一种水稻开花时间遗传控制位点、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和分子育种技术领域，特别是涉及一种水稻开花时间遗传控制位点、试剂盒及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是养活世界一半人口的主要粮食作物，亚种内杂交稻在常规稻基础上增产 10-20％(Normile,2008；Su et al.,2012；chen et al.,2020)，但随着杂交水稻的不断发展，亚种内杂交稻发展到了瓶颈期(shen et al.,2017)，想再进一步提高产量非常的困难，而籼粳亚种内杂交可以在亚种内杂交的基础上再增产30％，是杂交水稻发展的一个新方向(Qian et al.,2016)。籼粳杂交，一般粳稻作为不育性，籼稻作为恢复系，但是由于籼稻和粳稻开花习性不同，作为不育性的粳稻开花时间晚，而作为恢复系的籼稻开花时间早，造成花时不育，严重影响制种产量，目前制种产量低是影响籼粳稻杂交的主要因素(袁隆平，2002书；张萌等，2016；Liu et al.,2017)。

一天当中，开花早晚是水稻花时的习性，不同的水稻品种花时可能有一定的差异，一般籼稻比粳稻早开花，野生稻比栽培稻早开花，这与它们自身的遗传因素有关(仲维功等，1990)。关于花时的遗传研究，王建军等通过对籼粳稻遗传分析，初步认为花时较早受1对显性基因控制(王建军等，1991)，陈孙泰等发现控制花时的基因与控制水稻籼粳类型性状的遗传基因不连锁(陈孙泰等，1990)；Thanh等发现亚洲野生稻W630(Oryza rufipogo)开花较早，在温度升高之前的早晨已经完全受精，通过W630和开花较晚的日本晴杂交和回交得到的BC2F8回交群体，通过QTL分析，检测到4、5、10号染色体上有早开花特性的QTL位点(Thanh at al.,2010)。 Phuong等用W630和籼稻IR36作研究材料，在第5号染色体上RM13-RM574之间和第8号染色体上RM44-RM223区域之间各检测到一个QTL 位点，基因座上的纯合野生型等位基因具有促进较早开花的潜力(Phuong at al.,2018)。马作斌等通过构建籼稻七山占与粳稻品种秋光杂交的重组自交系，在第1、2、7、8、10和12染色体上共检测到6个与花时相关的QTL 位点(马作斌等，2011)。

到目前为止，克隆到控制水稻花时的基因非常少，而花时基因存在籼粳分化的位点也未见报道。发展调控水稻花时基因的籼粳分化遗传标记，运用到水稻育种中，将有利于挖掘到更多于调控水稻花时相关的基因，进而有利于解决籼粳杂交制种产量低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻开花时间遗传控制位点、试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，调控水稻开花时间。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种调控水稻开花时间的遗传控制位点，所述遗传控制位点位于FOT1基因启动子ATG上游-61bp处，籼稻在该位点处存在11bp的 ggaggggaggg的插入突变。

进一步地，所述FOT1基因在籼稻AnN的全基因组核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，在粳稻ZH11的全基因组核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供一种水稻开花时间检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增如权利要求1或2所述遗传控制位点的引物序列。

进一步地，所述引物序列为：

FOT1-F：AGCCTCGAGCTGAACTGAAG

FOT1-R：AGCAGAACGAGCACCGTGAC。

本发明还提供一种如上所述的调控水稻开花时间的遗传控制位点、如上所述的试剂盒在水稻杂交育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种控制水稻开花时间的遗传控制位点，在FOT1基因存在籼粳分化位点，可做为遗传标记，用于籼粳杂交水稻育种，有助于挖掘更多调控开花时间的基因，进而有助于解决籼粳杂交水稻制种产量低的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为FOT1敲除突变情况和突变体表型图；

图2为FOT1变异和遗传多样性分析；

图3为RT-qPCR分析4个粳稻品种和6个籼稻品种浆片中FOT1表达；

图4为RT-qPCR分析粳稻品种ZH11和籼稻品种AnN浆片中FOT1 表达；

图5为分子遗传标记PCR电泳图；

表1为OsFOT1单倍型分析数据统计。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

发明人的前期研究发现一个含有DUF642结构域的未知基因，其敲除突变体导致水稻提前开花2.5h左右，将其命名为FOT1(Flower Opening Time 1)，如图1。通过分析三代测序获得的水稻基因组序列发现该基因 ATG密码子上游-61bp处存在籼粳分化。相对于粳稻品种，大部分籼稻品种该位点存在一个简单序列重复插入(ggaggggaggg)，如图2所示。通过qPCR实验发现该基因在相对早开花的籼稻里的表达量比在相对晚开花的粳稻里低，说明籼稻品种中FOT1启动子区域的一小段序列插入可能导致其在浆片中的表达量下降，而较低表达量的FOT1可以促进水稻早开花。

