一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片

技术领域

本申请涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片。

背景技术

21世纪以来，癌症已成为人类生命健康最大的威胁之一，每年无数癌症病人被夺走生命。根据最新的报告，全球每年新增癌症病例1800万，癌症死亡病例960万，由此可见，针对癌症问题的研究是非常重要且具有深远意义的。

循环肿瘤细胞是指主动或被动的从原发肿瘤病灶上脱落，并成功进入外周血液中的各类肿瘤细胞，经由外周血的循环，少数循环肿瘤细胞能够转移扩散，肿瘤细胞的转移扩散往往是导致患者病情恶化或者死亡的主要原因。因此，检测血液中循环肿瘤细胞对癌症病人的早期诊断和预后评估具有重要意义。检测循环肿瘤细胞的首要前提是要去除数量庞大的背景血细胞。微流控技术通过微米级流道精确控制微升、毫升级别样品，由于其体积小、操纵精度高等特点而被用于细胞分选。微流控分选技术根据是否借助外力场可以分为被动分选技术和主动分选技术，被动分选技术包括惯性分选、微结构过滤、挤压流分选、确定性侧向位移分选等，主动分选技术包括磁分选、声分选、光分选、介电泳分选等。被动分选技术在保证高通量的条件下且能够保持一定的分选精度，而主动分选技术在保证较高分选精度的条件下在一定程度上牺牲了通量。因此，如何利用主动与被动分选技术实现循环肿瘤细胞的高通量和高精度分选具有重要意义。

发明内容

本申请提供了一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片，其技术目的是提高用于分选循环肿瘤细胞的微流控芯片的通量和精度。

本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片，包括自上而下依次设置的上盖板、上导流层、初级分选模块、内出口导流层、外出口导流层、浓缩模块、侧出口导流层、中间出口导流层、声分选模块和压电基底；

所述上盖板上设置有样品液入口A和4个定位孔A；

所述上导流层上设置有样品液入口B、4条直流道、4条弯流道、样品液出口和4个定位孔B；直流道的一端与样品液入口B联通、另一端与弯流道的中间联通；弯流道的两端均与样品液出口联通；

所述初级分选模块上设置有至少8个相同的惯性螺旋单元，每个所述惯性螺旋单元包括样品液入口C、螺旋流道、螺旋单元内出口、螺旋单元外出口和4个定位孔C；螺旋流道的一端与样品液入口C联通、另一端分别与螺旋单元内出口和螺旋单元外出口联通；

所述内出口导流层上设置有4个初级分选收集液入口A、4个初级分选废液入口A、初级分选收集液出口A、初级分选收集液流道和4个定位孔D；初级分选收集液入口A与初级分选收集液出口A通过初级分选收集液流道进行联通；

所述外出口导流层上设置有4个初级分选废液入口B、初级分选废液出口、初级分选收集液出口B、初级分选废液流道和4个定位孔E；初级分选废液入口B与初级分选废液出口通过初级分选废液流道进行联通；

所述浓缩模块上设置有初级分选收集液入口B、至少4个浓缩单元、初级分选废液入口C和4个定位孔F，每个浓缩单元包括浓缩流道和浓缩单元废液流道，浓缩流道的一端与初级分选收集液入口B联通、另一端联通有浓缩单元收集液出口；浓缩单元废液流道的两端均联通有浓缩单元废液出口；

所述侧出口导流层上设置有8个浓缩单元废液入口、浓缩单元废液汇集出口、4个浓缩单元收集液入口A、浓缩单元废液汇集流道和4个定位孔G；浓缩单元废液入口和浓缩单元废液汇集出口通过浓缩单元废液汇集流道联通；

所述中间出口导流层上设置有4个浓缩单元收集液入口B、浓缩单元收集液汇集流道、浓缩单元收集液汇集出口、分选浓缩废液出口和4个定位孔H；浓缩单元收集液入口B 和浓缩单元收集液汇集出口通过浓缩单元收集液汇集流道联通；

所述声分选模块上设置有声分选样品液入口、对称正弦流道、直流道、二级分选收集液出口、第一废液出口A、第二废液入口、第二废液流道、第二废液出口A和4个定位孔I；直流道下方设有空槽结构；对称正弦流道的一端与声分选样品液入口联通、另一端与直流道联通；直流道的一端分别与二级分选收集液出口和第一废液出口A联通；第二废液流道的一端与第二废液入口联通、另一端与第二废液出口A联通；

