一些实施方式中，预防有效量完全防止癌症的发展或复发。“抑制”癌症的发展或复发是指降低癌症发展或复发的可能性，或者完全防止癌症的发展或复发。

如本文所用，“亚治疗剂量”是指低于单独给药以治疗过度增生性疾病(如癌症)时的治疗化合物(例如，抗-αvβ6抗体-药物偶联物)的常规或典型剂量的治疗化合物剂量。

″免疫相关缓解模式″指在经免疫治疗剂治疗的癌症患者中常常观察到的临床缓解模式，其通过诱导癌症特异性免疫反应或通过修饰天然免疫过程来产生抗肿瘤作用。该缓解模式的特征是最初增加肿瘤负荷或出现新病灶后的有益的治疗作用，在评估传统化学治疗剂时，其将被分类为疾病进展并将与药物失败同义。因此，正确评估免疫治疗剂可能需要长期监测这些治疗剂对靶疾病的作用。

举例来说，“抗癌剂”促进对象中的癌症消退。在一些实施方式中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的点。“促进癌症消退”是指单独或与抗癌剂组合给予有效量的药物可导致肿瘤生长或大小的减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、无疾病症状时期的频率和持续时间增加、或预防由于疾病的折磨而造成的障碍或残疾。此外，关于治疗的术语“有效”和“有效性”包括药理有效性和生理安全性。药理有效性是指药物促进患者中的癌症消退的能力。生理安全性是指由给药引起的细胞、器官和/或生物体水平上的毒性或其他不良生理反应(不良反应)。

“持续缓解”是指在停止治疗后在减少肿瘤生长方面的持续作用。例如，与给药阶段开始时的大小相比，肿瘤大小可以保持相同或较小。在一些实施方式中，持续缓解的持续时间与治疗持续时间至少相同，或者比治疗持续时间长至少1.5、2.0、2.5或3倍。

如本文所用，“完全缓解”或“CR”是指所有目标病灶消失；“部分缓解”或“PR”是指以基线SLD为参比，目标病灶的最长直径之和(SLD)至少减小30％；“稳定的疾病”或“SD”是指以自治疗开始以来最小的SLD为参比，目标病灶既未充分缩小以符合PR标准，又未充分增加以符合PD标准。

如本文所用，“无进展生存期”或“PFS”是指在治疗期间和之后的时间长度，在此期间所治疗的疾病(如癌症)不会恶化。无进展生存期可以包括患者经历完全缓解或部分缓解的时间，以及患者经历稳定的疾病的时间。

如本文所用，“总缓解率”或“ORR”是指完全缓解(CR)率和部分缓解(PR)率之和。

如本文所用，“总生存率”或“OS”是指一组个体中在特定时间段后可能存活的个体百分比。

短语“药学上可接受的”表示物质或组合物必须在化学和/或毒理学上与包含在制剂中的其他成分和/或与用其治疗的哺乳动物相容。

本文所用短语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性的盐包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、扑酸盐(即4.4’-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐)、碱金属(如钠和钾)盐、碱土金属(如镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可涉及包括另一种分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。该抗衡离子可以是任何能稳定亲本化合物上电荷的有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可以在其结构中具有超过一个的带电原子。药学上可接受的盐含多个带电原子的情况下可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。

“给药”或“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将治疗剂物理引入对象。抗αvβ6抗体-药物偶联物的示例性给药途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注(如静脉内输注)。本文所用短语“胃肠外给药”是指除肠道和局部给药外的给药形式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。可以通过非胃肠外途径或口服给予治疗剂。其他非胃肠外途径包括局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部给药。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行给药。

本文中可互换使用的术语“基线”或“基线值”可以指在给予疗法(如本文所述的抗-αvβ6抗体-药物偶联物)之前或在给予疗法开始时的症状的测量或表征。可以将基线值与参比值进行比较，以确定本文考虑的αvβ6相关疾病(例如癌)的症状的减轻或改善。本文中可互换使用的术语“参比”或“参比值”可以指在给予疗法(所述的抗αvβ6抗体-药物偶联物)后的症状的测评或表征。参比值可以在给药方案或治疗周期期间或在给药方案或治疗周期完成时测量一次或多次。“参比值”可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；一系列值；平均值；中值；均值；或与基线值相比的值。

类似地，“基线值”可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；一系列值；平均值；中值；均值；或与参比值相比的值。参比值和/或基线值可以从一个个体、两个不同个体或一组个体(如两个、三个、四个、五个或更多个体的组)获得。

本文所用术语“单一疗法”是指抗αvβ6抗体-药物偶联物是在治疗周期内给予对象的唯一抗癌剂。然而，也可以给予对象其他治疗剂。例如，可以在单一疗法期间给予患有癌症的对象抗炎剂或其他药剂，以治疗与癌症相关的症状而非潜在的癌症本身，包括例如炎症、疼痛、体重减轻和全身不适。

本文所用的“不良事件”(AE)是与药物治疗的使用相关联的任何不利且通常是意外或不希望的迹象(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。一种药物治疗可以具有一种或多种相关联的AE，而每种AE可以具有相同或不同水平的严重程度。提及能够“改变不良事件”的方法是指降低与使用不同治疗方案相关的一种或多种AE的发生率和/或严重程度的治疗方案。

本文所用的“严重不良事件”或“SAE”是满足下述标准之一的不良事件：

·致命或威胁生命(在严重不良事件的定义中使用的“威胁生命”是指事件发生时患者处于死亡风险中的事件；它不是指如果其更加严重的话假设可能会导致死亡的事件。

·导致持续或显著的残疾/失能

·构成先天性异常/出生缺陷

·是医学上很严重的，即定义为危害患者或可能需要医学或外科手术干预以防止上述转归之一的事件。在确定AE是否是“医学上很严重的”时必须进行医学和科学判断

·需要住院治疗或延长现有住院治疗，但以下情况除外：1)对潜在疾病的常规治疗或监测，不与任何病症恶化相关联；2)对已有病症的选择性或预先计划的治疗，所述病症与进行研究的适应症无关并且自签署知情同意书以来没有恶化，和3)在患者的总体状况没有任何恶化的情况下社会原因和暂停护理。

替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案之一、两者或它们的任意组合。如本文所用，不定冠词“一”或“一个”应理解为是指任何引用或列举的组分中的“一个或多个”。

术语“约”或“基本上包含”是指在本领域普通技术人员确定的特定数值或组成的可接受误差范围内的数值或组成，这将取决于该数值或组成的测量或确定方式，即测量体系的极限。例如，“约”或“基本上包含”可按本领域实践表示在1个标准偏差之内或大于1个标准偏差。或者，“约”或“基本上包含”可表示最高为20％的范围。此外，特别是就生物系统或过程而言，这些术语可表示最高为一个数量级或最高为一个数值的5倍。当在本申请和权利要求书中提供特定的值或组成时，除非另有说明，否则应假定“约”或“基本上包含”的含义在该特定的数值或组成的可接受误差范围内。

提及值或参数时的“约”包括(并公开)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

如本文所述，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。

在以下小节中进一步详细描述本公开的各个方面。

II.概述

本发明提供了特异性结合αvβ6的抗体。本发明部分基于这样的发现：靶向αvβ6的抗体-药物偶联物，包括vcMMAE抗体-药物偶联物，在杀死表达αvβ6+的细胞方面特别有效。αvβ6已被证明在多种癌症中表达，包括非小细胞肺癌(NSCLC)(鳞癌和腺癌)、头颈癌(包括头颈鳞癌)、食道癌、乳腺癌(包括乳腺侵袭性癌)、卵巢癌、膀胱癌(包括尿路上皮癌)、皮肤癌(鳞状细胞癌或SCC)、肾癌(包括肾透明细胞、肾乳头状细胞和肾嫌色细胞(kidneychromophobe))、宫颈癌、胃癌、前列腺癌(包括前列腺腺癌)、子宫内膜癌(包括子宫肉瘤和子宫内膜)、直肠腺癌、甲状腺癌、结肠腺癌、胃腺癌、和胰腺癌(包括胰腺腺癌)。

III.靶分子

除非另有说明，αvβ6指的是人αvβ6。示例性β6人序列是指定的GenBank登录号AAA36122。示例性αv人序列是指定的NCBI NP_002201.1。

IV.本发明的抗体

本发明提供了鼠2A2抗体，以及嵌合的、人源化的和人2A2抗体。

本发明的抗体(如小鼠2A2抗体的嵌合型、人源化和人形式)对人αvβ6的亲和力优选与小鼠2A2抗体对人αvβ6的亲和力相当，大于小鼠2A2抗体对人αvβ6的亲和力，或在10倍以内、5倍以内或在2倍以内弱于鼠抗体2A2对人αvβ6的亲和力。测量抗体对其靶抗原的亲和力的一种方法是通过确定抗体的表观解离常数。本发明包括具有与鼠2A2的常数基本相同(即在实验误差范围内)的表观解离常数的抗体(如嵌合的、人源化的和人形式的小鼠2A2抗体)，以及具有低于或高于鼠抗体2A2对人αvβ6的解离常数的抗体。嵌合的、人源化的和人2A2抗体和小鼠2A2抗体一样，特异性地结合至天然形式和/或从CHO细胞重组表达的人αvβ6。通常情况下，嵌合的、人源化的和人2A2抗αvβ6抗体与鼠2A2竞争与人αvβ6的结合。

