应用于蛋白质抗原的定量检测试剂盒及方法

技术领域

本发明属于体外诊断与免疫检测技术领域，特别涉及一种应用于蛋白质抗原的定量检测试剂盒及方法。

背景技术

临床上常采用免疫分析方法对蛋白质抗原进行定量检测，检测模式为双抗体夹心法。双抗体夹心法中配对的两株抗体的亲和力是决定分析敏感度和检测范围的关键因素。信号抗体与包被抗体配对的亲和力差异，可决定待检抗原低区的灵敏度和准确度。若使用高亲和力的捕获抗体可以提升检测的敏感度，但容易产生钩状效应，检测上限降低；而使用低亲和力的捕获抗体可以拓宽检测方法的检测上限，但检测敏感度低。而一些特殊的蛋白质抗原IGE、CEA、HCG、AFP、HBs等对功能灵敏度和检测范围均有很高的要求。

IgE是一种分泌型免疫球蛋白，在正常人血清中的含量很低（低于总血清免疫球蛋白含量的0.001%）。体内IgE浓度与年龄有关，新生儿含量最低，随年龄逐渐增高，5-7岁达到稳定水平，但10-15岁人群中IgE含量达到最高。IgE主要由鼻咽、扁桃体、支气管等处固有层的浆细胞产生，为亲细胞性抗体，能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE受体结合，从而导致机体处于致敏状态。IgE是介导Ⅰ型超敏反应的主要抗体，血清中IgE的浓度通常与在过敏原中的暴露强度和过敏症状的严重程度有关。血清IgE含量测定常被用于过敏性疾病（如哮喘、枯草热、特异性皮炎和荨麻疹）的鉴别诊断和治疗疗效监测，可区分特异反应性和非特异反应性的过敏症状患者。此外，在儿童期，准确测量血清中IgE的浓度对于就过敏性症状做出预见性评估具有非常重要的意义。目前的主流检测方法血清未再次稀释时检测范围上限最高为2500IU/ml，对于超出检测上限的高水平tIgE的测定需将标本稀释后再行测定，增加了检验人员的工作量和试剂成本，且测定时间长，不适合快速检测。

发明内容

本发明针对现有蛋白质抗原免疫检测方法的不足，提供一种定量检测试剂盒，利用该试剂盒检测蛋白质抗原时，具有优异的敏感度和较宽的检测范围，可满足临床上患者的鉴别诊断和治疗疗效监测两种需求。

为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种应用于蛋白质抗原的定量检测试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有低浓度检测区和高浓度检测区，低浓度检测区和高浓度检测区能够基于靶分析物的存在或不存在产生不同强度的信号，其中低浓度检测区包被有捕获抗体A，高浓度检测区包被有捕获抗体B，捕获抗体A针对靶分析物的亲和力高于捕获抗体B针对靶分析物的亲和力。

在本发明的的一些实施方案中，所述信号抗体为被荧光微球标记的抗体，信号抗体和捕获抗体A或捕获抗体B同时与靶分析物结合形成带有荧光标记的夹心复合物。

在本发明的一些实施方案中，所述载体为微流控芯片，捕获抗体A和捕获抗体B沿样本流动方向依次包被在微通道内形成低浓度检测区和高浓度检测区，信号抗体设置在微通道内位于捕获抗体A的前端形成标记区或直接设置在微流控芯片的加样孔内。

在本发明的一些实施方案中，所述微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、低浓度检测区、高浓度检测区以及质控区，所述质控区按常规设置。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述任一一个技术方案中的试剂盒定量检测蛋白质抗原的方法，包括至少以下步骤：

1）获取校准函数;

2)将可能包含靶分析物的样品加入样本孔，首先与标记抗体结合，在依次流经载体的低浓度检测区和高浓度检测区，反应结束后利用检测仪器获取低浓度检测区和/或高浓度检测区的信号值；

3）与校准函数比较确定靶分析物的浓度：当仅有低浓度检测区检测到信号值时，以校准函数T1为标准比较低浓度检测区的信号值确定靶分析物的浓度，当低浓度检测区和高浓度检测区均检测到信号时，以校准函数T2为标准比较高浓度检测区的信号值确定靶分析物的浓度。

通过上述技术方案得到的一种应用于蛋白质抗原的试剂盒及方法，其有益效果是：

1、将高亲和力的捕获抗体A和低亲和力的捕获抗体B沿样本流经的方向依次设置，使不同亲和力的抗体发挥不同作用，在确保功能灵敏度的同时，拓宽了检测范围，实现对浓度范围跨度较大的蛋白质抗原水平的准确定量，减少不必要的稀释；

2、应用所述的微流控芯片体积小，所消耗的试剂和样本量少，整个反应过程可在4分钟内完成，操作简单，前期芯片的制备简单；

3、确定结果时只需单独比较低浓度检测区或高浓度检测区的其中一个区域的信号值，提高了分析速度。

附图说明

图1是根据本发明的一个技术方案提出的检测IgE的试剂盒结构。

图2是应用图1中试剂盒的检测过程。

图3是应用图1中试剂盒的检测结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明总体来说涉及免疫检测技术领域，使用两种亲和力不同的捕获抗体联合使用，使各自发挥其优点，则可以实现对较高的敏感度和较宽的检测范围的兼顾，具体的，使可能含有靶分析物的样本依次流经高亲和力的捕获抗体和低亲和力的捕获抗体并产生可被捕获的信号，根据信号值比对校准函数获取样本中靶分析物的浓度信息。

校准函数是通过使含有靶分析物系列浓度标准品依次流经高亲和力的捕获抗体和低亲和力的捕获抗体测得的剂量反应曲线，以此推算未知样本的浓度。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。

