用于结缔组织生长因子的小干扰RNA及其应用

相关申请的交叉引用

本发明要求于2021年01月19日提交的申请号为202110070887.1的中国专利申请的全部权益，并将它们的全部内容引入本文。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于结缔组织生长因子的小干扰RNA及其应用。

背景技术

瘢痕是创伤愈合留下的痕迹，也是组织修复愈合的最终结果。在某些个体，修复过程发生异常可以导致组织过度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕突出皮面，形状不规则，高低不平，潮红充血，质地实韧。有灼痛和瘙痒感，于环境温度增高，情绪激动，或进食辛辣刺激性食物时症状加剧。增生往往延续几月或几年后才逐渐发生退行性变化，表现为突起高度减低，颜色转暗，充血消退，变软。有些最终可以平复，痛痒症状也大为减轻或消失。增生性瘢痕，好发于损伤深度仅及真皮的创伤，偶尔亦见于较深的创伤和手术切口。目前国内外治疗瘢痕多采用压迫疗法，硅胶制剂，口服药物积雪苷片和甲氧桂氨酸，局部注射激素类药物、抗肿瘤药物以及维拉帕米，手术治疗，放射治疗，最新治疗方式采用激光治疗，A型肉毒毒素(BTA)治疗，自体脂肪移植等。

目前常用的压迫治疗是一种经济有效的治疗方法，但其疗效与患者年龄、瘢痕部位、压力大小以及治疗的开始时间和持续时间等诸多因素有关，对婴幼儿等依从性不高的患者及面部、颈部等难以进行有效压迫的部位难以取得满意的效果。此外，长时间的压迫可能对患者的日常生活造成不便，对婴幼儿及青少年的生长发育也会产生一定影响。随着3D打印技术的开发，可以根据不同患者的面部瘢痕进行个性化定制，但费用相对昂贵，还可因长时间的压迫造成患者不适；同样硅胶制剂目前常与其他材料联合使用，费用相对昂贵；口服及注射药物进行增生性瘢痕的治疗常出现药物副作用，例如注射糖皮质激素，可能导致病灶局部皮肤色素减退、组织坏死和末端小动脉扩张等局部副作用；手术作为瘢痕常见的病因之一，其本身可能导致病理性瘢痕的形成；放射治疗通常与手术结合治疗，最新治疗方式通常不单独采用，常与传统方式联合治疗，无法单独起到根除效果。

针对瘢痕的治疗手段还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供了一种结缔组织生长因子的小干扰RNA(siRNA分子)及其应用。

成纤维细胞作为人增生性瘢痕发病的关键效应细胞，其增殖、分化受到生长因子的调控，结缔组织生长因子(CTGF)是一种具有强烈促纤维化作用的生长因子，下调CTGF基因表达可促进增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡和抑制成纤维细胞的增殖，并能有效抑制增生性瘢痕成纤维细胞对COL-I和FN的合成及分泌。因此，通过抑制CTGF的活性可以有效调控疤痕纤维化。因此发明人通过设计合适的小干扰RNA(siRNA)序列可以特异性减少成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌CTGF蛋白。siRNA通过形成沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，与靶标基因的mRNA的序列互补配对，使靶标基因的mRNA降解从而抑制靶标基因的表达；从而可以促进增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡和抑制纤维细胞的增殖，有望成为治疗增生性疤痕的药物，满足患者需求。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种siRNA分子，

所述siRNA能够特异性的靶向结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的mRNA序列的第1280-1356、1434-1454、1470-1512、1533-1586、1599-1619、1694-1730、1824-1845、1889-2013、2262-2301位核苷酸，所述的结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的mRNA的GENEBANKID为NM_001901.2。

根据本发明的实施例，所述siRNA分子选自下列中的至少一种：(a)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中任意一条核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数在3个以下的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所提供的siRNA分子选自下列中的至少一种：与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数在2个以下的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所提供的siRNA分子选自下列中的至少一种：与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数为1个的核苷酸序列。