本发明的优选抗体抑制癌症(如细胞的生长、转移和/或对生物体的致死性)，如在培养物、动物模型或临床试验中繁殖的癌细胞上所示。动物模型可以通过将表达αvβ6的人肿瘤细胞系植入适当的免疫缺陷啮齿动物品系，例如无胸腺裸鼠或SCID小鼠来形成。这些肿瘤细胞系可以在免疫缺陷的啮齿动物宿主体内建立为实体瘤，通过皮下注射，或通过静脉注射作为播散性肿瘤。一旦在宿主体内建立，这些肿瘤模型可用于评估实施例中所述的抗αvβ6抗体或其偶联形式的治疗效果。

通常，本公开的抗αvβ6抗体和/或抗αvβ6抗体-药物偶联物结合αvβ6(例如，人αvβ6)并对恶性细胞如癌细胞发挥细胞抑制和细胞毒性作用。本公开的抗αvβ6抗体优选地是单克隆的，并且可以是多特异性的，人、人源化或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段和上述任何一种的αvβ6结合片段。在一些实施方式中，本公开的抗αvβ6抗体特异性地结合αvβ6。本公开的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

在本公开的某些实施方式中，抗αvβ6抗体是本文所述的抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)，包括但不限于：Fab、Fab’和F(ab’)

本公开的抗αvβ6抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更大的多特异性。多特异性抗体可以对αvβ6的不同表位具有特异性，或者对αvβ6和异源蛋白都具有特异性。

本公开的抗αvβ6抗体可以根据它们所包含的特定CDR来描述或指定。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多已知方案中的任何一种编号来容易地确定，包括Kabat等，(1991)，《热门免疫学蛋白质序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，《抗体-抗原相互作用：接触分析和结合位点拓扑图》(Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding site topography)，J.Mol.Biol.262，732-745.(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等，《免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的唯一IMGT编号》(IMGT unique numbering forimmunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-likedomains)，Dev Comp Immunol，2003 Jan；27(1)：55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A，《免疫球蛋白可变结构域的另一个编号方案：自动建模和分析工具》(Yetanother numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automaticmodeling and analysis tool)，J Mol Biol，2001 Jun 8；309(3)：657-70，(“Aho”编号方案)；以及Martin等，《建模抗体高变环：组合算法》(Modeling antibody hypervariableloops：a combined algorithm)，PNAS，1989，86(23)：9268-9272，(“AbM”编号方案)描述的方案。给定CDR的边界可以变化，取决于用于鉴定的方案。在一些实施方式中，给定抗体或其区域(例如，其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖由任何上述方案定义的(或特定的)CDR。例如，当描述特定的CDR(如CDR-H3)包括给定的V

在一个实施方式中，本文所述的抗αvβ6抗体和抗αvβ6抗体-药物偶联物的CDR序列是根据Kabat编号方案。在另一个实施方式中，本文所述的抗αvβ6抗体和抗αvβ6抗体-药物偶联物的CDR序列是根据IMGT编号方案。

一方面，本文提供包括重链可变区和轻链可变区的抗αvβ6抗体，其中所述重链可变区包括：(i)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2，以及(iii)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中所述轻链可变区包括：(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-L3；其中，所述抗αvβ6抗体的CDR由Kabat编号方案定义。在其他实施方式中，CDR-L1包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在其他实施方式中，CDR-L2包含SEQ ID NO：38或41的氨基酸序列。

一方面，本文提供包括重链可变区和轻链可变区的抗αvβ6抗体，其中所述重链可变区包括：(i)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2，以及(iii)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中所述轻链可变区包括：(i)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；其中，所述抗αvβ6抗体的CDR由IMGT编号方案定义。

本文所述的抗αvβ6抗体可以包含任何合适的框架可变结构域序列，只要抗体保留与αvβ6(如人αvβ6)结合的能力。在本文所述的抗αvβ6抗体的一些实施方式中，重链和轻链可变结构域分别包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在本文所述的抗αvβ6抗体的一些实施方式中，重和轻链分别包含SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：29的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本文提供抗αvβ6抗体和/或抗αvβ6抗体-药物偶联物，其包括包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施方式中，包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域相对于参比序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失并且保留结合至αvβ6(例如，人αvβ6)的能力。在某些实施方式中，SEQ ID NO：6中总计有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在其他实施方式中，SEQ ID NO：6中总计有3至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方式中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在CDR内的区域。在某些实施方式中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在CDR之外的区域(即FR中)。在一些实施方式中，抗αvβ6抗体包括含有序列的翻译后修饰的SEQ ID NO：6的重链可变结构域序列。

在一些实施方式中，本文提供抗αvβ6抗体和/或抗αvβ6抗体-药物偶联物，其包括包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些实施方式中，包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域相对于参比序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失并且保留结合至αvβ6(例如，人αvβ6)的能力。在某些实施方式中，SEQ ID NO：17中总计有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在其他实施方式中，SEQ ID NO：17中总计有1至2个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方式中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在CDR之外的区域(即FR中)。在一些实施方式中，抗αvβ6抗体包括含有序列的翻译后修饰的SEQ ID NO：17的轻链可变结构域序列。

有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有记作α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α类进一步分为亚类，例如人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以以称为同种异型的多种多态变体存在(在Jefferis和Lefranc 2009 mAbsVol 1Issue 41-7中综述)，其中任何一种都适合用于本文的一些实施方式中。人群中常见的同种异型变体是由字母a、f、n、z或其组合指示的变体。在本文的任何实施方式中，抗体可以包括重链Fc区，其包含人IgG Fc区。在另一些实施方式中，人IgG Fc区包含人IgG1。

本发明的抗体还包括经修饰的衍生物，即，通过任何类型的分子与抗体的共价附接而被修饰，以使得共价附接不会阻止抗体结合至αvβ6或对HD细胞发挥细胞抑制或细胞毒性作用。例如但不限于，抗体衍生物包括已经修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质连接等。通过已知技术可进行多种化学修饰中的任一种，包括但不限于：特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。

人源化抗体

人源化抗体是遗传工程改造的抗体，其中来自非人″供体″抗体的CDR被植入人″受体″抗体序列(见例如Queen，US5,530,101和5,585,089；Winter，US 5,225,539；Carter，US6,407,213；Adair，US 5,859,205；和Foote，US 6,881,557)。受体抗体序列可以是，例如，成熟的人抗体序列，这种序列的组合，人类抗体序列的共有序列，或种系区域序列。重链的优选受体序列是：种系V

虽然人源化抗体通常包含全部6个来自小鼠抗体的CDR(优选由Kabat定义)，也可以用少于全部的(例如至少3、4或5个)来自小鼠抗体的CDR制备(例如Pascalis第J.Immunol.169：3076，2002；Vajdos等，Journal of Molecular Biology，320：415-428，2002；Iwahashi等，Mol.Immunol.36：1079-1091，1999；Tamura等，Journal of Immunology，164：1432-1441，2000)。

可选择人可变区框架残基的一些氨基酸基于其可能的对CDR构型和/或与抗原结合的影响进行取代。对这种可能的影响的调查是通过建模、检查特定位置的氨基酸的特征，或对特定氨基酸的取代或定点诱变的作用进行经验观察。

例如，当氨基酸在鼠可变区框架残基和选定的人可变区框架残基之间存在差异时，人框架氨基酸可以被来自小鼠抗体的等同的框架氨基酸取代，当合理地预期该氨基酸会：

(1)非共价地直接结合抗原，

(2)邻近CDR区，

(3)以其他方式与CDR区相互作用(例如在CDR区的约6A内)；或

(6)介导重链和轻链之间的相互作用。

尽管2A2抗体被鉴定为小鼠抗体，但本申请也包括人2A2抗体。术语“人2A2抗体”是指源自人免疫球蛋白基因序列的抗体，其CDR与鼠2A2抗体的CDR基本相同，并显示出类似的特性，即特异性结合至αvβ6。在一些方面，人2A2抗体包括与本文所述的重链可变区基本相同的重链可变区和/或与本文所述的轻链可变区基本相同的轻链可变区。在一些实施方式中，本发明的2A2抗体不是人抗体，例如，本发明的2A2抗体是鼠、嵌合的或人源化抗体。

本发明的一方面提供小鼠抗体2A2的人源化形式。一种这样的小鼠抗体2A2的人源化变体被命名为HCLG。HCLG包括含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的成熟重链可变区和含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的成熟轻链可变区。本发明的人源化抗体包括HCLG人源化抗体的变体，其中人源化重链成熟可变区显示出与SEQ ID NO：6至少90％、95％或99％的同一性，人源化轻链成熟可变区显示出与SEQ ID NO：17至少90％、95％或99％的序列同一性。优选地，在这样的抗体中，部分或全部保留HCLG中的回复突变。换言之，重链位置H2、H28、H48、H67、H69、H71、H73、H78和H93中至少1、2、3、4、5、6、7、8或优选全部9个位置分别被F、S、I、A、L、V、K、A和T占据。同样地，位置L69优选被R占据，L71优选被Y占据。CDR区可以由任何常规定义(例如Chothia)来定义，但优选由Kabat或IMGT定义。在一个实施方式中，人源化抗体包括含有SEQ ID NO：6的3个CDR的重链和与SEQ ID NO：6的可变区框架至少95％同一性的可变区框架。在另一实施方式中，人源化抗体包括含有SEQ ID NO：17的3个CDR的轻链和与SEQID NO：17的可变区框架至少95％同一性的可变区框架。在其他实施方式中，人源化抗体包括含有SEQ ID NO：6的3个CDR的重链和与SEQ ID NO：6的可变区框架至少98％同一性的可变区框架，以及含有SEQ ID NO：17的3个CDR的轻链和与SEQ ID NO：17的可变区框架至少95％同一性的可变区框架。在一个实施方式中，人源化抗体包括含有SEQ ID NO：6的3个CDR的重链和与SEQ ID NO：6的可变区框架至少99％同一性的可变区框架。在另一实施方式中，人源化抗体包括含有SEQ ID NO：17的3个CDR的轻链和与SEQ ID NO：17的可变区框架至少99％同一性的可变区框架。

