一种碳酸钙纳米药物的制备方法及其应用

文献发布时间：2023-06-19 16:09:34

技术领域

本发明涉及纳米抗癌药物制备技术领域，具体涉及一种碳酸钙纳米药物的制备方法及其应用。

背景技术

随着纳米技术的发展，越来越多的纳米药物递送体系被研发，用以解决化疗过程造成的严重副作用。许多靶向策略主要集中于恶性肿瘤细胞的酸性环境，并且有研究证实酸性的肿瘤细胞环境会助长肿瘤发生转移。基于此出现了许多利用微酸环境进行靶向和药物释放并能中和肿瘤部位微酸环境的纳米药物递送策略。

碳酸钙是自然界中常见的矿物质和生物组成成分，具有生物相容性好，可中和酸性环境等特点，已经被许多研究证明是很好的药物递送工具。目前，纳米碳酸钙的制备方法都存在一定的缺点，比如不能连续生产、批次间重复性差、粒径和分布难控制、药物负载类型单一等。

发明内容

为了解决现有纳米碳酸钙粒径不可控、重复性差等的问题，本发明的目的之一是提供一种碳酸钙纳米药物的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种碳酸钙纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将第一反应物以流量为0.5-10mL/h与第二反应物进行混合得到反应液，第二反应物混合时的流量为10-100mL/h，第一反应物和第二反应物在混合过程中形成纳米碳酸钙；

步骤2、将反应液加入到第三反应物中得悬浮液，离心分离后获得粒径为30-250nm的碳酸钙纳米药物，第三反应物和反应液的体积比为1:(2-10)；

其中，第一反应物包括钙盐或碳酸盐，第二反应物包括钙盐或碳酸盐，第三反应物包括稳定剂或分散剂。

本发明的有益效果为：本发明通过对第一反应物和第二反应物流速的精确控制，实现快速、均匀的传质，最终合成颗粒粒径和分布可控的碳酸钙纳米药物，实现碳酸钙纳米药物的尺寸可控，同时制备的碳酸钙纳米药物还具有稳定性好的特点，并且该制备方法还具重复性好、连续生产、易于操作等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，第一反应物还包括活性药物，步骤2获得载活性药物碳酸钙纳米药物；其中，活性药物的质量为载活性药物碳酸钙纳米药物质量的 0.1-50％。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明中制备的载活性药物碳酸钙纳米药物中的载体纳米碳酸钙可对活性药物形成保护，提高肿瘤组织药物(即载活性药物碳酸钙纳米药物)的蓄积和瘤内穿透，降低对正常组织的毒副作用等，在肿瘤治疗方面显示出极大的应用价值和开发前景。

进一步，活性药物包括：盐酸阿霉素、盐酸拓扑替康、甲氨蝶呤、紫杉醇、喜树碱、万古霉素、环丙沙星、牛血清白蛋白、血红蛋白、胰岛素、核酸类药物核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。

进一步，第三反应物还包括pH值为7.2-7.4的碱性溶液。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：因由于纳米碳酸钙的水中不稳定性质，因此不能使用普通纯水或酸性水溶液来生产纳米碳酸钙，本发明选用第三反应物(第三反应物可以是包含稳定剂的水溶液，也可以是包含分散剂的水溶液，还可以是包含稳定剂或分散剂的碱性溶液)来生产纳米碳酸钙，提高了纳米碳酸钙在生产过程中的稳定性，在一定程度上提高了碳酸钙纳米药物的产量。

进一步，碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、醋酸钾、醋酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钾或磷酸氢二钾的溶液的任意一种或几种。

进一步，稳定剂包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚丙烯酸、烷基季铵盐和卵磷脂中的任意一种；分散剂包括：含硅分散剂、生物分散剂、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、透明质酸和固体微粒乳化剂中的任意一种。