所述压电基底上设置有叉指换能器、二级分选收集液出口、第一废液出口B、第二废液出口B和4个定位孔J；

样品液入口A与样品液入口B联通；样品液出口与样品液入口C联通；螺旋单元内出口、螺旋单元外出口分别与初级分选收集液入口A、初级分选废液入口A联通；初级分选收集液出口A、初级分选废液入口A分别与初级分选收集液出口B、初级分选废液入口 B联通；初级分选收集液出口B、初级分选废液出口与初级分选收集液入口B、初级分选废液入口C联通；浓缩单元收集液出口、浓缩单元废液出口分别与浓缩单元收集液入口A、浓缩单元废液入口联通；浓缩单元收集液入口A、浓缩单元废液汇集出口与浓缩单元收集液入口B、分选浓缩废液出口联通；分选浓缩废液出口、浓缩单元收集液汇集出口分别与第二废液入口、声分选样品液入口联通；二级分选收集液出口、第一废液出口A、第二废液出口A分别与二级分选收集液出口、第一废液出口B、第二废液出口B联通；叉指换能器设在空槽结构内。

本申请的有益效果在于：本申请所述的集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片，自上而下依次包括上盖板、上导流层、初级分选模块、内出口导流层、外出口导流层、浓缩模块、侧出口导流层、中间出口导流层、声分选模块和压电基底。上盖板中心设置有样品液入口A，经过上导流层将样品液注入到初级分选模块；所述初级分选模块包括8个相同的惯性螺旋流道，样品液经过螺旋流道实现第一级分选，样品液中包含的大量血细胞从螺旋流道外侧出口流出被去除，循环肿瘤细胞和部分血细胞从螺旋流道内侧出口流入下一级；所述内出口导流层将螺旋流道内出口液体导流入浓缩模块；所述外出口导流层将螺旋流道外出口废液收集；所述浓缩模块包括4个非对称正弦流道，使血细胞从两侧出口流出，循环肿瘤细胞和部分血细胞从中间出口流出；所述侧出口导流层将浓缩模块两侧出口的废液收集并向下导流；所述中间出口导流层将浓缩模块中间出口样品液导流入声分选模块；所述声分选模块首先使样品液流入正弦流道让细胞聚焦，再通过声分选实现第二级分选，进一步提高循环肿瘤细胞的分选精度。本申请将主动分选技术与被动分选技术相结合，有效提高循环肿瘤细胞的分选精度，并采用多核分选与芯片垂直堆叠的方法，进一步提高芯片的通量。同时，本申请的芯片设计灵活、结构新颖，可用于商业化批量生产

本申请通过集成惯性螺旋、浓缩模块和声分选三级流道，结合惯性分选高通量的优点和声分选高精度的优点，同时中间加入浓缩模块，进一步去除背景细胞和提高声分选精度，实现同时对循环肿瘤细胞进行高通量和高精度的分选，克服目前单一分选技术的不能同时实现高通量和高精度分选的不足。同时，本申请采用非标记分选技术，具有成本低、易于集成、操作简单等优点，可以自动快速的从全血中分选出循环肿瘤细胞，并具有较高活性，可用于后续临床诊断、生化分析、药敏性测试等研究应用。

附图说明

图1为本申请的爆炸示意图；

图2为上盖板的结构示意图；

图3为上导流层的结构示意图；

图4为初级分选模块的结构示意图；

图5为内出口导流层的结构示意图；

图6为外出口导流层的结构示意图；

图7为浓缩模块的结构示意图；

图8为侧出口导流层的结构示意图；

图9为中间出口导流层的结构示意图；

图10为声分选模块的结构示意图；

图11为压电基底的结构示意图；

图中：1-上盖板；2-上导流层；3-初级分选模块；4-内出口导流层；5-外出口导流层；6-浓缩模块；7-侧出口导流层；8-中间出口导流层；9-声分选模块；10-压电基底；11-样品液入口A；12-定位孔A；21-样品液入口B；22-直流道；23-弯流道；24-样品液出口；25-定位孔B；31-样品液入口C；32-螺旋流道；33-螺旋单元内出口；34-螺旋单元外出口；35-定位孔C；41-初级分选收集液入口A；42-初级分选废液入口A；43-初级分选收集液出口A；44-初级分选收集液流道；45-定位孔D；51-初级分选废液入口B；52- 初级分选废液出口；53-第五初级分选收集液出口B；54-初级分选废液流道；55-定位孔 E；61-初级分选收集液入口B；62-浓缩流道；63-浓缩单元收集液出口；64-浓缩单元废液流道；65-浓缩单元废液出口；66-初级分选废液入口C；67-定位孔F；71-浓缩单元废液入口；72-浓缩单元废液汇集出口；73-浓缩单元收集液入口A；74-浓缩单元废液汇集流道；75-定位孔G；81-浓缩单元收集液入口B；82-浓缩单元收集液汇集流道；83-浓缩单元收集液汇集出口；84-分选浓缩废液出口；85-定位孔H；91-声分选样品液入口；92- 对称正弦流道；93-直流道；94-二级分选收集液出口；95-第一废液出口A；96-第二废液入口；97-第二废液流道；98-第二废液出口A；99-定位孔I；101-叉指换能器；102-二级分选收集液出口；103-第一废液出口B；104-第二废液出口B；105-定位孔J。