一种可能的变化是用人CDR序列中的相应残基取代小鼠抗体CDR中的某些残基，通常来自设计示例人源化抗体中使用的人受体序列的CDR。在一些抗体中，只有部分CDR，即结合所需的CDR残基子集，称为SDR，需要在人源化抗体中保持结合。不接触抗原和不在SDR中的CDR残基可以根据以前的研究(例如CDR H2中的H60-H65残基通常是不需要的)，从位于Chothia超变环之外的Kabat CDR区(Chothia，J.Mol.Biol.196：901，1987)，通过分子建模和/或经验，或如Gonzales等人，Mol.Immunol.41：863(2004)中所述鉴定。在这样的人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在的位置或整个供体CDR被省略的位置，占据该位置的氨基酸可以是在受体抗体序列中占据相应位置的氨基酸(通过Kabat编号)。在CDR中用这种受体取代供体氨基酸的数量反映了各种竞争性因素的平衡。这种取代在减少人源化抗体中小鼠氨基酸的数量方面有潜在的优势，从而降低了潜在的免疫原性。然而，取代也会导致亲和力的改变，优选避免亲和力的显著降低。CDR内的取代位置和要取代的氨基酸也可以根据经验来选择。

虽然不是优选的，但也可以进行其他的氨基酸取代，例如，在不与CDR接触的框架残基中，甚至是CDR内的一些潜在的CDR接触残基氨基酸中。通常，在变体人源化序列中进行的替换是相对于被替换的HCLG氨基酸而言保守的。优选地，相对于HCLG的替换(无论是否保守)对人源化mAB的结合亲和力或效力(即其结合人αVβ6和抑制癌细胞生长的能力)没有实质性影响。

恒定区的选择

人源化抗体的重链和轻链可变区可以连接至人恒定区的至少一部分。恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性。例如，人同种型IgG1和IgG3具有强烈补体依赖性细胞毒性，人同种型IgG2具有弱补体依赖性细胞毒性而人IgG4缺乏补体依赖性细胞毒性。人IgGl和IgG3也比人IgG2和IgG4诱导出更强的细胞介导的效应物功能。轻链恒定区可以是λ或κ。抗体可以表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体，也可以表达为分离的重链、轻链，如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv，或者表达为单链抗体，其中重链和轻链可变结构域通过间隔子连接。

人恒定区在不同个体之间显示出同种异型变异(allotypic variation)和同族同种异型变异(isoallotypic variation)，也就是说，恒定区在不同个体中可以在一个或多个多态位置上有所不同。同族同种异型(isoallotype)与同种异型不同之处在于识别同族同种异型的血清与一个或多个其他同种型的非多态性区结合。

在轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，如重链的C-末端赖氨酸，可以在一部分或全部分子中缺失或衍生化。在恒定区中可进行取代以减少或增加效应物功能，例如补体介导的细胞毒性或ADCC(见例如Winter等美国专利号5,624,821；Tso等，美国专利号5,834,597；和Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005，2006)，或延长人中的半衰期(见例如Hinton等，J.Biol.Chem.279：6213，2004)。

示例性的取代包括在氨基酸位置234、235、237、239、267、298、299、326、330或332引入天然氨基酸替换为半胱氨酸残基，优选人IgGl同种型的S239C突变(US 20100158909)。额外半胱氨酸残基的存在允许链间二硫键的形成。这种链间二硫键的形成会造成空间位阻，从而降低Fc区-FcyR结合相互作用的亲和力。在IgG恒定区的Fc区内或邻近引入的一个或多个半胱氨酸残基也可以作为与治疗剂偶联的位点(即使用硫醇特异性试剂(如药物的马来酰亚胺衍生物)偶联细胞毒性药物。治疗剂的存在会造成空间位阻，从而进一步降低Fc区-FcyR结合相互作用的亲和力。在234、235、236和/或237的任何位置上的其他取代会降低对Fey受体的亲和力，特别是FcyRI受体(参见，例如US 6,624,821，US 5,624,821)。

抗体的体内半衰期也会影响其效应物功能。抗体的半衰期可以增加或减少以改变其治疗活性。FcRn是一种结构上类似于MHC I类抗原的受体，与β2-微球蛋白非共价缔合。FcRn调节IgG的分解代谢和其在组织间的转包吞作用(Ghetie和Ward，2000，Annu.Rev.Immunol.18：739-766；Ghetie和Ward，2002，Immunol.Res.25：97-113)。IgG-FcRn的相互作用发生在pH 6.0(胞内囊泡的pH)，而不是pH 7.4(血液的pH)；这种相互作用使IgG能够被回收到循环中(Ghetie和Ward，2000，Ann.Rev.Immunol.18：739-766；Ghefie和Ward，2002，Immunol.Res.25：97-113)。人IgG1上参与FcRn结合的区域已经被定位(Shields等人，2001，J.Biol.Chem.276：6591-604)。人IgGl的Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382或Asn434位置上的丙氨酸取代增强FcRn结合(Shields等，2001，J.Biol.Chem.276：6591-604)。含有这些取代的IgG1分子具有更长的血清半衰期。因此，与未修饰的IgGl相比，这些修饰的IgGl分子能够在更长的时间内执行其效应物功能，从而发挥其疗效。其他增加结合至FcRn的示例性取代包括250位的Gln和/或428位的Leu。在恒定区的所有位置都使用EU编号。

与保守的Asn297共价附接的寡糖与IgG的Fc区与FcyR结合的能力有关(Lund等，1996，J.Immunol.157：4963-69；Wright和Morrison，199′，Trends Biotechnol.15：26-31)。在IgG上工程改造这种糖型可以显著改进IgG介导的ADCC。将二等分N-乙酰葡萄糖胺修饰(Umana等，1999年，1999，Nat.Biotechnol.17：176-180；Davies等，2001，Biotech.Bioeng.74：288-94)加入到该糖型或从该糖型去除岩藻糖(Shields等，2002，J.Biol.Chem.277：26733-40；Shinkawa等，2003，J.Biol.Chem.278：6591-604；Niwa等，2004，Cancer Res.64：2127-33)是IgG Fc工程改造的两个例子，其改善了IgG Fc和FcyR之间的结合，从而增强了Ig介导的ADCC活性。

人IgG1 Fc区的溶剂暴露氨基酸的系统取代产生了具有改变的FcyR结合亲和力的IgG变体(Shields等，2001，J.Biol.Chem.276：6591-604)。与亲本IgG1相比，这些变体中涉及Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334或Ser298/Glu333、Lys334取代为Ala的子集显示对FcγR的结合亲和力和ADCC活性都有所增加(Shields等，2001，J.Biol.Chem.276：6591-604；Okazaki等，2004，J.Mol.Biol.336：1239-49)。

抗体的补体结合活性(complement fixation activity)(包括Clq结合和CDC活性)可以通过Lys326和Glu333的取代来改进(Idusogie等，2001，J.Immunol.166：2571-2575)。在人IgG2骨架上进行同样的取代可以将与Clq结合较差且严重缺乏补体激活活性的抗体同种型转化为既能结合Clq又能介导CDC的抗体同种型(Idusogie等，2001，J.Immunol.166：2571-75)。其他一些方法也被用于改善抗体的补体结合活性。例如，将IgM的18个氨基酸的羧基端尾件(tail piece)移接到IgG的羧基端上，可大大增强其CDC活性。即使是用通常没有检测到CDC活性的IgG4也能观察到这一点(Smith等，1995，J.Immunol.154：2226-36)。另外，用Cys取代位于IgG 1重链羧基末端附近的Ser444，诱导IgG 1的尾对尾二聚化，CDC活性比单体IgG1增加200倍(Shopes等，1992，J.Immunol.148：2918-22)。此外，具有Clq特异性的双特异性二抗构建体也具有CDC活性(Kontermann等，1997，Nat.Biotech.15：629-31)。

通过将重链318、320和322中的至少一个氨基酸残基突变为具有不同侧链的残基，如Ala，可以降低补体活性。其他烷基取代的非离子残基，如Gly、He、Leu或Val，或例如Phe、Tyr、Trp和Pro等芳香族非极性残基代替这三个残基中的任何一个，也会减少或废除Clq的结合。Ser、Thr、Cys和Met可以用在残基320和322，但不能用在318，以减少或废除Clq的结合活性。

用极性残基替代318(Glu)残基可能会改变但不会废除Clq的结合活性。用Ala替代297(Asn)残基，导致去除裂解活性，但只略微降低(约弱三倍)对Clq的亲和力。这种改变破坏了糖基化位点和补体激活所需的碳水化合物的存在。该位点的任何其他取代也会破坏糖基化位点。以下突变及其任何组合也会减少Clq的结合：D270A、K322A、P329A和P31 IS(见WO06/036291)。L234A/L235A突变(或LALA突变)也会减少C1q的结合，以及FcyR的结合。

提到人恒定区包括具有任何天然同种异型的恒定区或在天然同种异型中占据多态位置的残基的任何排列。另外，相对于天然的人恒定区来说，可能存在多达1、2、5或10个突变，如上面提到的那些，以减少FcT受体结合或增加与FcRN的结合。

V.重组抗体的表达

人源化抗体通常是通过重组表达产生的。重组多核苷酸构建体通常包括与抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，包括天然相伴的或异源的启动子区。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体被纳入适当的宿主，宿主就被维持在适合核苷酸序列高水平表达的条件下，并收集和纯化交叉反应的抗体。