发明人根据FOT1启动子区域的上述序列差异，围绕该位点设计了一对分子标记引物(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)，利用该引物可以区分 FOT1不同的单倍型。在培育早花型粳稻品种时可以利用该分子标记进行分子标记辅助筛选，将具有ggaggggaggg序列的FOT1导入到粳稻中，可能可以促进其在早晨开花。

由于上述研究发现FOT1基因ATG密码子上游-61bp位点与水稻开花时间性状密切相关，因此，可以将该位点的简单序列重复插入可能可以控制FOT1基因表达量从而控制水稻开花时间的特点应用于水稻杂交育种中，以解决籼粳水稻花时不育导致的制种产量低问题。

上述FOT1基因的遗传控制位点，根据已知的籼粳稻基因组测序结果，确定该基因启动子存在籼粳分化，如图2和表1所示，且表达量与籼粳稻开花时间有关，KY131、Nip、Yaneng218、02428为粳稻品种，南京11、龙科638S、J4155、Y58S、II32、IR36为籼稻品种，3月初，海南省陵水县籼稻10:00开花，粳稻12:00开花，如图3和图4所示。启动子-61bp处的籼粳分化位点可发展为遗传标记。

表1 OsFOT1单倍型分析数据统计表

设计引物采用PCR的方法扩增4种粳稻品种和5种籼稻品种中包含该籼粳稻分化位点在内的125bp左右的片段大小，结果如图5所示。上述结果说明该基因的遗传标记可用于籼粳杂交水稻育种。

下面将结合具体的研究过程来进一步说明本申请的方案及其有益效果。

实施例1

1、FOT1基因的克隆

为了克隆调控水稻开花时间的基因，取不同时间段的浆片去做转录组分析，发现Os01g0611000/LOC_Os01g42520基因是所有转录组检测到的基因中在浆片中高表达最高的基因，而且该基因的表达量是随着开花时间变化，开花前表达量最高，开花时表达量下调。随后的遗传学研究证明该基因与水稻早开花有关，因此将其命名为Floret Opening Time1(FOT1)。

该基因的全基因组核苷酸序列(包括启动子和编码区序列)如下：

SEQ ID No.1籼稻品种AnN中FOT1全基因组核苷酸序列(包括启动子+编码区+UTR区+内含子)4944bp：

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SEQ ID No.2粳稻品种ZH11中FOT1全基因组核苷酸序列(包括启动子+编码区+UTR区+内含子)4930bp：

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2、敲除载体构建

1)靶标序列设计：

Target-FOT1-1：TTCGTGGAGTACATCGAGTCCGG

Target-FOT1-2：CTACGCCGTCACGTTTAGCGCGG

2)含Target-FOT1片段的pU3-gRNA和pU6a-gRNA载体构建：

首先合成带粘性末端的靶标引物，将接头引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物分别链接到经酶切后的pU3-gRNA和pU6a-gRNA 载体上；经PCR扩增和测序验证阳性质粒；

3)含Target-FOT1片段的pCRISPR/Cas9载体构建：

将含Target-FOT1片段的gRNA表达盒从pU3-gRNA和pU6a-gRNA 上切下，然后一起链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上；

4)转基因苗的获得：

将含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植株；

5)突变位点的鉴定：

提取阳性植株的DNA，用引物以下引物鉴定：

CAS-FOT1-F GATCTCTGCTAACCGCAGCA

CAS-FOT1-R AGTGGTCGTCCTCGATGTTG

PCR扩增上述DNA，经纯化后送公司测序，在 http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/上分析突变情况，结果如图1a和图1b。