进一步，第一反应物和第二反应物中还包括溶剂，溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙二醇、二乙二醇、异丙醇、1-丙醇、1，2-丙二醇、丁醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、2-丁氧基乙醇、甘油、甲基二乙醇胺、二乙醇胺、丙酮、乙腈、二乙烯三胺、二甲氧基乙烷、乙胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙醛、吡啶、三甘醇、乙酸、二甲基甲酰胺和二氧六环中的任意一种或几种。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明中根据活性药物的不同选用不同的溶剂，实现对不同类型药物的普适性。

进一步，碳酸盐的浓度为2.5-10mmol/L，钙盐的浓度为100-400mmol/L；其中，钙盐包括氯化钙、葡萄糖酸钙和硝酸钙中的任意一种；碳酸盐包括碳酸钾、碳酸钠和碳酸铵中的任意一种。

进一步，第一反应物和第二反应物在微流控装置中进行混合。

本发明目的之二是提供一种将目的之一制备的碳酸钙纳米药物用作靶向抗癌药物。

本发明的有益效果为：选用具有靶向作用的碳酸钙纳米药物(即包括载活性药物碳酸钙纳米药物和不载活性药物的碳酸钙纳米药物)用作抗癌药物，可集中药物对癌变区药物递送，从而提高抗癌效果。

本发明具有以下有益效果：

本发明中通过微流控装置实现第一反应物和第二反应物快速混合，并利用微流控装置相同的流动时间和流动状态可以连续制备出相同的纳米颗粒，从而最小化碳酸钙纳米药物不同批次间的差异；还利用微流控装置精确的液体控制，实现快速、均匀的传质，实现颗粒粒径和分布的可控，并且还能重复制备出碳酸钙纳米药物。

附图说明

图1为本发明中制备的不载活性药物的碳酸钙纳米药物的透射电子显微镜图；

图2为本发明中制备的载盐酸阿霉素碳酸钙纳米药物的透射电子显微镜图；

图3为本发明中制备的载喜树碱碳酸钙纳米药物的透射电子显微镜图；

图4为本发明制备的载紫杉醇碳酸钙纳米药物的透射电子显微镜图；

图5为本发明制备的不载活性药物的碳酸钙纳米药物的X射线衍射图；

图6为本发明制备的不载活性药物的碳酸钙纳米药物傅里叶红外变换光谱图；

图7为本发明制备的载盐酸阿霉素碳酸钙纳米药物的体外药物释放性能测试结果图；

图8为本发明制备的载喜树碱碳酸钙纳米药物的体外药物释放性能测试结果图；

图9为本发明制备的载紫杉醇碳酸钙纳米药物的体外药物释放性能测试结果图；

图10为微流控装置微流控芯片结构示意图；

附图标记说明：

1-外毛细管，2-内毛细管，3-外接头，4-尖端出口。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请中的碳酸钙纳米药物的制备方法及其应用进行描述。然而，本申请可按照许多不同的形式示例并且不应被解释为限于在此阐述的具体实施例，更确切地说，提供这些实施例的目的是使得本申请将是彻底的和完整的，并且将要把本申请的范围充分地传达给本领域技术人员。

发明人发现碳酸钙因其良好的生物相容性和可中和微酸环境而作为良好的抗肿瘤药物载体，且中和微酸环境具有抑制肿瘤转移的作用。

尽管目前碳酸钙被许多研究证明是很好的药物递送工具，但是目前关于碳酸钙纳米药物的制备还是存在一定的缺陷，比如不能连续生产、批次间重复性差、粒径和分布难控制、药物负载类型单一等。

基于此，本发明第一方面的实施例提供一种碳酸钙纳米药物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤2、将反应液加入到第三反应物中得悬浮液，离心分离后获得粒径为30-250nm的碳酸钙纳米药物，第三反应物和反应液的体积比为1:(2-10)；