根据本发明的优选实施例，所述的siRNA的正义链为SEQ ID NO:7-9、12-15、19、24、26-28、30-32、34、38、45-46、49、51、55-62、88-89中的至少一种；

所述的siRNA的反义链为SEQ ID NO:101-103、106-109、113、118、120-122、124-126、128、132、139-140、143、145、149-156、182-183中的至少一种。

本发明通过设计特异性小干扰RNA序列，使得siRNA分子能够靶向CTGF，降低该蛋白表达量，促进增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡和抑制纤维细胞的增殖，有望成为治疗增生性疤痕的药物，满足患者需求。

根据本发明的实施例，所述siRNA分子包括至少一条正义链和至少一条反义链；所述正义链选自下列中的至少一种：(a-1)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:94中的至少一种；(b-1)与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:94中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数在3个以下的核苷酸序列，优选碱基的差异数在2个以下的核苷酸序列，更优选碱基的差异数为1个的核苷酸序列；所述反义链与所述正义链反向互补，所述反义链选自下列中的至少一种：(a-2)SEQ ID NO:95～SEQ ID NO:188中的至少一种；(b-2)与SEQ ID NO:95～SEQ ID NO:188中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数在3个以下的核苷酸序列，优选碱基的差异数在2个以下的核苷酸序列，更优选碱基的差异数为1个的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述siRNA分子抑制CTGF基因的表达及其相关蛋白的表达。

根据本发明的实施例，所述siRNA分子包括至少一个被修饰的核苷酸。根据本发明的优选实施例，所述修饰的核苷酸选自下列至少之一：

5'-硫代磷酸酯基的核苷酸、5-甲基化胞嘧啶核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-2-甲氧乙基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、3'-氮取代修饰的核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、多肽核苷酸、氨基磷酸酯，以及包括非天然碱基的核苷酸。

根据本发明的实施例，所述siRNA分子中所述正义链和所述反义链的长度分别为18～50nt。根据本发明的实施例，所述siRNA分子中所述正义链和所述反义链的长度均不多于25nt。根据本发明的优选实施例，所述siRNA分子中所述正义链和所述反义链的长度为18～25bp。根据本发明的优选实施例，所述siRNA分子中所述正义链和所述反义链的长度为19～22bp；根据本发明的优选实施例，所述siRNA分子中所述正义链和所述反义链的长度为21bp。

根据本发明的实施例，所述siRNA分子与靶向配体连接。根据本发明的实施例，所述siRNA分子与靶向配体通过共价键连接。根据本发明的实施例，所述靶向配体包括至少一个N-乙酰基-半乳糖胺。根据本发明的实施例，所述靶向配体与所述siRNA分子的正义链连接。根据本发明的实施例，所述靶向配体与所述siRNA分子的正义链的5’末端连接。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。可以通过不同的方法将siRNA分子导入到重组细胞中，从而使得重组细胞可以表达siRNA，从而可以抑制CTGF基因的表达，用来治疗CTGF相关疾病，例如增生性瘢痕。重组细胞可以是真核细胞。可用的方法包括但不限于：磷酸钙共沉淀的方法，电穿孔的方法，阳离子脂质体试剂的方法等等。例如可以采用常用的阳离子脂质体Lipofectamine2000。所形成的重组细胞除了能够表达本发明第一方面所述的siRNA分子之外，还可以含有任何形式的载体：如多聚物载体、多肽载体、高分子聚合物载体、金属纳米载体、配体功能的各类载体等等。当然也可以直接利用转染试剂，例如LipofectamineRNAiMAX转染试剂，该转染试剂能够在广泛的细胞系中(包括常见细胞类型、干细胞、原代细胞以及历来难转染的细胞类型)提供简便、高效的siRNA输送效果。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种基因沉默组合物，包括本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种试剂盒或药盒，所述试剂盒或者所述药盒包括本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种在体外抑制细胞内靶基因表达量的方法，所述方法包括导入本发明第一方面任一项所述的siRNA分子的步骤。例如，可以将siRNA分子导入到细胞内，以便使得所述细胞内靶基因的表达量降低，所述siRNA分子为本发明第一方面所述的siRNA分子。根据本发明的实施例，所述靶基因为结缔组织生长因子基因。根据本发明的实施例，所述细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞包括但不限于人。