6)突变体表型观察：

通过观察上述构建得到的突变体fot1-2，fot1-3和粳稻ZH11的开花时间发现，突变体比野生型ZH11早开花2.5h左右，如图1c和1d。

3、变异和遗传多样性分析

使用BLASTN提取RISC (http://ricerc.sicau.edu.cn/RiceRC/download/downloadBefore,Qin et al.,2021) 的31个水稻基因组序列中的FOT1启动子和外显子序列并通过软件Mafft v7(Katoh et al.,2002)进行比对分析变化，来自RISC的部分序列经Sanger 测序确认，无参考序列的变种FOT1启动子序列通过Sanger测序获得。结果表明FOT1存在籼粳分化，如图2和表1所示，而且启动子-61bp处的籼粳分化位点可发展为遗传标记。

4、RT-qPCR分析FOT1粳稻品种和籼稻品种的浆片中的表达模式

3月初，中国海南省陵水县的籼稻品种在上午10:00开花，粳稻品种在上午12:00开花，籼稻比粳稻开花时间早，取开花当天不同时间点的4个粳稻品种和6个籼稻品种小花浆片,做中FOT1表达的RT-qPCR分析，如图3和图4所示，结果表明，在检测到的所有时间点，七个籼稻品种中 FOT1的表达水平低于5个粳稻品种中的表达水平。

5、FOT1基因的遗传控制位点的遗传标记

根据水稻基因组测序的结果，设计遗传标记引物，引物序列如下所示：

FOT1-F(SEQ ID No.3)：AGCCTCGAGCTGAACTGAAG

FOT1-R(SEQ ID No.4)：AGCAGAACGAGCACCGTGAC

采用PCR的方法扩增籼稻品种AnN和粳稻品种ZH11中包含该籼粳稻分化位点在内的125bp左右的片段大小，用3％的琼脂糖胶进行凝胶电泳，结果如图5所示，利用该标记可以明显区分籼粳稻之间的基因型。

上述结果说明该FOT1基因的遗传控制位点可用于培育具有籼稻基因型FOT1的粳稻品种，将有助于培育能在早晨开花的粳稻品种(不育系)，可以解决籼粳杂交中花时不遇问题，有助于提高籼粳杂交水稻制种的产量。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种水稻开花时间遗传控制位点、试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4944

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtgggccaa cgcattaagt tagaccgccg acagcacatg caggcgacga cgaccgtttt 60

cctgacggtt gattgaaacg gatcgtccgt ttccgttcgt taattggtac tactacctac 120

gcgtagcgtg ttgctcccta aacaactccc agatcaggaa aggaagcatc gtctcgtctg 180

cacgtactct accaagaaaa tgatcagcgc catggaggcc agaacatgca cacatgcggt 240

gcgacccctc acatggggca acagggcatg ctacaaactg aagagtcgaa gaccacggtt 300

ccctccccat ggataaaaga tctggtcttt tcagttatca gtgtccggca tatgtagggg 360

gatcaagtgg tgggggcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaccag tggcatgatc gggcacagct 420