其中，第一反应物包括钙盐或碳酸盐，第二反应物包括钙盐或碳酸盐，第三反应物包括稳定剂或分散剂。

本实施例中通过对第一反应物和第二反应物流速精确的控制，实现快速、均匀的传质，最终合成颗粒粒径和分布可控的碳酸钙纳米药物，实现碳酸钙纳米药物的尺寸可控，同时制备的碳酸钙纳米药物还具有稳定性好的特点，并且该制备方法还具重复性好、连续生产、易于操作等优点。此外，在本实施例中步骤1中第一反应物和第二反应物之间的流速比还可以是1:40。

此外，采用本实施例中的方法制备的碳酸钙纳米药物的粒径为 30-250nm，该粒径范围内的碳酸钙纳米药物在应用过程中具有更好的靶向传递效果。并且在本实施例中，当第一反应物中不含活性药物时，采用本实施例的制备方法制备的碳酸钙纳米药物为不载活性药物的碳酸钙纳米药物，当第一反应物中含活性药物时，采用本实施例制备方法制备的碳酸钙纳米药物为载活性药物的碳酸钙纳米药物。

另外，为了实现第一反应物和第二反应物在混合过程中的流速精确控制，本实施例中的第一反应物和第二反应物在微流控装置中进行混合。

具体地，如图10示意，本实施例中的微流控装置包括外毛细管1，经外毛细管1的入口端插入外毛细管1的管内并与外毛细管1的内侧壁形成间隙的内毛细管2，设置在内毛细管2的一端且位于外毛细管1的管内的尖端出口4，以及设置在外毛细管1和内毛细管2连接处的外接头3；第一反应物和第二反应物在尖端出口4与外毛细管1的出口端之间的外毛细管1的管内进行混合，其中，第一反应物经内毛细管2的另一端进入，第二反应物经外接头3进入。另外，本实施例中内毛细管的内径为580μm、外径为1000微米；尖端出口直径为100μm；外毛细管的尺寸的内径为1100μm。

在实际中，第一反应物经连接泵从内毛细管2的另一端进入内毛细管2 中，并从尖端出口4流入混合管段(即尖端出口4与外毛细管1出口端之间的外毛细管1的管段)；而第二反应物经连接泵进入到外界头3中，然后再通过内毛细管2的外侧壁与外毛细管1的内侧壁之间形成的间隙流入到混合管段并与第一反应物进行混合形成不载活性药物的纳米碳酸钙或载活性药物纳米碳酸钙。

当然，本实施例中的微流控装置在实际使用过程中可以是将多个微流控制装置串联后使用，从而满足多种反应物之间的混合，对此应用本实施例中不再进行详细的说明。

为了制备出载有活性药物的碳酸钙纳米药物，步骤1中的第一反应物还包括活性药物，经步骤1和步骤2后最终获得载活性药物碳酸钙纳米药物；其中，载活性药物碳酸钙纳米药物中的纳米碳酸钙对活性药物的包封率为10-80％，活性药物的质量为载活性药物碳酸钙纳米药物质量的0.1-50％。本实施例中制备的载活性药物碳酸钙纳米药物中的纳米碳酸钙可对活性药物形成保护，提高肿瘤组织药物(即载活性药物碳酸钙纳米药物)的蓄积和瘤内穿透，降低对正常组织的毒副作用等，在肿瘤治疗方面显示出极大的应用价值和开发前景。

另外，在一些实施例中，活性药物包括：盐酸阿霉素、盐酸拓扑替康、甲氨蝶呤、紫杉醇、喜树碱、万古霉素、环丙沙星、牛血清白蛋白、血红蛋白、胰岛素、核酸类药物核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的任一一种或多种。根据研究发现，在实际过程中，载活性药物碳酸钙纳米药物中的活性药物成分的占比越高则对纳米颗粒载体(即纳米碳酸钙)的利用率越高，同时包封率越高则对活性药物利用率越高、损耗越少；而本实施例中的活性药物能与纳米碳酸钙之间发生络合作用，在一定程度上提高了载活性药物碳酸钙纳米药物的包封率和载药率，比如阿霉素可以与钙离子形成阿霉素-钙络合物， DNA可以和钙离子形成磷酸钙-DNA共沉淀物。