哺乳动物细胞是表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的优选宿主。见Winnacker，《从基因到克隆》(From Genes to Clones)，(VCH出版公司，NY，1987)。本领域已开发了许多能分泌完整异源蛋白质的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系(例如DG44)、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生的骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)。优选地，细胞是非人的。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起始点，启动子，增强子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点，RNA剪切位点，聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是源自内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦表达，可根据本领域标准程序纯化抗体，包括HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等(一般见Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)(施普林格出版社，NY，1982))。

VI.核酸

本发明进一步提供了编码上述任何人源化重链和轻链的核酸。通常，该核酸还编码融合至成熟重链和轻链的信号肽。核酸上的编码序列可以与调节序列可操作地连接，以确保编码序列的表达，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以以分离的形式出现，或者可以被克隆到或多个载体中。这些核酸可以通过例如固态合成或重叠寡核苷酸的PCR合成。编码重链和轻链的核酸可以作为一个连续的核酸被接合，例如，在表达载体内，也可以是分离的，例如各自克隆到自己的表达载体中。

在一些方面，本文还提供编码本文所述的抗αvβ6抗体或其抗原结合片段的核酸。本文还提供包含编码本文所述的抗αvβ6抗体或其抗原结合片段的核酸的载体。本文还提供表达编码本文所述的抗αvβ6抗体或其抗原结合片段的核酸的宿主细胞。本文还提供包含载体的宿主细胞，该载体包含编码本文所述的抗αvβ6抗体或其抗原结合片段的核酸。

本文所述的抗αvβ6抗体可以使用众所周知的表达载体系统和宿主细胞通过众所周知的重组技术制备。在一个实施方式中，抗体在CHO细胞中使用GS表达载体系统制备，如De la Cruz Edmunds等，2006，Molecular Biotechnology 34；179-190、EP216846、美国专利第5,981,216号、WO 87/04462、EP323997、美国专利第5,591,639号、美国专利第5,658,759号、EP338841、美国专利第5,879,936号和美国专利第5,891,693号中所述。

本文所述的单克隆抗αvβ6抗体例如可以通过首先由Kohler等，Nature，256，495(1975)中描述的杂交瘤方法来制造，或者可以通过重组DNA方法来制造。单克隆抗体也可以采用例如Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222(3)：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。单克隆抗体可以从任何合适的来源获得。因此，例如单克隆抗体可以从用感兴趣的抗原免疫的小鼠获得的鼠脾脏B细胞制备的杂交瘤获得，所述感兴趣的抗原例如以在表面上表达抗原的细胞或编码感兴趣的抗原的核酸的形式。单克隆抗体也可以从来源于经免疫的人或非人哺乳动物(，如大鼠、狗、灵长类等)的表达抗体的细胞的杂交瘤获得。

VII.抗体-药物偶联物

抗αvβ6抗体可以偶联至细胞毒性或细胞抑制部分(包括其药学上兼容的盐)，形成抗体-药物偶联物(ADC)。特别适合与抗体偶联的部分是细胞毒性剂(例如化疗剂)、前药转化酶、放射性同位素或化合物或毒素(这些部分统称作治疗剂)。例如，抗αvβ6抗体可与细胞毒性剂，例如化疗剂，或毒素(例如细胞抑制或杀细胞剂如相思豆毒素A、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)偶联。

抗αvβ6抗体可以与前药转化酶偶联。前药转化酶可以与抗体重组融合，或用已知方法化学偶联。示例性前药转化酶是羧肽酶G2、β-葡萄糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。

将治疗剂与蛋白质，特别是与抗体偶联的技术是众所周知的。(参见，例如，Arnon等，《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)中″单克隆抗体用于癌症疗法中药物的免疫靶向(Monoclonal Antibodies For Immunotargefing OfDrugs In Cancer Therapy)，″(Reisfeld等编，ARL公司(Alan R.Liss，Inc.)，1985)；Hellstrom等，《控释药物递送》(Controlled Drug Delivery)中″用于药物递送的抗体(Antibodies For Drug Delivery)，″(Robinson等编，马赛尔·德克尔公司，第二版1987)；Thorpe，《单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies)′84：生物学和临床应用(Biological AndClinical Applications)中″癌症疗法中细胞毒性剂的抗体运载体：综述(AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review)，″(Pinchera等编，1985)；《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy)中″在癌症治疗中放射性标记抗体的治疗性用途的分析、结果和未来展望(Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy)，″(Baldwin等编，学术出版社，1985)；和Thorpe等，1982，Immunol.Rev.62：119-58.另参见，例如，PCT公开WO 89/12624)。

治疗剂可以除非从抗体上裂解下来(例如通过水解，通过抗体水解降解，或通过裂解剂)，否则活性减弱的方式偶联。这种治疗剂由可裂解接头附接至抗体上，该可裂解接头在表达αvβ6的癌细胞的细胞内环境中对裂解敏感，但对细胞外环境基本不敏感，从而当抗体被表达αvβ6的癌细胞内化时(例如在内体中，或例如借助pH值敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境或小窝(caveolear)环境中)，该偶联物就从抗体上被裂解下来。

通常ADC包括治疗剂和抗αvβ6抗体之间的接头区。如上所述，通常，接头在胞内条件下是可裂解的，从而，接头的裂解可将治疗剂从胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝内)的抗体上释放出来。接头可以是例如这样的肽基接头，其被胞内肽酶或蛋白酶裂解，包括溶酶体或内体蛋白酶。通常，肽基接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。裂解剂可以包括组织蛋白酶(cathepsin)B和D以及纤溶酶(plasmin)(例如，见Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123)。最典型的是可被表达αvβ6的细胞中存在的酶裂解的肽基接头。例如，可以使用将被癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解的肽基接头(例如，包括Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽的接头)。其他这种接头描述于，例如，美国专利号6,214,345中。在具体实施方式中，胞内蛋白酶可裂解的肽基接头包括Val-Cit接头或Phe-Lys二肽(参见例如，美国专利号6,214,345，其描述了用Val-Cit接头合成多柔比星)。使用治疗剂的胞内蛋白水解释放的一个优点是当偶联时该试剂通常被减弱并且偶联物的血清稳定性通常很高。

可裂解接头可以具有pH敏感性，即某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感性接头在酸性条件下可水解。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville等，1989，Biol.Chem.264：14653-14661.)。这样的接头在中性pH条件(例如血液中那些)下相对稳定，但是在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH值)时不稳定。在某些实施方式中，可水解接头是硫醚接头(如通过酰腙键附接治疗剂的硫醚(参见例如，美国专利号5,622,929))。

其他接头在还原条件下是可裂解的(例如，二硫接头)。二硫接头包括那些可以用SATA(N-琥珀酰亚胺-S-硫代乙酰基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的接头。(参见，例如，Thorpe等，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等，在《免疫偶联物：癌症的放射成像和治疗中的抗体偶联物(Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery andTherapy of Cancer)》(C.W.Vogel编，牛津大学出版社，1987.另见美国专利号4,880,935)。

接头还可以是丙二酸接头(Johnson等，1995，Anticancer Res.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(maleimidobenzoyl linker)(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。接头还可以是丙二酸接头(Johnson等，1995，Anticancer Res.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。

接头也可以是不可裂解接头，例如直接附接至治疗剂(如药物)的马来酰亚胺-亚烷基-或马来酰亚胺-芳基接头。活性药物-接头通过抗体的降解而释放。

该接头可促进细胞内化。当与治疗剂偶联时(即在本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境中)，接头可以促进细胞内化。或者，当与治疗剂和抗αvβ6抗体偶联时(即在本文所述的ADC的环境中)，接头可以促进细胞内化。

抗αvβ6抗体可以通过抗体的杂原子与接头偶联。这些杂原子可以以天然状态存在于抗体上，也可以被引入到抗体中。在一些方面，抗αvβ6抗体将通过赖氨酸残基的氮原子偶联至接头。在其他方面，抗αvβ6抗体将通过半胱氨酸残基的硫原子偶联至接头。半胱氨酸残基可以是天然存在的，也可以是被工程改造到抗体中的。通过赖氨酸和半胱氨酸残基将接头和药物-接头偶联至抗体的方法在本领域是已知的。

示例性的抗体-药物偶联物包括基于奥瑞他汀的抗体-药物偶联物(即，药物成分是奥瑞他汀药物)。奥瑞他汀结合微管蛋白，已被证明可干扰微管动力学和核及细胞分裂，并具有抗癌活性。通常情况下，基于奥瑞他汀的抗体-药物偶联物包括奥瑞他汀药物和抗αvβ6抗体之间的接头。该接头可以是，例如，可裂解的接头(例如，肽基接头，碳水化合物接头)或不可裂解的接头(例如，通过抗体的降解释放的接头)。奥瑞他汀包括(但不限于)奥瑞他汀T、MMAF和MMAE。美国公开号7,659,241、7,498,298、2009-0111756、2009-0018086和7,968,687中描述了示例性奥瑞他汀的合成和结构，其各自通过引用全部内容纳入本文用于所有目的。

示例性的基于奥瑞他汀的抗体药物偶联物包括vcMMAE(或1006)、vcMMAF和mcMMAF抗体药物偶联物，如下所示，其中p代表药物负载，Ab是本文所述的抗αvβ6抗体，val-cit或“vc”代表缬氨酸-瓜氨酸二肽：

或其药学上可接受的盐。药物负载用p表示，即每个抗体的药物-接头分子数。参照靶向αvβ6的抗体-药物偶联物，下标p代表药物负载，根据上下文，可以代表附接至单个抗体分子上的药物-接头分子的数量，因此是整数值，或者可以代表平均药物负载，因此可以是整数或非整数值，但通常是非整数值。平均药物负载代表群体中每个抗体的药物-接头分子的平均数量。通常，但不总是，当我们提到抗体，例如单克隆抗体时，我们指的是抗体分子群体。在由抗体-药物偶联物分子群体构成的组合物中，平均药物负载是重要的质量特征，因为它决定了可以被递送到靶细胞的药物量。组合物中未偶联的抗体分子的百分比被包括在平均药物负载值中。