cgcgtcggaa caaggcatcg tgtcacatgg aagaaaccca tcgcttgttt tatggaccgc 480

gcggcgcgcg cgcgcatgcg gaccgcgcgg tgactcctgt ccctgtgcag gttgacggcg 540

agcacatgcc tagctacgtc gtggtagccc cctgcaacgt cccacgtacg cgcatgcaaa 600

ttgcagcatc acgattggtc tggaattgta catttgtact ctctgcacca gggaaaaatt 660

ttgtccagat tgcaggggag agatacggtt ggtgctgtgc gccgtgctgc gaatactgcg 720

tccagtcagg cagactcgag ctcggtcggt cacacgaaca ggcgtgcatg catgaggcac 780

gcaggccggt caatcgcctt gcacgcacac acacatcctc gggtcgatct ggccatctgg 840

gtcgcgtgct ggtttgggtg gaatcgagtt tctagttttg tcttgcgtta cgatttcccc 900

tgttcggggt gtgttgtaat cttgttgcgg actcgcgaag tcgcggtata tactcggtac 960

atgtatattg caatttgcga ggggggtttg ggtttcctcg cgcaatcaag tgcgtatata 1020

cttaagacgc gcgcacacat gggcgccatg tgtcggttga gtatccttgt cagggtttga 1080

tccagataca tgatgctgtc cggccttcca gcctacaaca tgatcctgga aatgatgtga 1140

tgacatgatg acacgatctg aacctacgat ttccatgatt aaactgagct tcacaacctc 1200

gggccacaag aattttcacg tgaagccgtt cgaattgcat gcgagtatgc aacttactcc 1260

tacatcacga aaaatggtcc ataccgcaaa gggaaaaaag aaagttccaa gtgccatggt 1320

aaccagctca ctcagtgaca aaagtggtga aagattccta aacaccggca cgccacagcg 1380

tccagccggt gcccggttgt gcgactacga tgcttgtccc ctcgcaaaat cccatgatga 1440

acgctaacca ttaaccaact tgattacata cggcggcatc tgtgttatca cgggaaccgc 1500

agaggcatac gtaaccgacg aaaaaaacgc ggacgagatg gcgaaactgc ccctcgtcgt 1560

gcaccgcctc accgggccga aagccagtcg cgtgcgcgtg cagagagacg gcgcgccgca 1620

cgtactgtac acgagccggt gcgcgcggta ggaaacggaa gcggatcagg gggccatgtg 1680

accgcacgca gggcgtgtct cctacgaggc cacgagggca gagggagccc atcatccgct 1740

cagccgaatc gccgatcggg gacacgcgta cggcgggaga tcccgtggca tttcgtggta 1800

gtaatcgacc aaccctaggc ccgttttgcc ggcagcttgg tctataagtt gctgctctgc 1860

cctgctcggc ctcatcatcc caagcggcac agcagcctcg agctgaactg aagcagggga 1920

ggggagggga ggggagggga ggagaggaga gagcaacgcg ttcaccgttg agagaagaga 1980

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tctgctcgat aatcactgcg caggctcagc tctaatttca cttcaagcat ccatttatgt 2160

agcatactgt taggaagtta ctgcggtttc tgtataagct gttttgctgt tctgatcgat 2220

cctatctatc agcggcaatg cggcatgtgc cattagtgtc taaaagctcg taatcaagct 2280

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tcacccgggt ccctccatta tccatatact gacgaaatgt ttcccccggt cgctgtcata 2400

gcatgaagcc acgaactcga tcatgcgttg atcattggag taccatatac agggtatact 2460

gtagtttggt taaccccaca cggccaaatc gcattggggc atgcatgcat aatcacaatc 2520

tacatgttgc atggctggca aagtaaactg aagtacacgt atagttaatc tcctattaag 2580

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aagcattaaa gcatatgcag ctgcagccca tttgcaagaa actattcttg ctttttagta 2700

ctagtcgtga acgtgttaga tgcataatca gatatgttct ctggtccagt gttctggact 2760

agtagtatgc aataatcaga tctggagtat catcgtctgc cagcattagg caacgtttga 2820

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ccctggttgc gttgcatgtg gtagatggga tggtagtgaa tgcacctggg ccctggccga 2940

gccagaggaa ctgacacggt catacagccc tactagctgc cggagcccag aacatgcatg 3000

ttacactaac atggaccctg tcagcttagc agtataccgg tcgcagttcc attaattaac 3060

agaacacgag atcagacaga cagcctgcgt gcctgatctg atgctctgaa tcgatctctg 3120

ctaaccgcag catcacctcc aacaactttc ttcagttgca ggctcgcagt gcagcggccg 3180

atttgaatat ctgatttagt ggattaatct gattaaatta atggtgacta aaaaaattaa 3240

cgacgtgtgt tgtgcagggc tgttgccgaa cggcaacttc gaggagggcc cacccaagtc 3300

ggacctggtg aacggcacgg tggtgcgcgg cgcgaacgcc atcccgcggt gggagacgtc 3360

cgggttcgtg gagtacatcg agtccgggca caagcagggg gacatgctgc tggtggtgcc 3420

gcagggcgcg cacgccgtgc gcctcggcaa cgaggcgtcc atccggcagc ggctcgccgt 3480

gaccaggggc gcctactacg ccgtcacgtt tagcgcggcg cgcacctgcg cccaggcgga 3540

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cagcaacggg tgggactcgt acgcgtgggc gttcaaggcg aagatggacg aggtggcgct 3660

cgtcatccac aacccgggcg tggaggagga cccggcgtgc ggcccgctca tcgacggcgt 3720

cgccatcagg gcgctgtacc cgccgacgct ggccaagggg aacatgctca agaacggcgg 3780

gttcgaggag ggcccctact tcctccccaa cgcgtcgtgg ggggtgctcg tcccgcccaa 3840

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catcagacat tatgaatggg aagcattact agtgctcact tttttataag tcaattgtgt 4680

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gcgtagcgtg ttgctcccta aacaactccc agatcaggca aaggaagcat cgtctcgtct 180

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