另外，在一些实施例中，第三反应物还包括pH值调为7.2-7.4的碱性溶液。因此，本实施例中的第三反应物可以是包含稳定剂的水溶液，也可以是包含分散剂的水溶液，还可以是包含稳定剂或分散剂的碱性溶液；在本实例中，第三反应物提高了纳米碳酸钙在生产过程中的稳定性，在一定程度上提高了碳酸钙纳米药物的产量。

本实施例中的碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、醋酸钾、醋酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钾或磷酸氢二钾的溶液的任意一种或几种。

另外，第三反应物中的稳定剂或分散剂促使碳酸钙纳米药物能够稳定，本实施例中的稳定剂包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚丙烯酸、烷基季铵盐和卵磷脂中的任意一种；分散剂包括：含硅分散剂、生物分散剂、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、透明质酸和固体微粒乳化剂中的任意一种，其中含硅分散剂和生物分散剂主要是指具有两亲性的物质(亲水性和疏水性)，例如含硅分散剂可以是含羟基的聚醚改性聚二甲基硅氧烷，生物分散剂可以是明胶、聚乙二醇。本实施例中还通过稳定剂和分散剂提高碳酸钙纳米药物在水中的分散性。

另外，由于本实施例中主要是通过流量的精确控制来合成碳酸钙纳米药物并实现碳酸钙纳米药物的尺寸的可控，因此，第一反应物中还包含对活性药物、钙盐(或碳酸盐)具有好的溶解性的溶剂，第二反应物中也还包含对酸盐或钙盐具有好的溶解性的溶剂，此处的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙二醇、二乙二醇、异丙醇、1-丙醇、1，2-丙二醇、丁醇、1，2-丁二醇、1，3- 丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、2-丁氧基乙醇、甘油、甲基二乙醇胺、二乙醇胺、丙酮、乙腈、二乙烯三胺、二甲氧基乙烷、乙胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙醛、吡啶、三甘醇、乙酸、二甲基甲酰胺和二氧六环中的任意一种或几种。在本实施例中，通过选用不同的溶剂溶解不同的活性药物，实现本方法对不同类型药物的普适性。

另外，在一些实施例中，所述碳酸盐的浓度为2.5-10mmol/L，所述钙盐的浓度为100-400mmol/L；其中，钙盐包括氯化钙、葡萄糖酸钙和硝酸钙中的一种；碳酸盐包括碳酸钾、碳酸钠和碳酸铵中的一种。在本实施例中，在上述范围内改变碳酸盐和钙盐的浓度时，获得的碳酸钙纳米药物的粒径会随着碳酸盐和钙盐的浓度增大而变大，同时也会随着碳酸盐和钙盐的浓度降低而减小；当碳酸盐和钙盐的浓度大于上述范围时，会导致获得的碳酸钙纳米药物的粒径分布不均；当碳酸盐和钙盐的浓度小于上述范围时，将会导致无法获得碳酸钙纳米药物。此外，本实施例中的碳酸盐与钙盐之间的摩尔浓度比还可以是1:40。本发明中的第二方面的实施例提供一种将第一方面制备的碳酸钙纳米药物(即包括载活性药物碳酸钙纳米药物和不载活性药物的碳酸钙纳米药物)用作靶向抗癌药物。本实施例中的碳酸钙纳米药物用作抗癌药物，可集中药物对癌变区药物递送，从而提高抗癌效果。

实施例

实施例1

一种不载活性药物碳酸钙纳米药物的制备，包括以下步骤：

步骤1、将148mmol/L的二水合氯化钙水溶液和3.7mmol/L的碳酸钾水溶液分别作为第一反应物和第二反应物，然后分别以1ml/h和40ml/h的流速在微流控装置中混合获得反应液。