在本发明的第九方面，本发明提供了一种治疗结缔组织生长因子相关疾病的药物组合物，包括有效量的本发明第一方面所述的siRNA分子，或者本发明第二方面所述的表达载体，或者本发明第三方面所述的重组细胞；以及药学上可接受的辅料。治疗瘢痕的药物可以采用常规方法制备成不同的制剂，例如可以采用生理盐水或者含有葡萄糖和其他辅剂的水溶剂通过常规方法制备成针剂。所制备成的不同的药物可以以任何方便的形式给药，例如可以通过局部、静脉、肌肉、皮下、皮内等不同的途径给药。药物的用量可以根据实际情况进行适应性调整。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。对于本文中的一些术语进行说明和解释，这些说明和解释仅用于方便本领域技术人员理解，而不应看作是对本发明保护范围的限制。

本文中，术语siRNA(smallinterferingRNA，小干扰RNA)分子作本领域通常意义理解，是指序列特异性地介导有效的基因表达抑制(可以指基因沉默)的短的双链的RNA。

本文中，术语“反义链”作本领域通常意义理解，是指与靶核酸序列一部分或者全部互补的多核苷酸。例如，可以与mRNA序列、非mRNA的RNA序列、或者编码DNA序列或者非编码DNA序列的整体互补或者一部分序列互补。

本文中，术语“正义链”作本领域通常意义理解，是指与靶核酸序列一部分或者全部相同的多核苷酸。例如，可以与mRNA序列、非mRNA的RNA序列、或者编码DNA序列或者非编码DNA序列的整体相同或者一部分序列相同。

本文中，所提到的“靶核酸”或者“靶基因”可以为mRNA、microRNA、piRNA、编码DNA序列以及非编码DNA序列等等，当然并不限于此。

本文中，所提到的“结缔组织生长因子相关疾病”可以为纤维化疾病，瘢痕，瘢痕瘤，硬化症等相关疾病。根据本发明的实施例，所提到的结缔组织生长因子相关疾病为瘢痕，尤其为增生性瘢痕。

本文中所提到的核酸分子，可以采用通常的方法人工合成。例如，核酸分子可以采用本领域常用的化学合成或者酶法合成。

针对人结缔组织生长因子(CTGF)基因靶点，设计小干扰核酸(siRNA)序列，合成siRNA，利用转染试剂，将siRNA导入细胞内，形成沉默复合体(RNA-inducesiliencingcomplex，RISC)，特异性识别并靶向结合靶基因的mRNA序列，并在距离5’端10-11位剪辑之间切割mRNA，从而导致转录后基因沉默，调控蛋白分泌。

本发明提供了一种siRNA分子及其在治疗结缔组织生长因子相关疾病中的应用。实验通过确定表达结缔组织生长因子的目的基因，设计合成了诸多siRNA分子。通过应用体外转染技术，将这些siRNA分子导入到细胞中，对于这些siRNA分子的抑制效果进行了验证。发明人所提供的siRNA分子表现出优异的调控基因沉默的效果，可以将其应用于与冠状动脉疾病有关的治疗中。

本发明提供了一种siRNA分子，所述siRNA分子能够特异性的靶向结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的mRNA序列的第1280-1356、1434-1454、1470-1512、1533-1586、1599-1619、1694-1730、1824-1845、1889-2013、2262-2301位核苷酸中的一种或其组合，所述的结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的mRNA的GENEBANK ID为NM_001901.2。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种siRNA分子，所述siRNA分子选自下列中的至少一种：(a)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中任意一条核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数为3个的核苷酸序列，例如碱基的差异数为2个的核苷酸序列，再例如碱基的差异数为1个的核苷酸序列。