在本发明的优选方面，当提及由抗体-药物偶联物化合物群体构成的组合物时，平均药物负载为1至约16，优选约2至约14，更优选约2至约10。在一个实施方式中，DAR是约2至约5。在另一个实施方式中，DAR是4。在另一个实施方式中，DAR是约6至约10。在另一个实施方式中，DAR是8。制剂中各抗体的平均药物数可以通过常规手段表征，例如质谱、HIC、ELISA试验和HPLC。在一些方面，抗αvβ6抗体通过抗体的半胱氨酸残基附接至药物-接头。在一些方面，该半胱氨酸残基是被工程改造到抗体中的。在其他方面，该半胱氨酸残基是链间二硫半胱氨酸残基。

在一些实施方式中，将聚乙二醇聚合物作为侧链纳入到可裂解的β-葡糖苷酸MMAE药物-接头中，与非PEG化的对照相比，在异种移植模型中，抗体-药物偶联物的血浆清除率降低，抗肿瘤活性提高。因此，用于附接至本发明的抗体的特别有利的药物-接头如下式V所示：

或其药学上可接受的盐。

这种药物-接头的优选立体化学如下式Va所示：

或其药学上可接受的盐，其中对于式V和Va，Z代表具有能够与抗体上的官能团反应形成共价附接其上的反应位点的有机部分，n的范围是8至36，最优选的范围是8至14(最优选12)，R

优选的Z部分是含马来酰亚胺的部分。特别优选的Z部分如下面的药物-接头中所示：

或其药学上可接受的盐。

这种药物-接头的优选立体化学如下所示：

或其药学上可接受的盐，其中对于式VI、VIa、VII和VIIa，n的范围是8至36，最优选的范围是8至14(最优选12)，R

如上所述，R

如上所述，R

对于MMAE PEG化的ADC，如本文例举的那些，特别优选的平均药物负载约为8。在示例性的实施方式中，药物-接头偶联至还原的链间二硫化物的半胱氨酸残基。在一些方面，抗体-药物偶联物化合物群体中单个抗体分子的实际药物负载为1至10(或6至10或6至8)，主要的药物负载为8。例如，除了链间二硫化物，如果药物-接头偶联至引入的半胱氨酸残基(例如，根据EU标引，在239位引入的半胱氨酸残基)，则可以实现更高的药物负载。

示例性的ADC包括以下：

或其药学上可接受的盐，其中n在8至36之间，最优选在8至14之间(，最优选12)，R

如上所述，药物接头的PEG(聚乙二醇)部分可以为8至36，然而，已经发现特别优选12个环氧乙烷单元的PEG。已经发现，较长的PEG链会导致清除较慢，而较短的PEG链则会导致活性降低。因此，上述所有实施方式中的下标n优选为8至14、8至12、10至12或10至14，最优选为12。

可以使用多分散PEG、单分散PEG和离散PEG来制备本发明的PEG化抗体药物偶联物。多分散PEG是大小和分子量的异质混合物，而单分散PEG通常是从异质混合物中纯化的，因此提供了单一的链长度和分子量。优选的PEG单元是离散PEG，即以分步方式而不是通过聚合过程合成的化合物。离散PEG提供具有确定和指定链长的单个分子。与下标″p″一样，当提及抗体-药物偶联物的群体时，下标″n″的值可以是平均数，可以是整数或非整数。

在优选的实施方式中，抗体与药物-接头的共价附接是通过抗体的巯基官能团与药物接头的马来酰亚胺官能团相互作用形成硫代琥珀酰亚胺而完成的。巯基官能团可以以配体的天然状态存在于配体单元上，例如，在天然存在的残基中(链间二硫化物残基)，或者可以通过化学修饰或生物工程改造引入配体，或两者的组合。应理解，抗体取代的琥珀酰亚胺可以以一种或多种水解形式存在。例如，在优选的实施方式中，ADC包含琥珀酰亚胺部分，当键合至抗体时，其表示为结构：

或包含它相应的酸-酰胺部分，当键合至抗体时，其表示为结构：

波浪线表示与药物-接头的剩余部分的连接。

在一些实施方式中，本发明的抗αVβ6抗体通过MDpr-PEG(12)-gluc接头偶联至单甲基奥瑞他汀E，形成抗体-药物偶联物具有结构：

或其药学上可接受的盐，其中n在8至36之间，最优选在8至14之间(最优选12)，R

示例性的抗体-药物偶联物还包括基于喜树碱(camptothecin)的抗体-药物偶联物(即，药物成分是喜树碱药物)。喜树碱是拓扑异构酶抑制剂，已被证明具有抗癌活性。通常情况下，基于喜树碱的抗体-药物偶联物包括喜树碱药物和抗αvβ6抗体之间的接头。该接头可以是，例如，可裂解的接头(例如，肽基接头，碳水化合物接头)或不可裂解的接头(例如，通过抗体的降解释放的接头)。PCT/US19/025968(2019年4月5日提交)中描述了示例性喜树碱药物-接头的合成和结构，其通过引用全部内容纳入本文用于所有目的。

示例性的抗αvβ6抗体药物偶联物包括如下的喜树碱抗体药物偶联物，其中p代表药物负载，Ab代表抗αvβ6抗体：

在一些实施方式中，喜树碱ADC具有式(IC)：

或其药学上可接受的盐；

其中

Ab是抗-αvβ6抗体；

Y是1、2、3或4，或是1或4；以及

Z是2至12的整数，或是2、4、8或12；

并且p是1-16。

在这些实施方式的一些方面，p是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些方面，p是2、4或8。

在一些实施方式中，喜树碱ADC具有式：

或其药学上可接受的盐；

其中p是2、4或8，优选p是8。

在一些实施方式中，喜树碱ADC具有式：

或其药学上可接受的盐：

其中p是2、4或8，优选p是8。

在一些实施方式中，喜树碱药物-接头具有式：

或其药学上可接受的盐；

其中

y是1、2、3或4，或是1或4；以及

z是2至12的整数，或是2、4、8或12。

在一些实施方式中，喜树碱药物-接头具有式：

MP-PEG8-VKG-喜树碱

在一些实施方式中，喜树碱药物-接头具有式：

MP-PEG4-VKG-喜树碱

在一些实施方式中，喜树碱药物-接头具有式：

MP-PEG12-VKG-喜树碱

其他示例性抗体-药物偶联物包括美登素类(maytansinoid)抗体-药物偶联物(即药物成分是美登素类药物)，和苯二氮

在一些实施方式中，用于本发明的PBD二聚体由式I表示。PBD二聚体的优选的立体化学示于式Ia：

或该盐的药用盐、溶剂化物或溶剂合物；其中下标n为1或3。

式(I)和(Ia)的溶剂合(化)物通常是通过在一个或两个PBD单体的亚胺官能团上加水或醇溶剂形成一种或多种甲醇胺(carbinolamine)和/或甲醇胺醚。例如，在N10-C11位置，可以有亚胺(N＝C)，甲醇胺(NH-CH(OH))，或甲醇胺醚(NH-CH(OMe))，如下式I′和Ia′所示：

其中，或：

(a)R

(b)R

(c)R

式I或la的PBD二聚体(或其药用盐、溶剂化物或溶剂合物)通常通过接头单元LU连接至抗体。接头单元作用以在靶位点(例如，在癌细胞内)释放式I或la的PBD二聚体(或其药用盐、溶剂化物或溶剂合物)。用于本发明的PBD药物-接头化合物由式II表示(优选如Ila所示的立体化学)，其中LU是接头单元。接头单元可以是，例如，可裂解的肽接头单元(例如，包括缬氨酸-丙氨酸肽的接头)或可裂解的二硫化物接头单元：

或该盐的药用盐、溶剂化物或溶剂合物；其中下标n为1或3。

用于本发明的优选的PBD药物-接头化合物由下式III表示：

或该盐的药用盐、溶剂化物或溶剂合物；其中下标n为1或3，下标m为2至5的整数。

PBD药物-接头偶联至抗αVβ6抗体，产生靶向αVβ6的抗体-药物偶联物。例如，该抗体可以偶联至式II或式III的药物-接头。示例性的靶向αVβ6的抗体-药物偶联物示于以下式IV、IVa和IVb：

或该盐的药用盐、溶剂化物或溶剂合物；其中下标n为1或3；下标m为2至5的整数；且下标p为1至4。

偶联至抗αVβ6抗体的有用的细胞毒性剂类别包括，例如，抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、化疗增敏剂等。其他示例性的细胞毒性剂类别包括蒽环类、奥瑞他汀类、喜树碱类、多卡霉素类、依托泊苷类、美登素类(maytansinoids)和长春花生物碱类。一些示例性的细胞毒性剂包括奥瑞他汀类(如奥瑞他汀T、奥瑞他汀E、AFP、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、亲脂性单甲基奥瑞他汀F、单甲基奥瑞他汀E(MMAE))、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类(enediynes)和来红毒素类(lexitropsins)，多卡霉素类，紫杉烷类(例如紫杉醇和多西他赛)，长春花生物碱类，烟酰胺磷酸核苷转移酶抑制剂(NAMPTi)，微管蛋白裂解素M，多柔比星、吗啉代-多柔比星和氰基吗啉代-多柔比星。

细胞毒性剂可以是化疗剂，例如，多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素C或依托泊苷。该试剂也可以是CC-1065类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、尾海兔素10的类似物、根瘤菌素(rhizoxin)或海葵毒素(palytoxin)。