具体实施方式

下面将结合附图对本申请技术方案进行详细说明。

如图1所示，本申请实施例的一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片，包括自上而下依次设置的上盖板1、上导流层2、初级分选模块3、内出口导流层4、外出口导流层5、浓缩模块6、侧出口导流层7、中间出口导流层8、声分选模块9和压电基底10。

作为具体实施例地，上述上盖板1、上导流层2、初级分选模块3、内出口导流层4、外出口导流层5、浓缩模块6、侧出口导流层7、中间出口导流层8、声分选模块9均由聚合物薄膜材料制成。

如图2所示，上盖板1上设置有样品液入口A11和4个定位孔A12。

如图3所示，上导流层2上设置有样品液入口B21、4条直流道22、4条弯流道23、样品液出口24和4个定位孔B25。直流道22的一端与样品液入口B21联通、另一端与弯流道23的中间联通；弯流道23的两端均与样品液出口24联通。4条直流道22与4条弯流道23联通构成8条长度相等的流道，使样品液从样品液入口B21流到样品液出口24。

如图4所示，初级分选模块3上设置有至少8个相同的惯性螺旋单元，每个惯性螺旋单元包括样品液入口C31、螺旋流道32、螺旋单元内出口33、螺旋单元外出口34和4 个定位孔C35。螺旋流道32的一端与样品液入口C31联通、另一端分别与螺旋单元内出口33和螺旋单元外出口34联通。

作为具体实施例地，螺旋流道32、螺旋单元内出口33和螺旋单元外出口34呈Y形结构。每个螺旋流道32的螺旋单元内出口33与左相邻的螺旋流道32的螺旋单元内出口 33联通，每个螺旋流道32的螺旋单元外出口34与右相邻的螺旋流道32的螺旋单元外出口34联通。螺旋流道32的垂直截面为宽度大于高度的矩形结构或梯形结构。

如图5所示，内出口导流层4上设置有4个初级分选收集液入口A41、4个初级分选废液入口A42、初级分选收集液出口A43、初级分选收集液流道44和4个定位孔D45。初级分选收集液入口A41与初级分选收集液出口A43通过初级分选收集液流道44进行联通。

作为具体实施例地，初级分选收集液流道44呈“H”形结构，“H”形结构中“-”表示的横向流道中间与初级分选收集液出口A43联通，其4个端点分别与初级分选收集液入口A41联通。

如图6所示，外出口导流层5上设置有4个初级分选废液入口B51、初级分选废液出口52、初级分选收集液出口B53、初级分选废液流道54和4个定位孔E55。初级分选废液入口B51与初级分选废液出口52通过初级分选废液流道54进行联通。

作为具体实施例地，初级分选废液流道54呈“H”形结构，“H”形结构中“-”表示的横向流道呈“︿”形，其4个端点分别与初级分选废液入口B51联通，“︿”形的中间与初级分选废液出口52联通。

如图7所示，浓缩模块6上设置有初级分选收集液入口B61、至少4个浓缩单元、初级分选废液入口C66和4个定位孔F67。每个浓缩单元包括浓缩流道62和浓缩单元废液流道64，浓缩流道62的一端与初级分选收集液入口B61联通、另一端联通有浓缩单元收集液出口63；浓缩单元废液流道64的两端均联通有浓缩单元废液出口65。

作为具体实施例地，浓缩流道62为非对称正弦结构。

如图8所示，侧出口导流层7上设置有8个浓缩单元废液入口71、浓缩单元废液汇集出口72、4个浓缩单元收集液入口A73、浓缩单元废液汇集流道74和4个定位孔G75。浓缩单元废液入口71和浓缩单元废液汇集出口72通过浓缩单元废液汇集流道74联通。