在本发明的至少一些实施方式中，所述siRNA分子包括至少一条正义链和至少一条反义链；所述正义链选自下列中的至少一种：(a-1)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:94中的至少一种；(b-1)与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:94中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数在3个以下的核苷酸序列，优选碱基的差异数在2个以下的核苷酸序列，更优选碱基的差异数为1个的核苷酸序列；所述反义链与所述正义链反向互补，所述反义链选自下列中的至少一种：(a-2)SEQ ID NO:95～SEQ ID NO:188中的至少一种；(b-2)与SEQ ID NO:95～SEQID NO:188中的任意一条核苷酸序列相比，碱基的差异数在3个以下的核苷酸序列，优选碱基的差异数在2个以下的核苷酸序列，更优选碱基的差异数为1个的核苷酸序列。

根据本发明的优选实施例，所提供的siRNA分子包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:94中的任意一条及其反义链。根据本发明的实施例，反义链的序列号为SEQ ID NO:95～SEQID NO:188中任一条。其中反义链中SEQ ID NO:95对应正义链SEQ ID NO:1，反义链SEQ IDNO:96对应正义链SEQ ID NO:2，依次类推。在本发明的实施例，所提供的siRNA分子为SEQID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ IDNO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ IDNO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ IDNO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ IDNO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ IDNO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，SEQ IDNO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ IDNO:43，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ IDNO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54，SEQ IDNO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ IDNO:61，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ IDNO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ IDNO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:78，SEQ IDNO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:84，SEQ IDNO:85，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:90，SEQ IDNO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94。根据本发明的实施例，所述siRNA分子除了上述提到的任意一条正义链，还可以进一步包括所述正义链对应的任意一条反义链。根据本发明的实施例，所述反义链与所述正义链至少部分序列反向互补，所述反义链选自SEQ ID NO:95～SEQ ID NO:188中的至少一种。这些siRNA分子表现出抑制结缔组织生长因子基因的表达，从而可以用于预防或者治疗结缔组织生长因子相关的疾病。需要说明的是，这些siRNA分子对应的反义链，也将用来作为预防或者治疗结缔组织生长因子相关疾病的siRNA分子，包含在本发明要求保护的范围之内。对于这些反义链分子序列SEQ ID NO:95～SEQ ID NO:188的应用，也将需要获得本发明的许可。根据本发明的优选实施方式，所述的siRNA分子的正义链为SEQ ID NO:7、8、9、12、13、14、15、19、24、26、27、28、30、31、32、34、38、45、46、49、51、55、56、57、58、59、60、61、62、88或者89，或其任意组合。根据本发明的优选实施方式，所述的siRNA分子的反义链为SEQ ID NO:101、102、103、106、107、108、109、113、118、120、121、122、124、125、126、128、132、139、140、143、145、149、150、151、152、153、154、155、156、182或者183，或其任意组合。

所提供的siRNA分子除了具有上述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:188中的任意一条序列之外，上述序列中的核苷酸还可以为修饰的核苷酸，修饰的核苷酸可以为化学修饰；这种修饰的核苷酸可以为一个，两个，三个或者四个等，甚至是全部核苷酸。例如，所提供的siRNA分子所含有的至少一个核苷酸的核糖的2'位的羟基被氢原子、氟原子、-O-烷基、-O-酰基以及氨基中的任意一个取代。当然，所提供的修饰的核苷酸也不仅限于此，还可以是本领域常用的为了提高siRNA分子的传递能力所作出的一些修饰。修饰的核苷酸包括但不限于：5'-硫代磷酸酯基的核苷酸、5'-甲基化胞嘧啶核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-2-甲氧乙基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、3'-氮取代修饰的核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、多肽核苷酸、氨基磷酸酯，以及包括非天然碱基的核苷酸等等。