细胞毒性剂也可以是奥瑞他汀。奥瑞他汀可以是奥瑞他汀E衍生物，例如，奥瑞他汀E和酮酸之间形成的酯。例如，奥瑞他汀E能够与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应分别生成AEB和AEVB。其他典型的奥瑞他汀包括奥瑞他汀T、AFP、MMAF和MMAE。各种奥瑞他汀的合成和结构描述于，例如US 2005-0238649和US2006-0074008。

细胞毒性剂可以是DNA小沟结合剂。(参见例如，美国专利号6,130,237。)例如，小沟结合剂可以是CBI化合物或烯二炔(例如，卡奇霉素)。

细胞毒性或细胞抑制剂可以是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的例子包括紫杉烷类(例如

细胞毒性剂可以是美登素类、另一组抗微管蛋白剂(例如，DM1、DM2、DM3、DM4)。例如，美登素类可以是美登素或包含美登素的药物接头，例如DM-1或DM-4(ImmunoGen，Inc.；也可参见Charr等，1992，Cancer Res.)。

VIII.治疗性应用

本发明的抗体，单独或作为其抗αvβ6抗体-药物偶联物，可用于治疗癌症。一些这样的癌症显示出可检测到的αvβ6水平，其为在蛋白质(例如，通过使用例举的抗体之一进行免疫分析)或mRNA水平上测量的。一些这样的癌显示出相对于同一类型的(优选是来自同一患者的)非癌组织αVβ6的水平有所提高。适于治疗的癌细胞上αVβ6的示例性水平是每个细胞5000-500,000个αVβ6分子，尽管更高或更低的水平也可以被治疗。任选地，在进行治疗之前，测量癌中αvβ6的水平。

与αvβ6表达有关并适于治疗的癌症的例子包括非小细胞肺癌(NSCLC)(鳞癌和腺癌)、头颈癌(包括头颈鳞癌)、食道癌、乳腺癌(包括乳腺侵袭性癌)、卵巢癌、膀胱癌(包括尿路上皮癌)、皮肤癌(鳞状细胞癌或SCC)、肾癌(包括肾透明细胞、肾乳头状细胞和肾嫌色细胞(kidney chromophobe))、宫颈癌、胃癌、前列腺癌(包括前列腺腺癌)、子宫内膜癌(包括子宫肉瘤和子宫内膜)、直肠腺癌、甲状腺癌、结肠腺癌、胃腺癌、和胰腺癌(包括胰腺腺癌)。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗NSCLC的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗头颈癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗皮肤癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗食道癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗乳腺癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗卵巢癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗膀胱癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗宫颈癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗胃癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗肾癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗子宫内膜癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗胃癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗胰腺癌的方法。该治疗可应用于具有这些种类的原发性或转移性肿瘤的患者。该治疗方法也可应用于对常规治疗难治性的患者，或对此类治疗有缓解后复发的患者。

以有效方案给予本发明的抗体(例如人源化抗体，单独或作为其偶联物)，指的是延迟癌症的的发病、降低严重程度、抑制进一步恶化和/或减轻至少一个迹象或症状的剂量、给药途径和给药频率。如果患者已经患有癌症，该方案可以被称为治疗有效方案。如果患者相对于普通群体来说患癌症的风险升高，但还没有出现症状，则可将该方案称为预防有效方案。在一些情况下，相较于历史对照或同一患者过去的经验，可以在个体患者身上观察到治疗或预防的效果。在其他情况下，在临床前或临床试验中，相较于未接受治疗的患者的对照群体，可以证明治疗或预防效果。

单克隆抗体的示例性剂量为0.1mg/kg至50mg/kg患者体重，更通常为1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、或1mg/kg至10mg/kg 1、或2mg/kg至30mg/kg、2mg/kg至20mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至12mg/kg、或2mg/kg至10mg/kg、或3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至12mg/kg或3mg/kg至10mg/kg。单克隆抗体或其抗体药物偶联物的示例性剂量为1mg/kg至7.5mg/kg、或2mg/kg至7.5mg/kg或3mg/kg至7.5mg/kg的对象体重、或0.1-20、或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)或10-1500或200-1500mg作为固定剂量。在一些方法中，患者被给予至少1.5mg/kg，至少2mg/kg或至少3mg/kg的剂量，每三周或更长时间给予一次。剂量取决于给药的频率、患者的状况和对先前治疗的缓解(如有)，治疗是预防性的还是治疗性的，以及疾病是急性的还是慢性的，以及其他因素。

给药方式可以是肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌肉内。也可以直接肿瘤局部给药。优选通过静脉或皮下给予进入全身循环。静脉给予可以通过例如30-90分钟的输注或单次推注的方式进行。

给药的频率取决于抗体或偶联物在循环中的半衰期、患者的状况和给药途径等因素。频率可以是每日、每周、每月、每季度，或根据患者情况的改变或要治疗的癌症的进程改变的不规律间隔。静脉内给药的示范性频率是在连续的治疗期内一周两次到每季度一次之间，虽然也可以是更高或更低频率。静脉给药的其他示例性频率是在连续治疗过程中每周一次或每四周三次之间，虽然也可以是更高或更低的给药频率。对于皮下给药，示例性的给药频率是每天到每月，虽然也可以是更高或更低的给药频率。

给予的剂量数量取决于癌症的性质(例如，是否出现急性或慢性症状)和对治疗的疾病缓解。对于急性病症或慢性病症的急性恶化，1-10剂通常足够。有时对于急性病症或慢性病症的急性恶化，单次推注剂量(也可选择分次)是足够的。对于急性疾病的复发或急性恶化，可以重复治疗。对于慢性疾病，可以以规律间隔给药，如每周、每两周、每月、每季度、每六个月，持续至少1年、5年或10年，或患者的一生。

用于肠胃外给药的药物组合物优选是无菌的，基本上是等渗的，并在GMP条件下生产。药学组合物可以单位剂型(即单次给药剂量)提供。药学组合物可用一种或多种生理上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂配制。制剂取决于选择的给药途径。为了注射，抗体可配制在水性溶液中，优选在生理上相容的缓冲液例如Hank溶液，Ringer溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射位点的不适)。溶液中可以包含配制试剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是冻干形式，用于在使用前用合适的载剂(例如无菌无热原的水)构建。液体制剂中的抗体浓度可以是例如1-100mg/ml，例如10mg/ml。

用本发明的抗体治疗可以与化疗、放疗、干细胞治疗、手术等对被治疗的疾病有效的治疗结合。可与本文所述的αvβ6的抗体和抗体-药物偶联物一起给予的其他有用的试剂类别包括，例如，在癌细胞上表达的其他受体的抗体、抗微管蛋白剂(如奥瑞他汀)、DNA小沟粘合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(如铂类复合物，如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂复合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂类、抗代谢剂类、化疗增敏剂类、多卡霉素类、依托泊苷类、氟化嘧啶类、离子团类、来红毒素类(lexitropsins)、亚硝基脲类、顺铂类(platinols)、预成化合物类(pre-forming compound)、嘌呤抗代谢物类、嘌呤霉素类、放射增敏剂类、类固醇类、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂类、长春花生物碱类等。

用抗αvβ6抗体或抗体-药物偶联物治疗，任选地与上述任何其他药物或方案单独或作为抗体-药物偶联物组合使用，可增加肿瘤患者的中位无进展生存期或总生存时间(如非小细胞肺癌(NSCLC)(鳞癌和腺瘤)、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌)、食道癌、乳腺癌(包括乳腺侵袭性癌)、卵巢癌、膀胱癌(包括尿路上皮癌)、皮肤癌(鳞状细胞癌或SCC)、肾癌(包括肾透明细胞、肾乳头状细胞和肾嫌色细胞)、宫颈癌、胃癌、前列腺癌(包括前列腺腺癌)、子宫内膜癌(包括子宫肉瘤和子宫内膜)、直肠腺癌、甲状腺癌、结肠腺癌、胃腺癌和胰腺癌(包括胰腺腺癌))，特别是当复发或难治时，与相同的治疗方法(如化疗)但没有单独的或作为偶联物的抗αvβ6抗体相比，增加至少30％或40％，但优选50％、60％至70％，或甚至100％或更长。此外或替代地，包括单独或作为偶联物的抗αvβ6抗体的治疗(如标准化疗)可以使肿瘤患者的完全缓解率、部分缓解率或客观缓解率(完全+部分)与同样的治疗(如化疗)但没有单独或作为偶联物的抗αvβ6抗体相比增加至少30％或40％，但优选50％、60％至70％或甚至100％。

通常，在临床试验(如II期、II/III期或III期试验)中，相对于单独接受标准疗法(或加安慰剂)的患者对照组，用标准疗法加单独或作为偶联物的抗αvβ6抗体治疗的患者的上述中位无进展生存期和/或缓解率的增加是统计学显著的，例如在p＝0.05或0.01甚至0.001水平。完全和部分缓解率是由癌症临床试验中常用的客观标准确定的，例如，由美国国家癌症研究所和/或食品和药物管理局列出或接受的标准。