作为具体实施例地，浓缩单元废液汇集流道74上的对称中心与浓缩单元废液汇集出口72联通；浓缩单元废液汇集流道74的8个端部分别与浓缩单元废液入口71联通。

如图9所示，中间出口导流层8上设置有4个浓缩单元收集液入口B81、浓缩单元收集液汇集流道82、浓缩单元收集液汇集出口83、分选浓缩废液出口84和4个定位孔H85。浓缩单元收集液入口B81和浓缩单元收集液汇集出口83通过浓缩单元收集液汇集流道82 联通。

作为具体实施例地，浓缩单元收集液汇集流道82呈“十”字形结构，其对称中心与浓缩单元收集液汇集出口83联通，4个端点分别与浓缩单元收集液入口B81联通。

如图10所示，声分选模块9上设置有声分选样品液入口91、对称正弦流道92、直流道93、二级分选收集液出口94、第一废液出口A95、第二废液入口96、第二废液流道 97、第二废液出口A98和4个定位孔I99。

直流道93下方设有空槽结构910。对称正弦流道92的一端与声分选样品液入口91联通、另一端与直流道93联通；直流道93的一端分别与二级分选收集液出口94和第一废液出口A95联通；第二废液流道97的一端与第二废液入口96联通、另一端与第二废液出口A98联通。

作为具体实施例地，直流道93与二级分选收集液出口94和第一废液出口A95呈“Y”形结构。

如图11所示，压电基底10上设置有叉指换能器101、二级分选收集液出口102、第一废液出口B103、第二废液出口B104和4个定位孔J105。

直流道(93)与叉指换能器101的垂直距离为1mm，叉指换能器101包括若干对叉指；压电基底10采用128°切铌酸锂材料制成，并通过溅射加剥离的技术在铌酸锂表面制作叉指换能器101。

如图1所示，本申请实施例的一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片通过每一层上设置的4个定位孔由下向上依次进行装配，其中，上盖板1的样品液入口A11与上导流层2的样品液入口B21联通，上导流层2的样品液出口24与初级分选模块3的样品液入口C31联通，初级分选模块3的螺旋单元内出口33、螺旋单元外出口34分别与内出口导流层4的初级分选收集液入口A41、初级分选废液入口A42联通，内出口导流层 4的初级分选收集液出口A43、初级分选废液入口A42分别与外出口导流层5的初级分选收集液出口B53、初级分选废液入口B51联通，外出口导流层5的初级分选收集液出口 B53、初级分选废液出口52与浓缩模块6的初级分选收集液入口B61、初级分选废液入口 C66联通，浓缩模块6的浓缩单元收集液出口63、浓缩单元废液出口65分别与侧出口导流层7的浓缩单元收集液入口A73、浓缩单元废液入口71联通，侧出口导流层7的浓缩单元收集液入口A73、浓缩单元废液汇集出口72与中间出口导流层8的浓缩单元收集液入口B81、分选浓缩废液出口84联通，中间出口导流层8的分选浓缩废液出口84、浓缩单元收集液汇集出口83分别与声分选模块9的第二废液入口96、声分选样品液入口91 联通，声分选模块9的二级分选收集液出口94、第一废液出口A95、第二废液出口A98 分别与压电基底10的二级分选收集液出口102、第一废液出口B103、第二废液出口B104 联通。

如图4所示为初级分选模块的结构示意图，样品液分别从每个螺旋分选单元的样品液入口C31进入螺旋流道32，靠近流道中心线处的流体流速要高于靠近流道壁面处的流速，因此在离心力和径向压力梯度不平衡的共同作用下向外流动。由于封闭流道内的质量守恒，靠近外壁面的流体受挤压作用会沿着螺旋流道32的上下壁面产生回流，最终在垂直方向形成两个旋转方向相反的涡流，即Dean流。同时，由于流道中心到流道壁面的流体的流速为抛物线分布，由此产生的速度梯度形成一个指向流道壁面的剪切诱导升力，此外，由于细胞与流道壁面的相互作用形成壁面诱导升力，剪切诱导升力驱动细胞往壁面方向移动，而壁面诱导升力在细胞靠近壁面时使其远离壁面，这两种升力的合力称为惯性升力FL。在样品液进入螺旋流道32之后，受惯性升力FL和Dean流产生的Dean拽力FD的共同作用下，流道内不同尺寸的细胞将会稳定在不同的平衡位置。在本实施例中，具有较大尺寸的循环肿瘤细胞迁移至靠近内壁面的平衡位置，具有小尺寸的血细胞迁移至靠近外壁面的平衡位置。因此，包含循环肿瘤细胞的收集液从螺旋单元内出口33流向下一级，包含大量背景血细胞的废液从螺旋单元外出口34流出。

