一种牦牛PCSK1基因CNV标记的检测方法与应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于RT-qPCR技术检测牦牛PCSK1基因CNV标记的方法及其应用。

背景技术

随着分子生物学和基因组学等学科的发展，动物育种技术正在由常规的表型选育向分子育种方向发展。分子标记辅助育种(molecular marker-assisted breeding,MAS)是通过将现代分子生物学与传统育种技术相结合，培育优良动植物品种的重要方法之一。该方法是通过对性状紧密相关的DNA分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)，是一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，指发生在生基因组上的长度大于50bp的DNA片段以重复、缺失及互相组合衍生出的微结构变异。对于位置明确的CNV，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法，如RT-qPCR、MLPA、FISH和数字PCR等。其中，RT-qPCR最为常用。在RT-qPCR反应体系中加入的荧光染料，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。利用RT-qPCR技术检测CNV的理论基础是通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，采用2

PCSK1是一种丝氨酸内切蛋白酶，其主要参与动物胰岛素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素等多种神经内分泌激素原蛋白的加工和生物激活以及能量代谢过程。本发明意外发现，所述PCSK1基因位于CNV区域，因此提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，并提供了一种方便、准确、大样本量的检测牦牛PCSK1基因CNV的方法，为牦牛的生长性状的早期选育提供了基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牦牛PCSK1基因CNV标记的方法及其应用。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为牦牛PCSK1基因候选区域NW_005394088.1：602936-646787的拷贝数变异。

第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在检测牦牛生长性状或在牦牛早期育种中的应用。

优选地，所述检测牦牛生长性状或在牦牛早期育种具体为：根据2

优选地，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因BTF3引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCCCCAAATGTTCTGAAATCGT-3’；

下游引物R1：5’-CTGGTCCCAAGGGGATTTCG-3’；

所述参照基因BTF3引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGCAGCAAACACTTTCACCATT-3；

下游引物R2：5’-AGCAAAACCGCTACTAGCAAACTC-3’。

第三方面，本发明提供了一种用于检测与牦牛生长性状相关的CNV标记的引物对，所述引物对包括目标基因引物对P1和参照基因BTF3引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：5’-CCCCCAAATGTTCTGAAATCGT-3’；

下游引物R1：5’-CTGGTCCCAAGGGGATTTCG-3’；

所述参照基因BTF3引物对P2为：

上游引物F2：5’-GGCAGCAAACACTTTCACCATT-3；

下游引物R2：5’-AGCAAAACCGCTACTAGCAAACTC-3’。

第四方面，本发明提供了用于RT-qPCR技术检测上述第一方面所述CNV标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有上述第三方面所述的引物对。

优选地，所述试剂盒还包括

第五方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，所述方法包括以下步骤：

以牦牛的基因组DNA为模板，通过RT-qPCR技术分别利用权利要求5所述的引物对扩增牦牛PCSK1基因的CNV区域和参照基因BTF3；

根据2

优选地，所述RT-qPCR扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA 1μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，

优选地，所述RT-qPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：95℃30s；

(2)扩增反应：95℃变性30s，62℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；

(3)绘制熔解曲线：95℃10s，从65℃到97℃，+0.5℃5s。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为牦牛PCSK1基因候选区域NW_005394088.1：602936-646787的拷贝数变异；

本发明提供了检测CNV标记的方法，以牦牛的血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增牦牛PCSK1基因CNV区域并将BTF3基因作为参照，根据Log

本发明以牦牛PCSK1基因的CNV为候选位点，通过RT-qPCR检测该位点在牦牛群体中的拷贝数变异情况，并与6月龄、12月龄18月龄和30月龄的体重、体高、体斜长和胸围等重要经济性状进行关联分析；如果检测PCSK1基因的拷贝数变异类型正常型和插入型，则待测牛的12月龄、30月龄牦牛的胸围更优异，具有更好生长性能；研究该基因CNV并将其与牦牛重要生长性状关联分析至关重要，可以为我国牦牛分子育种提供理论依据，便于牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的牦牛种群。

