一种火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及动物灭活疫苗技术领域，尤其涉及一种火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法。

背景技术

使用矿物油作为佐剂制备灭活疫苗的工艺已经非常成熟，《中华人民共和国兽药典》(2015年版)目前仍然批准使用矿物油作为动物疫苗佐剂。由于矿物油不能被代谢，因此会产生一系列的副作用，包括发热、炎症、溃疡、肉芽肿等；矿物油在动物体内有较长期(超过210d)的残留，会在动物机体多个部位、器官中残留，不利于动物安全生产和畜禽产品质量安全，特别是矿物油中的多环芳烃在动物性产品残留将对人体具有潜在致癌风险。因此，矿物油佐剂不能用于人体，矿物油佐剂疫苗也不应在畜禽生产中的长期使用。

对于非矿物油乳剂疫苗的开发，国内外有使用动物油、植物油代替矿物油制备新城疫、禽流感油乳剂疫苗的研究报道。植物油在人们日常生活、医药、食品和化妆品工业生产上已经普遍使用，是一种安全、无毒副作用、无残留的物质。我国广西兽医研究所谢芝勋等2000年使用花生油与蜂胶组成佐剂试制疫苗，研究结果表明植物油苗注射局部反应明显轻于对照矿物油苗，植物油比矿物油更适用于制备家禽油乳剂苗。非矿物油乳剂疫苗均仍在试验研究中，至今未有商品化非矿物油乳剂疫苗面世。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种改善疫苗产品质量、消除副作用和肌体残留，有效解决动物的安全生产和畜禽产品质量安全问题的火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法，包括(1)油相制备、(2)水相制备及(3)乳化，所述油相制备的过程为：在搅拌状态下向火麻油中加入乳化剂，均匀混合后，高压灭菌冷却，获得油相，其中乳化剂占火麻油的体积浓度为5.5％～6.5％。

较佳地，所述乳化剂为司班-80、硬脂酸铝或吐温-80的一种或任两种以上组合。

较佳地，所述火麻油与乳化剂的混合温度为50～60℃；所述冷却后的温度为35～40℃。

较佳地，所述水相制备的过程为：在搅拌状态下向灭活抗原溶液中加入等温的灭菌吐温-80，均匀混合，获得水相，其中吐温-80占灭活抗原溶液的体积浓度为4.5％～5.5％。

较佳地，所述搅拌状态下，灭活抗原溶液的温度为30～37℃。

较佳地，所述灭活抗原为细菌抗原或病毒抗原。

较佳地，所述乳化的过程为：将油相加入胶体磨或乳剂缸内，以800～1200r/min边搅拌边将水相全部加入油相之中，然后以11000～12000r/min高速剪切搅拌5～10min，即得油包水型火麻油佐剂疫苗。

较佳地，所述油相与水相的体积比为1～2：1。

本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

本发明火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法，利用火麻油作为佐剂制备动物灭活疫苗，即用无毒无残留的火麻油代替矿物油作为灭活疫苗佐剂，通过特定方法制备火麻油佐剂灭活疫苗，在动物中使用，可以有效改善疫苗产品质量、消除副作用和肌体残留，解决了动物的安全生产和畜禽产品质量安全问题。

附图说明

图1是两种佐剂疫苗免疫抗体消长曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

实施例1

一种火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)油相制备：在搅拌状态下向55℃的火麻油中加入司班-80，均匀混合，高压灭菌后冷却至37℃，获得油相，其中司班-80占火麻油的体积浓度为6.0％；

(2)水相制备：在搅拌状态下向35℃已灭活的新城疫抗原中加入等温的吐温-80，均匀混合，获得水相，其中吐温-80占纯水的体积浓度为5.0％；

(3)乳剂制备：油相与水相比例设为3：1，分别将各组油相加入乳剂缸内，以1000r/min边搅拌边将水相全部加入油相之中，然后以10000r/min高速剪切搅拌8min，即得油包水型火麻油佐剂疫苗。