IX.制品和试剂盒

在另一方面，提供制品或试剂盒，其包括本文所述的抗αvβ6抗体或抗αvβ6抗体-药物偶联物。该制品或试剂盒可以进一步包括在本发明的方法中如本文所述的抗αvβ6抗体或抗αvβ6抗体-药物偶联物的使用的说明书。因此，在某些实施方式中，该制品或试剂盒包括在治疗对象的癌症的方法中使用如本文所述的抗αvβ6抗体或抗αvβ6抗体-药物偶联物的说明书，所述癌症如非小细胞肺癌(NSCLC)(鳞癌和腺瘤)、头颈癌(包括头颈鳞癌)、食道癌、乳腺癌(包括乳腺侵袭性癌)、卵巢癌、膀胱癌(包括尿路上皮癌)、皮肤癌(鳞状细胞癌或SCC)、肾癌(包括肾透明细胞、肾乳头状细胞和肾嫌色细胞)、宫颈癌、胃癌、前列腺癌(包括前列腺腺癌)、子宫内膜癌(包括子宫肉瘤和子宫内膜)、直肠腺癌、甲状腺癌、结肠腺癌、胃腺癌和胰腺癌(包括胰腺腺癌)，包括给予对象有效量的本文所述的抗αvβ6抗体或抗αvβ6抗体-药物偶联物。在一些实施方式中，癌症是NSCLC。在优选实施方式中，所述癌症是头颈癌。在一些实施方式中，所述癌症是食道癌。一些实施方式中，癌症是乳腺癌。在一些实施方式中，癌症是卵巢癌。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗肾癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗子宫内膜癌的方法。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体-药物偶联物被用于治疗胃癌的方法。在一些实施方式中，所述癌症是膀胱癌。在一些实施方式中，所述癌症是皮肤癌。在一些实施方式中，所述癌症是宫颈癌。一些实施方式中，癌症是胃癌。在一些实施方式中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，对象是人。

制品或试剂盒可以进一步包括容器。合适的容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，单室或双室注射器)和试管。在一些实施方式中，容器是小瓶。该容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器装有制剂。

制剂或试剂盒可以进一步包括位于容器上或与容器相连的标签或包装插页，可以指示配制和/或使用制剂的指导。该标签或包装插页可进一步表明该制剂用于或意在用于皮下、静脉内(如静脉输注)或其他给药方式，来治疗对象的癌症(例如非小细胞肺癌(NSCLC)(鳞癌和腺癌)、头颈癌(包括头颈鳞癌)、食道癌、乳腺癌(包括乳腺侵袭性癌)、卵巢癌、膀胱癌(包括尿路上皮癌)、皮肤癌(鳞状细胞癌或SCC)、肾癌(包括肾透明细胞、肾乳头状细胞和肾嫌色细胞)、宫颈癌、胃癌、前列腺癌(包括前列腺腺癌)、子宫内膜癌(包括子宫肉瘤和子宫内膜)、直肠腺癌、甲状腺癌、结肠腺癌、胃腺癌、胰腺癌(包括胰腺腺癌))。装有制剂的容器可以是一次性小瓶或多次使用的小瓶，允许重复给予重建的制剂。制品或试剂盒还可以包括包含合适的稀释剂的第二容器。制品或试剂盒还可以包括从商业、治疗和用户角度出发期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明书的包装插页。

任选地，本文的制品或试剂盒还包括含有第二药物的容器，其中抗αvβ6抗体或抗αvβ6抗体-药物偶联物是第一药物，并且该制品或试剂盒还包括用于以有效量使用第二药物治疗对象的位于标签或包装插页上的说明书。在一些实施方式中，第二药物用于消除或减少一个或多个不良事件的严重程度。

在一些实施方式中，抗αvβ6抗体或抗αvβ6抗体-药物偶联物以冻干粉末形式存在于容器中。在一些实施方式中，冻干粉末置于气密性密闭容器、例如小瓶、安瓿或小药袋中，标明活性剂的量。通过注射给予药物时，例如可任选地提供一安瓿的无菌注射用水或盐水作为试剂盒的一部分，以便在给药前与药物成分混合。如果需要，这样的试剂盒还可以包括各种常规药物试剂盒组分中的一种或多种，例如具有一种或多种药学上可接受的运载体的容器、其他容器等，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。试剂盒中也可以包括印刷的说明书，作为插页或标签，标明要给予的组分的量、给药指导、和/或混合组分的指南。

X.其它应用

本文所述的抗αvβ6抗体，如人源化抗αvβ6抗体，可用于在临床诊断或治疗或研究的情况中检测αvβ6。癌症上αvβ6的表达提供了指征，表明该癌症可以用本发明的抗体治疗。该抗体也可以作为研究试剂出售，用于实验室研究，检测负荷αvβ6的细胞及其对各种刺激的反应。在这种用途中，单克隆抗体可以用荧光分子、白旋标记的分子、酶或放射性同位素标记，并且可以以试剂盒的形式提供，具有进行αvβ6测定的所有必要试剂。本文所述的抗体，可用于检测αvβ6蛋白表达，并确定癌症是否适合用αvβ6 ADC治疗。

上文或下文引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等等，通过引用全部内容纳入本文用于所有目的，其程度与每个单独的项被专门而单独地表示以引用方式纳入的程度相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则指在本申请的有效申请日与登录号相关联的版本。有效申请日是指实际申请日或提及登录号的优先权申请日(如适用)中较早的。同样地，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间公布，除非另有说明，指的是在本申请有效申请日最新公布的版本。除非特别指出，本发明的任何特征、步骤、元素、实施方式或方面都可以与其他任何其他组合使用。虽然出于方便理解的目的，通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于所附权利要求书的范围。

实施例

材料

下面实施例中所述的细胞系维持在美国典型培养物保藏中心(ATCC)、美国国家癌症研究所(NCI)或德国布伦瑞克的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)(DMSZ)特别指出的条件的培养物中。SW780细胞系、Detroit 562细胞系、HPAFII细胞系和BxPC3细胞系从ATCC获得。FreeStyle

方法：

2A2抗体的产生

ICR(CD-1)小鼠用腹膜内注射～5x10

LAP阻断ELISA

96孔微量滴定板(Nunc)在4℃下用0.3ug/mL重组人潜伏相关肽(latency-associated peptide)(rhuLAP)(内部制作；批次09-19-09DS)在1x PBS中包被过夜。去除包被液后，用3％BSA在Tris-缓冲盐水(TBS)中封闭平板，在室温下封闭一小时，然后在使用前用PBS+0.05％Tween-20(PBST)洗涤5次。在分离的锥形底部96孔板中，将0.25ug/mL的重组人(rhu)αvβ6-生物素(内部制作的rhuαvβ6-生物素，批号171030A)与含有1mM CaCl

竞争结合试验-人源化的2A2抗体变体

竞争结合试验是使用293F：huβ6细胞系进行的。在冰上将0.1x10

竞争结合试验--人和猕猴αvβ6

竞争结合试验使用293F：huβ6和HEK293F：cynoβ6细胞系进行。在冰上将0.1x10

αvβ6饱和结合试验--人和猕猴αvβ6

饱和结合研究是使用以下表达抗原的细胞系进行的：293F：huβ6和293F：cynoβ6。将0.1x10

ELISA

96-孔Maxisorb板(Nunc)在4℃下用稀释在50mM碳酸盐缓冲液(西格玛公司(Sigma)密苏里州)中的1ug/ml的重组人αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8(R&D系统公司，明尼苏达州)包被过夜。用PBS+0.05％Tween 20(PBS-T)洗涤平板。去除洗涤缓冲液，在室温下用TBS封闭缓冲液(TBS，0.05％Tween 20，1％BSA)封闭平板2小时。洗涤平板，然后用稀释在TBS结合缓冲液(TBS，0.05％Tween 20，1％BSA，1mM MnCl

定量流式细胞仪分析

使用鼠αvβ6 mAb作为一抗，并按照制造商(DAKO A/S，丹麦格洛斯楚普自治市)的说明，使用DAKO QiFiKit流式细胞仪间接测定，并使用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪，对细胞表面的αvβ6拷贝数进行评估。

体外细胞毒性实验

肿瘤细胞与抗αvβ6抗体药物偶联物在37℃下孵育96小时。使用

抗体-药物偶联物的生产

如US20050238649和WO2015/057699中所述，制备了抗αvβ6抗体的抗体-药物偶联物。药物接头vcMMAE(也称为1006)和mcMMAF均在US20050238649中描述，其通过引用纳入本文用于所有目的。药物接头MDpr-Lys(PEGx)-葡糖苷酸-MMAE接头在WO2015/057699中描述，其通过引用纳入本文用于所有目的。

体内活性研究

在细胞系衍生的异种移植的治疗实验中，将5x10

除了细胞系衍生的异种移植，使用冠军肿瘤公司(Champions Oncology)(新泽西州哈肯萨克河)维护的模型研究了h2A2 vcMMAE ADC对非小细胞肺癌(NSCLC)患者衍生的异种移植(PDX)模型的抗肿瘤活性。这些PDX模型包括腺样和鳞状组织学的NSCLC样品。这些模型是通过植入免疫低下的小鼠体内建立的，并允许其生长到150-300mm

h2A2 vcMMAE ADC的抗肿瘤活性在冠军肿瘤公司(Champions Oncology)(新泽西州哈肯萨克河)维护的卵巢癌PDX模型中进一步评估。这些模型是通过植入免疫低下的小鼠体内建立的，并允许其生长到150-300mm

结果

鼠克隆m2A2从杂交瘤小组中被选中，因为它作为ADC对多种αvβ6阳性肿瘤细胞系显示出细胞毒性活性，而且它对人和猕猴形式的抗原具有相当的亲和力。小鼠2A2的特异性在FMAT和流式细胞仪结合研究中得到证实，其中抗体被证明能结合至293F：huβ6转染子，但不能结合至αvβ5阳性的亲本系(293F：载体)。整合素avb6已被证明是纤连蛋白(Weinacker等，1994)、生腱蛋白(Prieto等，1993)、玻连蛋白(Huang等，1998)和潜伏相关肽(LAP)(Munger等，1999)中RGD位点的受体。整合素avb6与LAP的结合可以诱导转化生长因子β1(TGFb)的空间位阻性激活(Munger等，1999)。进行了潜伏相关肽(LAP)阻断试验(图1)，显示m2A2(SG-44.2A2)不能阻断LAP，与抗αvβ6抗体m15H3(SG-42.15H3)(见WO2013/123152)和阳性对照10D5相反。这表明，可以不依赖于配体结合递送2A2抗体。阴性对照是不结合的IgG对照，SG-44.8B9、SG-33.20B8、SG-44.32A6和SG-44.34D6是从杂交瘤小组中选出的其他克隆。