本发明提出一种应用于蛋白质抗原的定量检测试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有低浓度检测区（LT）和高浓度检测区（HT），低浓度检测区和高浓度检测区能够基于靶分析物的存在或不存在产生不同强度的信号，其中低浓度检测区包被有捕获抗体A，高浓度检测区包被有捕获抗体B，捕获抗体A针对靶分析物的亲和力高于捕获抗体B针对靶分析物的亲和力。

低浓度检测区和高浓度检测区基于靶分析物、信号抗体和捕获抗体的夹心产生信号，具体来源于信号抗体自身携带的信号，当信号抗体与靶分析物结合后又被捕获抗体A和/或捕获抗体B捕捉，在低浓度检测区和/或高浓度检测区形成固定的有效信号，例如酶标记夹心复合物的形成或荧光微球标记的夹心复合物的形成，需要注意的是，形成酶标记夹心复合物时，所述酶能够通过将第五转化成可检测的产物来扩增靶分析物化学信号。

在一个实施方案中，所述信号抗体为被荧光微球标记的抗体，信号抗体和捕获抗体A或捕获抗体B同时与靶分析物结合形成带有荧光标记的夹心复合物。

信号抗体既可以在与可能含有靶分析物的样本混合后一同滴加到载体上，也可以沿样本流动方向设置在低浓度检测区的前端形成标记区。

所述载体可以选用依靠毛细管力驱动样本流动的微流控芯片或其他移动控制器驱动的样本流动的芯片，还可选用常见的检测试纸条（包括上样垫、标记垫、层析垫和吸样垫），在一个实施方案中，所述载体选用微流控芯片，无需外力驱动，将捕获抗体A和捕获抗体B沿样本流动方向依次包被在微通道内，信号抗体可以设置在微通道内位于捕获抗体A的前端，也可以设置在微流控芯片的加样孔内。

具体的，微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、低浓度检测区（LT）、高浓度检测区（HT）以及质控位点C，标记有荧光微球的信号抗体涂覆在标记区，捕获抗体A包被在低浓度检测区、相对于捕获抗体A亲和力低的捕获抗体B包被在高浓度检测区。

所述质控位点C按常规设置，例如包被有与信号抗体发生特异性结合的固定抗原，用于确定检测过程是否有效。

图1-图3显示的是应用本发明中的其中一个技术方案检测IgE的试剂盒及检测过程，应当理解的是，虽然被描述用于IgE测定，但本文所描述的试剂盒也可用于蛋白质抗原IGE、CEA、HCG、AFP、HBs等的含量测定。

以IgE检测为例，载体的标记区设置的信号抗体是荧光微球标记的IgE抗体，高亲和力IgE单克隆抗体A、低亲和力IgE单克隆抗体B偶联生物素后分别被包被在LT区和HT区，C区包被的是IgE抗原。

待检血清加入加样孔经毛细管力驱动进入标记区，与荧光微球标记IgE单克隆抗体特异性结合。抗原抗体复合物继续沿微通道涌动，首先在低浓度检测区遇到高亲和力IgE单克隆抗体A，有利于识别低浓度的IgE；若IgE含量过高，过量的抗原抗体复合物继续向前涌动至高浓度检测区遇到低亲和力IgE单克隆抗体B，此配对的抗原抗体反应平台期出现较晚，有助于识别高浓度的IgE。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述任一一个技术方案中的试剂盒定量检测蛋白质抗原的方法，包括至少以下步骤：

1）获取校准函数:通过使含有靶分析物系列浓度标准品依次流经低浓度检测区和高浓度检测区测得剂量反应曲线，进而获取校准函数，其中低浓度检测区的校准函数为T1,高浓度检测区的校准函数为T2；

2）将可能包含靶分析物的样品与标记抗体结合后依次流经载体的低浓度检测区和高浓度检测区（若载体上未设置标记区，则样品滴加到载体前需与标记抗体混合），反应结束后利用检测仪器分别获取低浓度检测区和高浓度检测区的信号值（检测仪器为常规技术，例如荧光检测仪，与信号抗体携带的信号一致即可）；

3）与校准函数比较确定靶分析物的浓度：当仅有低浓度检测区检测到信号值时（样本中靶分析物浓度较低，靶分析物与信号抗体结合的复合物完全被捕获抗体A捕获，高浓度检测区不产生信号），以校准函数T1为标准比较低浓度检测区的信号值确定靶分析物的浓度，当低浓度检测区和高浓度检测区均检测到信号时（样本中靶分析物浓度较高，捕获抗体A不足以捕获全部的靶分析物与信号抗体结合的复合物，高浓度检测区产生信号），以校准函数T2为标准比较高浓度检测区的信号值确定靶分析物的浓度。

可以理解的是，高浓度检测区不产生信号是相对的，而不是绝对的，当高浓度检测区的信号相较于低浓度检测区的信号十分微弱时，例如信号为荧光微球散发的荧光时，若高浓度检测区产生的荧光信号肉眼不可见，则可以利用荧光检测仪只对低浓度检测区进行信号检测，即仍以低浓度检测区的信号与校准函数T1作比确定靶分析物的浓度；若高浓度检测区产生的荧光信号肉眼可见，则可以利用荧光检测仪支队高浓度检测区进行信号检测，以高浓度检测区的信号与校准函数T2作比确定靶分析物的浓度。

上述检测方法以低浓度检测区或高浓度检测区单独的信号值比对校准函数获取靶分析物的浓度，操作简单，无需进行复杂计算，分析速度快。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。