实施例2

一种火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)油相制备：在搅拌状态下向50℃的火麻油中加入硬脂酸铝，均匀混合，高压灭菌后冷却至35℃，获得油相，其中硬脂酸铝占火麻油的体积浓度为6.0％；

(2)水相制备：在搅拌状态下向30℃已灭活的新城疫抗原中加入等温的吐温-80，均匀混合，获得水相，其中吐温-80占纯水的体积浓度为4.5％；

(3)乳剂制备：油相与水相比例设为3：1，分别将各组油相加入乳剂缸内，以1000r/min边搅拌边将水相全部加入油相之中，然后以10000r/min高速剪切搅拌5min，即得油包水型火麻油佐剂疫苗。

实施例3

一种火麻油佐剂灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)油相制备：在搅拌状态下向60℃的火麻油中加入司班-80和硬脂酸铝，均匀混合，高压灭菌后冷却至40℃，获得油相，其中司班-80和硬脂酸铝占火麻油的体积浓度为6.5％；

(2)水相制备：在搅拌状态下向37℃已灭活的新城疫抗原中加入等温的吐温-80，均匀混合，获得水相，其中吐温-80占纯水的体积浓度为5.5％；

(3)乳剂制备：油相与水相比例设为3：1，分别将各组油相加入乳剂缸内，以1000r/min边搅拌边将水相全部加入油相之中，然后以10000r/min高速剪切搅拌10min，即得油包水型火麻油佐剂疫苗。

实施例4

本实施例与实施例1其他工艺参数一致，不同之处在于：步骤(1)油相制备：在搅拌状态下向60℃的火麻油中加入司班-80、硬脂酸铝和吐温-80，均匀混合，高压灭菌后冷却至40℃，获得油相，其中司班-80、硬脂酸铝和吐温-80占火麻油的体积浓度为6.5％。

实施例5

本实施例与实施例1其他工艺参数一致，不同之处在于：步骤(3)乳剂制备：油相与水相比例设为7：3。

实施例6

本实施例与实施例1其他工艺参数一致，不同之处在于：步骤(3)乳剂制备：油相与水相比例设为2：1。

实施例7

本实施例与实施例1其他工艺参数一致，不同之处在于：步骤(3)乳剂制备：油相与水相比例设为3：2。

实施例8

本实施例与实施例1其他工艺参数一致，不同之处在于：步骤(3)乳剂制备：油相与水相比例设为1：1。

对比实施例1

矿物油疫苗制备：

本实施例与实施例1其他工艺参数一致，不同之处在于：将火麻油改为矿物油(10号白油)。

(一)以下对实施例1的火麻油佐剂疫苗及对比实施例1的矿物油佐剂疫苗的理化进行检验。

(1)物理性状检验

矿物油佐剂疫苗为乳白色乳剂，火麻油佐剂疫苗为微黄白色乳剂，两者静止后上层有微量淡黄色液体，下层有少量灰白色沉淀。

(2)剂型检验

为油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水中，第1滴分散属正常现象，以后各滴均不出现分散现象。

(3)稳定性检验

将制备好的两种油乳剂灭活苗各取5mL分别加入两个离心管,平衡后置离心机以3000r/min离心10分钟，结果乳剂不分层；37℃左右的条件下放置12个月，不分层。

(4)粘度检验

在25℃左右的室温条件下，用1mL的吸管，出口内径1.2mm，吸取疫苗1mL，令其垂直流出，记录流出0.4mL所需的时间，3次平均值时间均在8秒钟以内。

(5)甲醛含量检测

按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)检测，甲醛含量均不超过0.2％。

(6)无菌检验

将制备的油乳剂灭活疫苗无菌取样，分别接种含硫乙醇酸盐培养基(T·G)，酪素胰酶琼脂(G·A)及葡萄糖蛋白胨汤(G·P)培养基中，置37℃培养96h做疫苗的无菌检验，均无细菌、无霉菌生长。