小鼠抗体的结合

通过使用基因工程改造的细胞系(293F：huβ6，293F：cynoβ6)进行饱和结合研究，确定鼠单克隆抗体2A2对人和猕猴αvβ6的结合EC50(图2)。基因工程改造的细胞系表达内源性αv，它与重组β6链配对，产生由内源性αv和重组β6构成的异二聚体受体。

人源化抗体的设计和选择

本实施例中人源化的起点或供体抗体是鼠2A2抗体。使用了由IGHV1-46和IGHJ4提供的重链的基因组序列和由IGKV1D-33和IGKJ2提供的轻链的基因组序列。

在人源化过程中，在重链框架中鉴定了10个位置(H2、H28、H48、H67、H69、H71、H73、H74、H78、H93；图3)，在轻链框架中确定了两个位置(L69和L71；图4)，在这些位置上人的受体序列与供体序列不同，可能会影响抗体的结合，因为直接接触抗原，影响CDR的构象或影响重链和轻链之间的包装。四个人源化重链变体(vHA、vHB、vHC、vHD；图3)和八个人源化轻链变体(vLA、vLB、vLC、vLD、vLE、vLF、vLG、vLH；图4)是在这些位置的不同排列中纳入回复突变制成。表1-4列出了这些回复突变的情况。其余的框架位置由人受体序列的残基占据。

表1：h2A2重链变体的人源化突变

表2：h2A2重链变体的特定鼠框架突变

表3：h2A2κ轻链变体的人源化突变

表4：h2A2κ轻链变体的特定鼠框架突变

然后人源化抗体被表达出来，代表这些人源化重链和轻链变体的组合排列。图5-7显示了所产生的人源化抗体变体(与鼠2A2抗体和人-鼠嵌合抗体一起)与人αvβ6的竞争结合曲线。四个人源化变体被选为用于在体外活性试验中进一步分析。人源化变体HCLE、HCLG、HCLH、HALG和人源化抗αvβ6抗体15H3-HTLC(各自都偶联至药物-接头.Via，n＝12，R

表5：体外活性试验(x50，nM)

包含重链变体hvHC和轻链变体hvLG(h2A2 HCLG)的人源化变体被选择用于进一步研究。

h2A2 HCLG与人和猕猴αvβ6的结合是通过饱和结合来确认的(图8)，其中包括亲本鼠2A2作为参照，以证明其与人源化变体的结合相当。h2A2 HCLG与人和猕猴αβ6的结合也通过与荧光标记的鼠2A2的竞争结合证实(图9)。该试验还包括用h2A2 HCLG和SGD-5088药物-接头制备的ADC的结合，通过减少抗体链间二硫化物并与药物-接头的8个拷贝偶联。偶联过程对人或猕猴的αvβ6的结合没有任何影响。h2A2 HCLG的结合特异性也被ELISA证实，其中该抗体结合至重组人αvβ6，但不结合至αvβ1、αvβ3、αvβ5或αvβ8(图10)。

h2A2 ADC的体外抗癌活性

人源化变体HCLG偶联至vcMMAE时的体外抗癌活性是用细胞毒性试验基于定量流式细胞仪分析在四种表达不同水平αvβ6的细胞系(胰腺癌HPAFII和BxPC-3细胞、头颈癌Detroit 562细胞和膀胱癌SW780细胞)中测定的。图11显示，人源化的2A2抗αvβ6 ADC在这些试验中表现出了细胞杀伤力。

h2A2 ADC的体内抗癌活性

使用体外测试的相同的四个细胞系，证明了与vcMMAE偶联的人源化2A2 HCLG抗体(每个抗体平均4个药物)在体内的抗肿瘤活性(图12-15)。与未治疗和非结合对照ADC相比，观察到显著的肿瘤生长延迟或肿瘤消退。h2A2 HCLG-1006(4)是指亲本鼠抗体2A2的HCLG人源化形式的抗体药物偶联物，每个抗体平均有4个vcMMAE药物接头分子。h00-1006(4)是指非结合对照抗体的抗体药物偶联物，每个抗体平均有4个vcMMAE药物接头分子。

在NSCLC的PDX模型中，与vcMMAE偶联的人源化2A2 HCLG抗体(每个抗体平均有4个药物)也显示出抗肿瘤活性(图16)。与未治疗和非结合对照ADC相比，观察到显著的肿瘤生长延迟或肿瘤消退。h2A2 HCLG-1006(4)是指亲本鼠抗体2A2的HCLG人源化形式的抗体药物偶联物，每个抗体平均有4个vcMMAE药物接头分子。h00-1006(4)是指非结合对照抗体的抗体药物偶联物，每个抗体平均有4个vcMMAE药物接头分子。

在卵巢癌的PDX模型中，与vcMMAE偶联的人源化2A2 HCLG抗体(每个抗体平均有4个药物)也显示出抗肿瘤活性(图17)。与未治疗的肿瘤相比，观察到显著的肿瘤生长延迟或轻微的肿瘤减少。h2A2 HCLG-1006(4)是指亲本鼠抗体2A2的HCLG人源化形式的抗体药物偶联物，每个抗体平均有4个vcMMAE药物接头分子。

当与药物-接头VIa(n＝12，R

序列

SEQ ID NO：1-m2A2 vH

SEQ ID NO：2-mIGHV1-39(最接近的鼠种系V-基因)

SEQ ID NO：3-hIGHV1-46/HJ4

SEQ ID NO：4-h2A2 vHA

SEQ ID NO：5-h2A2 vHB

SEQ ID NO：6-h2A2 vHC

SEQ ID NO：7-h2A2 vHD

SEQ ID NO：8-m2A2 vL

SEQ ID NO：9-mIGKV12-89(最接近的鼠种系V-基因)

SEQ ID NO：10-hIGKV1D-33/KJ2

SEQ ID NO：11-h2A2 vLA

SEQ ID NO：12-h2A2 vLB

SEQ ID NO：13-h2A2 vLC

SEQ ID NO：14-h2A2 vLD

SEQ ID No：15-h2A2 vLE

SEQ ID NO：16-h2A2 vLF

SEQ ID NO：17-h2A2 vLG

SEQ ID NO：18-h2A2 vLH

SEQ ID NO：19-h2A2 HA重链

SEQ ID NO：20-h2A2 HB重链

SEQ ID NO：21-h2A2 HC重链

SEQ ID NO：22-h2A2 HD重链

SEQ ID NO：23-h2A2 LA轻链

SEQ ID NO：24-h2A2 LB轻链

SEQ ID NO：25-h2A2 LC轻链

SEQ ID NO：26-h2A2 LD轻链

SEQ ID NO：27-h2A2 LE轻链

SEQ ID NO：28-h2A2 LF轻链

SEQ ID NO：29-h2A2 LG轻链

SEQ ID NO：30-h2A2 LH轻链

序列表

<110> 思进公司(Seagen Inc.)

<120> 抗-AVB6抗体和抗体-药物偶联物

<130> AVB6-00212PC

<150> US 62/943,959

<151> 2019-12-05

<150> 63/012,584

<151> 2020-04-20

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> m2A2 vH

<400> 1

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mIGHV1-39 (最接近的鼠种系V-基因)

<400> 2

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIGHV1-46/HJ4

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vHA

<400> 4

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vHB

<400> 5

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Pro Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vHC

<400> 6

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vHD

<400> 7

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> m2A2 vL

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mIGKV12-89 (最接近的鼠种系V-基因)

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro

85 90 95

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIGKV1D-33/KJ2

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLA

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLB

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLC

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLD

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLE

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLF

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLG

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 vLH

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 HA重链

<400> 19

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 20

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 HB重链

<400> 20

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Pro Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 21

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 HC重链

<400> 21

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 22

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 HD重链

<400> 22

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 23

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LA轻链

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LB轻链

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LC轻链

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 26

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LD轻链

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LE轻链

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 28

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LF轻链

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 29

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LG轻链

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 30

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h2A2 LH轻链

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA, HB, HC, HD CDR1, KABAT

<400> 31

Asp Tyr Asn Val Asn

1 5

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA, HB, HC, HD CDR2, KABAT

<400> 32

Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA, HB, HC, HD CDR3, KABAT

<400> 33

Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA, HB, HC, HD CDR1, IMGT

<400> 34

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA, HB, HC, HD CDR2, IMGT

<400> 35

Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA, HB, HC, HD CDR3, IMGT

<400> 36

Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr

1 5

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LA, LB, LC, LD, LG, LH CDR1, KABAT

<400> 37

Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn

1 5 10

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LA, LB, LD, LE, LH CDR2, KABAT

<400> 38

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR3, KABAT

<400> 39

Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LE, LF CDR1, KABAT

<400> 40

Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn

1 5 10

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC, LF CDR2, KABAT

<400> 41

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr

1 5

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LG CDR2, KABAT

<400> 42

Gly Ala Thr Asn Leu Glu Asp

1 5

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR1, IMGT

<400> 43

Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

1 5

<210> 44

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR2, IMGT

<400> 44

Gly Ala Thr

1

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR3, IMGT

<400> 45

Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr Thr

1 5