在本发明的一些实施方式中，本发明还提供了包含上述siRNA分子的表达载体。根据本发明的实施例，表达载体中除了包含上述siRNA分子之外，还可以根据需要含有启动子、终止子、标记基因等等。表达载体主要用于siRNA分子的表达。可以采用本领域通用的基因工程手段制备相应的表达载体。

在本发明的又一些实施方式中，本发明还提供了表达上述siRNA分子的重组细胞。在本发明的又一些实施方式中，本发明还提供了包含上述siRNA分子的基因沉默组合物。根据本发明的实施例，所提供的基因沉默组合物，除了上述siRNA分子之外，还可以根据需要含有核酸内切酶和Argonature蛋白，核酸内切酶和Argonature蛋白可以与siRNA分子形成RNA诱导沉默复合体，也称为RISC。RISC中核酸内切酶(Dicer)具有RNaseIII结构域，在RNAi的起始阶段负责催化siRNA的产生，在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的作用。Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI两个主要的结构域，前者为siRNA分子的传递提供结合位点，后者是RISC中的酶切割活性中心。siRNA分子是RISC完成特异性切割作用的向导，在成熟的RISC中虽然只包含siRNA分子的一条链，但siRNA分子在RISC形成过程中的双链结构是保证RNAi效应的决定因素。通过所提供的RNA诱导沉默复合体，可以特异性识别并靶向结合靶基因的mRNA序列，并在距离5’端10-11位剪辑之间切割mRNA，从而导致转录后基因沉默，降低结缔组织生长因子的表达量，作为患有结缔组织生长因子相关疾病患者的一种治疗手段。

应用所提供的siRNA分子还可以根据需要制备成试剂盒或者药盒。试剂盒可以表现为瓶、桶、小袋子、管等多种形式，所提供的试剂盒或者药盒，可以用来检测、预防或者治疗结缔组织生长因子相关疾病。

在本发明的一些实施方式中，本发明提供了一种在体外实施的抑制细胞内靶基因的表达的方法，所述方法包括导入上述siRNA分子的步骤。根据本发明的实施例，所述靶基因为CTGF mRNA。根据本发明的实施例，所述靶基因为CTGF编码基因。本发明所使用的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药。

SiRNA分子在体内或者体外进行传递，可以通过本领域常用的向细胞内有效传递寡核苷酸的脂质体，阳离子聚合物，抗体，适体，纳米粒子等的各种载体以及传递方法联合使用。当然，为了能够使得所提供的siRNA分子能够有效实施体外或者体内传递，siRNA分子可以与已知的能够向细胞内有效传递寡核苷酸的脂质体、阳离子聚合物、抗体、纳米粒子等多种载体联合应用。同时也可以应用多种已知的传递方法实现传递。

在本发明的一些实施方式中，本发明提供了一种治疗结缔组织生长因子相关疾病的方法，包括给予治疗对象有效量的上述所述的siRNA分子，或者上述所述的表达载体，或者上述所述的重组细胞。所提供的siRNA分子可以将编码结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA作为靶基因或者靶核酸。在本发明的至少一些实施方式中，将siRNA分子导入到细胞中，能够抑制CTGF表达。在本发明的至少一些实施方式中，提供了一种药物组合物，其包含siRNA分子，其能够治疗或者预防CTGF相关的疾病。根据本发明的实施例，所提供的药物组合物，除了上述siRNA分子之外，还可以与特异性抗体、靶向配体、适体等联用，形成表现出不同的基因或者蛋白抑制效果的药物组合物。

本发明的siRNA分子可视情况结合于一个或多个靶向配体上。配体可在3'端、5'端或两端处连接至siRNA分子的正义链、反义链或者这两个链。在一些实施例中，配体结合于正义链的3'端。在一个实施例中，配体可以为GalNAc配体。在一些特定实施例中，配体为GalNAc3？。