步骤2、将步骤1所得反应溶液直接通入到第三反应物中从而获得悬浮液，将悬浮液依次进行离心分离和无水乙醇洗涤，最终获得粒径约为125nm 的不载活性药物碳酸钙纳米药物；其中，第三反应物的体积为反应液体积的 25％，第三反应物为含有质量分数2％的牛血清白蛋白且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾144mg、磷酸氢二钠二水合物526.4mg和氯化钠9000.0mg与1L水混合形成。

实施例2

一种载盐酸阿霉素碳酸钙纳米药物的制备，包括以下步骤：

步骤1、将含有2mg/mL盐酸阿霉素(DOX)的148mmol/L的二水合氯化钙水溶液和3.7mmol/L的碳酸钾水溶液分别作为第一反应物和第二反应物，然后分别以1ml/h和40ml/h的流速在微流控装置中混合获得反应液。

步骤2、将步骤1所得反应溶液直接通入到第三反应物中从而获得悬浮液，将悬浮液依次进行离心分离和无水乙醇洗涤，最终获得粒径为100-150 nm的载盐酸阿霉素碳酸钙纳米药物；其中，第三反应物的体积为反应液体积的25％，第三反应物为含有质量分数2％的牛血清白蛋白且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾144mg、磷酸氢二钠二水合物526.4mg和氯化钠9000.0mg与1L水混合形成。

实施例3

一种载喜树碱碳酸钙纳米药物的制备，包括以下步骤：

步骤1、含有2mg/mL喜树碱(CPT)的148mmol/L的二水合氯化钙 DMSO(二甲基亚砜)溶液和3.7mmol/L的碳酸钾水溶液分别作为第一反应物和第二反应物，然后分别以1ml/h和40ml/h的流速在微流控装置中混合获得反应液。

步骤2、将步骤1所得反应溶液直接通入到第三反应物中从而获得悬浮液，将悬浮液依次进行离心分离和无水乙醇洗涤，最终获得粒径约为120nm 的载喜树碱碳酸钙纳米药物；其中，第三反应物的体积为反应液体积的25％，第三反应物为含有质量分数2％的牛血清白蛋白且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾144mg、磷酸氢二钠二水合物526.4 mg和氯化钠9000.0mg与1L水混合形成。

实施例4

一种载紫杉醇碳酸钙纳米药物的制备，包括以下步骤：

步骤1、将含有2mg/mL紫杉醇(PTX)的148mmol/L的二水合氯化钙乙醇溶液和3.7mmol/L的碳酸钾水溶液分别作为第一反应物和第二反应物。然后分别以1ml/h和40ml/h的流速在微流控装置中混合获得反应液。

步骤2、将步骤1所得反应溶液直接通入到第三反应物中从而获得悬浮液，将悬浮液依次进行离心分离和无水乙醇洗涤，最终获得粒径约为130nm 的载LDNA碳酸钙纳米药物；其中，第三反应物的体积为反应液体积的25％，第三反应物为含有质量分数2％的牛血清白蛋白且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾144mg、磷酸氢二钠二水合物526.4 mg和氯化钠9000.0mg与1L水混合形成。

实施例5

一种载DNA碳酸钙纳米药物的制备，包括以下步骤：

步骤1、将含有2mg/mL DNA的148mmol/L的碳酸钾水溶液和3.7 mmol/L的二水合氯化钙水溶液分别作为第一反应物和第二反应物，然后分别以1ml/h和40ml/h的流速在微流控装置中混合获得反应液。

步骤2、将步骤1所得反应溶液直接通入到第三反应物中从而获得悬浮液，将悬浮液依次进行离心分离和无水乙醇洗涤，最终获得粒径约为170nm 的载盐酸阿霉素碳酸钙纳米药物；其中，第三反应物的体积为反应液体积的 25％，第三反应物为含有2％的牛血清白蛋白且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液 (PBS)，磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾144mg、磷酸氢二钠二水合物526.4mg 和氯化钠9000.0mg与1L水混合形成。

实施例6、