如图7所示为浓缩模块的结构示意图，经过初级分选模块得到的收集液从初级分选收集液入口B61进入浓缩模块6，初级分选收集液首先进入浓缩流道62，浓缩流道62采用非对称正弦结构，细胞在流道内同时受惯性升力FL和Dean流产生的Dean拽力FD的共同作用，通过设计流道尺寸和控制合适的流速，可以使尺寸较大的循环肿瘤细胞聚焦在流道中心，从浓缩单元收集液出口63流向下一级，使小尺寸的血细胞从浓缩单元废液出口65流出。在浓缩流道62的末端出口与浓缩单元废液出口65之间设置有一定长度的浓缩单元废液流道64，用来匹配流阻，使流道内的流体满足流速要求。此外，浓缩模块 6设置了4个浓缩单元，当经过初级分选模块得到的收集液通过4个浓缩单元浓缩之后，大部分包含有背景血细胞的收集液从浓缩单元废液出口65流出，剩下小部分体积包含有循环肿瘤细胞的收集液进入声分选模块9。设置多个浓缩单元的目的是提高浓缩倍数，由于声分选相较于惯性分选通量较小，因此，通过浓缩模块6使进入声分选的样品液通量符合要求。

如图10所示为声分选模块的结构示意图，声分选模块9上设置有对称正弦流道92和直流道93，经过浓缩模块6得到的样品液由声分选样品液入口91首先进入对称正弦流道92，细胞在流道内同时受惯性升力FL和Dean流产生的Dean拽力FD的共同作用，使细胞聚焦到流道中心进入直流道93。在直流道93下方1mm处设置有一组叉指换能器101，对叉指换能器101施加交流电信号，根据逆压电效应会在压电基底上产生声表面波，当样品液中细胞通过直流道93时会受到声辐射力的作用，而声辐射力与细胞体积成正相关，因此，具有较大体积的循环肿瘤细胞所受的声辐射力要远大于血细胞，导致循环肿瘤细胞向上侧迁移从二级分选收集液出口94流出，而血细胞受声辐射力作用效果不明显，可以保持原来的运动轨迹从第一废液出口A95流出。

如图1所示，本发明实施例的一种集成惯性与声波技术的循环肿瘤细胞分选芯片的工作过程如下：

1.注射器以一定的流速将样品液从样品液入口A11注入到芯片，经过上导流层2的直流道22和弯流道23后将样品液分为8份，注入到初级分选模块3上8个惯性螺旋单元的样品液入口C31，样品液经过螺旋流道32后，细胞同时受惯性升力FL和Dean流产生的Dean拽力FD的共同作用，包含循环肿瘤细胞的样品液从螺旋单元内出口33流出，包含大量背景血细胞的废液从螺旋单元外出口34流出，完成样品液的初级分选。

2.经过初级分选得到的样品液通过内出口导流层4将内出口的样品液汇集到一起并流入浓缩模块6的初级分选收集液入口B61，外出口导流层5将外出口的废液汇集到一起并流向浓缩模块6的初级分选废液入口C66。由初级分选得到的收集液在浓缩模块6上通过4个浓缩单元进行浓缩，收集液经过非对称正弦结构的浓缩流道62，受惯性升力FL 和Dean流产生的Dean拽力FD的共同作用，包含循环肿瘤细胞的收集液从浓缩单元收集液出口63流出，包含血细胞的废液经过浓缩单元废液流道64从浓缩单元废液出口65流出，经过浓缩模块6之后，注入的高通量的样品液被极大的浓缩，包含背景血细胞的废液都没有进入下一级分选。

3.经过浓缩模块6得到的废液通过侧出口导流层7的浓缩单元废液入口71汇集到一起并流向声分选模块9的第二废液入口96，中间出口导流层8通过浓缩单元收集液入口B81将浓缩之后的收集液汇集到一起并流向声分选模块9的声分选样品液入口91。浓缩之后的收集液首先经过对称正弦流道92，受惯性升力FL和Dean流产生的Dean拽力FD 的共同作用使细胞可以聚焦到流道中心，并进入直流道93。在直流道93中，对叉指换能器101施加交流电信号，则循环肿瘤细胞受到声辐射力的作用向上迁移从二级分选收集液出口94流出，而血细胞受声辐射力作用不明显按照原路径从第一废液出口A95流出。通过初级分选和浓缩之后得到的废液则通过第二废液流道97从第二废液出口A98流出。由此实现了循环肿瘤细胞高通量和高精度分选。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述具体实施例的限制，上述具体实施例和说明书中的描述只是为了进一步说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由权利要求书及其等效物界定。