(7)疫苗安全性试验

参照《兽用生物制品实验室安全试验技术指导原则》有关油乳剂疫苗试验要求，使用3批试制火麻油佐剂疫苗进行试验，取小白鼠100只，随机分为10组，每组10只，进行火麻油佐剂疫苗一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种试验，同时设不注射空白对照组10只。

1)一次单剂量接种安全试验每批(组)取小白鼠10只，称测各组小白鼠平均体重，肌内注射火麻油佐剂疫苗0.5mL/只，注射后每天观察小白鼠饮食、精神状态及死亡情况，期间若出现死亡，必须解剖死亡小白鼠，观察注射部位及各器官的变化。连续观察至15d后，秤测各组小白鼠体重并计算平均增重，宰杀并解剖所有小白鼠，观察注射部位及各器官的情况。

2)单剂量重复接种安全试验每批(组)取小白鼠10只，称测各组小白鼠平均体重，肌内注射火麻油佐剂疫苗0.5mL/只，观察并记录临床反应和注射局部反应，21d后相同剂量重复接种一次，再观察14d，秤测各组小白鼠体重并计算平均增重，宰杀并解剖所有小白鼠，观察注射部位及各器官的情况。

3)一次超剂量接种安全试验每批(组)取小白鼠10只，称测各组小白鼠平均体重，肌内注射火麻油佐剂疫苗1.0mL/只，注射后每天观察小白鼠饮食、精神状态及死亡情况，期间若出现死亡，必须解剖死亡小白鼠，观察注射部位及各器官的变化。连续观察至15d后，秤测各组小白鼠体重并计算平均增重，宰杀并解剖所有小白鼠，观察注射部位及各器官的情况。

3批试制火麻油佐剂疫苗的一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种试验，各组小鼠均有增重，都未见任何临床反应或死亡，试验结束解剖检查注射部位的肌肉组织和各脏器均无肉眼可见病理变化。详见表1。

表1火麻油佐剂疫苗安全试验结果

(8)疫苗效力试验

各用1月龄SPF鸡10羽(另5羽作对照)，每羽肌内注射疫苗20μL，免疫至21日采血检测HI抗体，效力符合《中华人民共和国兽药典》(2015年版)“新城疫灭活疫苗”质量标准。

理化检验结果表明，试制火麻油佐剂疫苗为微黄白色油包水型均匀乳剂，粘度适中，无细菌污染。

保存期试验结果表明，试制火麻油佐剂疫苗配方合理、剂型稳定，置室温、低温(4℃冰箱)及高温(37℃恒温箱)不同保存条件观察至180天仍不分层。

安全性试验结果表明，试制火麻油佐剂疫苗对小白鼠肌内注射(0.5mL/只)一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种试验具有良好安全性。各试验组观察期间小白鼠未见异常，试验结束剖检小白鼠也均无肉眼可见病理变化。试验组与对照组小白鼠在试验期间平均增重无显著差异(P>0.05)。

(二)疫苗免疫效果对照试验

(1)材料

注射器、离心机、微量移液器、EP管、V型96孔板、30日龄SPF鸡。

(2)方法

1)实验动物分组与免疫方法

使用1月龄SPF鸡20羽，随机分为两组，一组注射火麻油佐剂疫苗，另一组注射矿物油佐剂疫苗，肌内注射0.5mL/羽。

2)采血方法与频率

实验鸡注射疫苗前和注射疫苗后3周开始采血，每隔3周采血一次，测定血清HI抗体水平，监测至15周。

3)鸡新城疫抗体水平检测方法：HI试验。

(三)结果

两种佐剂疫苗免疫至15周，血清HI抗体滴度都在保护水平之上，火麻油佐剂疫苗与矿物油佐剂疫苗同期抗体水平差异不显著。两种佐剂疫苗新城疫抗体消长规律见图1。火麻油作为一种优质的功能性油脂，其降血脂、抗氧化以及抗衰老的功能，本发明的火麻油佐剂灭活疫苗在动物中使用，可以有效改善疫苗产品质量、消除副作用和肌体残留，解决了动物的安全生产和畜禽产品质量安全问题。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。