所提供的siRNA分子或者药物组合物可以根据需要制成本领域常用的任何剂型。根据实施例，siRNA可以直接以溶液剂的方式给药，可将siRNA分子以存在于生理盐水或水中的方式给药；也可以存在于合适的缓冲溶液中。合适的缓冲溶液例如可以为生理盐水。

在一些实施例中，缓冲溶液进一步包含用于控制溶液的容积渗透浓度的试剂，使得容积渗透浓度保持在所需值，例如保持在人类血浆的生理值。可添加至缓冲溶液中以控制容积渗透浓度的溶质包括但不限于蛋白质、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、糖类、代谢物、有机酸、脂质或盐。例如可以为盐。

通常，本发明的siRNA分子可以以合适的剂量给予受试者，合适的剂量可以为每天每公斤受体体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常在每天每公斤体重约0.1至10mg或1至50mg范围内。例如，siRNA分子可以以每单次剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg给予。

所提供的siRNA分子可以制备成本领域常用的多种剂量，例如口服剂，注射剂等等。例如，用于口服给予的组合物及配制品包括粉末或颗粒、微粒、纳米粒子、水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、药囊。本领域常用的增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、或者分散助剂等都可以作为药学上常用的辅料，来治疗不同的剂型。

本发明首先确定了目的基因序列，然后针对这些目的基因序列设计了siRNA序列；然后通过化学方式人工合成了这些siRNA序列，并采用这些siRNA序列进行体外转染，对于siRNA序列的RNAi效果进行检测。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1选择CTGFmRNA(序列信息来源于NCBI数据库，在NCBI数据库中的基因表示符为NM_001901.2)作为靶基因，设计了94条小干扰核酸(siRNA，正义链94条，反义链94条)。这些siRNA分子分别如下表1所示：

表1 siRNA分子的具体信息

其中表1中所示出名称(名称是以CTGF+序列对应位置命名的)、位置，是以NCBI数据库序列对应位置确定的。

实施例2体外细胞模型(NSFB细胞人成纤维细胞)测试小干扰核酸(siRNA)的活性

实施例2对于实施例1提供的siRNA分子对于结缔组织生长因子(CTGF)蛋白基因表达的抑制效果进行了验证。具体内容如下：

悬浮转染试剂配制：siRNA母液浓度为50μM，DEPC水稀释得10μMsiRNA体系，50μlOpti-MEM稀释得0.2μMsiRNA体系，吹吸3-5次混匀(终浓度10nM)。50μlOpti-MEM稀释0.5ul0.2μMsiRNA得0.002μMsiRNA体系，吹吸3-5次混匀(终浓度0.1nM)；50μlOpti-MEM稀释2μlRNAiMAX，吹吸3-5次混匀。分别混合转染试剂和小干扰核酸稀释液，吹吸3-5次混匀，室温下静置10min。

细胞处理：镜下观察NSFB细胞株汇合率>70％，进行细胞铺板，按2x10

24h后，提取细胞的总RNA，通过实时定量PCR(QuantitativeReal-TimePCR)检测细胞中CTGFmRNA序列的表达情况，其中用于扩增内参基因PPIB、CTGF的PCR引物如表2所示：

表2 PCR引物序列

小干扰核酸mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验组CTGFmRNA的表达量/实验组PPIBmRNA的表达量)/(阴性对照组CTGFmRNA的表达量/阴性对照组PPIBmRNA的表达量)]×100％。其中，各实验组为分别经小干扰核酸处理的细胞；阴性对照组(记为Blank)为未经任何小干扰核酸处理的细胞。

部分表1中所述的双链siRNA在人皮肤成纤维细胞中抑制CTGF蛋白mRNA的效率如下表3所示。

表3

除了采用上述细胞模型对于所提供的siRNA分子对于结缔组织生长因子靶基因的抑制效果进行验证之外，也可以采用其他本领域常用的细胞模型进行验证。当然，还可以根据需要采用动物模型对siRNA分子的抑制效果进行验证，验证试验可以采用本领域常用的动物模型以及相应的动物试验。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。