本发明提供的牦牛基因的拷贝数变异检测方法，可用于牦牛的早期选育；检测PCSK1基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；PCSK1基因拷贝数变异位点的检出，为牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明中进行RT-RT-qPCR绘制的PCSK1基因扩增曲线；

图2本发明中进行RT-RT-qPCR绘制的BTF3基因扩增曲线；

图3本发明中进行RT-RT-qPCR绘制的PCSK1基因熔解曲线；

图4本发明中进行RT-RT-qPCR绘制的BTF3基因熔解曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明利用RT-qPCR对牦牛PCSK1基因的拷贝数变异进行检测，下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明所涉及的一种基于RT-qPCR技术对牦牛PCSK1基因CNV标记进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库的牦牛PCSK1基因序列，再用Primer-BLAST网站进行引物设计，并用PCR检验引物；

(2)采用RT-qPCR技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与牦牛各年龄阶段的生长性状进行关联分析，筛选到与牦牛生长性状相关的CNV标记；

(4)根据拷贝数变异类型挑选获得生长性状优异的牦牛种群，进行选育。

实施例检测阿什旦牦牛PCSK1基因CNV标记

1、牦牛样本采集

本发明以阿什旦牦牛作为检测对象，共采集了213头具有生长性状记录的牦牛的血液样本。

2、血液基因组DNA的提取

(1)向5ml含抗凝剂的血液中加入5ml细胞裂解液CL，颠倒混匀5次，3,600rpm(2，000×g)离心2min，倒弃上清；

(2)再向其中加入7.5ml细胞裂解液CL，颠倒混匀5次，3,600rpm(2,000×g)离心2min，倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2min，确保沉淀在管中；

(3)配制缓冲液FG与Proteinase K的混合液；

(4)加入2.5ml缓冲液FG与Proteinase K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块；

(5)65℃水浴30min，其间颠倒混匀数次；

(6)加入2.5ml异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA；

(7)3,600rpm(～2,000×g)离心8min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保沉淀在管中；

(8)加入2.5ml 70％乙醇，涡旋振荡5sec，3,600rpm(～2,000×g)离心3min，倒弃上清；

(9)重复操作步骤H；

(10)将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5min，确保沉淀在管中；

(11)空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净；

(12)加入500μl缓冲液TB，低速涡旋5sec，65℃加热1h熔解DNA，其间轻弹数次助溶。

3、基因组DNA浓度和纯度检测

利用Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD

4、目标基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牦牛PCSK1基因(GenBankAccession No.NW_005394088.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计RT-qPCR引物(引物对P1)，对检测PCSK1基因拷贝数变异，同时以NCBI所公布的牦牛BFT3基因序列(GenBankAccession No.NW_005393074.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因中一段157bp的序列的RT-PCR引物(引物对P2)。引物对序列信息如表1所示。

表1实时荧光定量PCR的引物信息

注明：F表示上游引物，R表示下游引物。

通过绘制扩增曲线和熔解峰来确定引物是否适用于RT-qPCR分析。扩增曲线平滑，表明RT-qPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适(图1和图2)；绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(图3和图4)。

其中，进行RT-qPCR所用的扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA 1μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，

PCR扩增的反应程序为：

(1)预变性：95℃30s；

(2)扩增反应：95℃变性30s，62℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；

(3)绘制熔解曲线：95℃10s，从65℃到97℃，+0.5℃5s。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列(引物对P1)和参考序列(引物对P2)的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2

根据Log

5.牦牛PCSK1基因CNV位点与生长性状的关联分析

生产数据：6月龄、12月龄、18月龄和30月龄的体重、体高、体长和胸围。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了线性模型：

Yij＝μ+Ai+Gij+Eij

其中：Yij为生长性状的观察值，μ为群体平均值，Ai为年龄效应，Gj为基因型的固定效应，Eij为随机残差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。PCSK1基因CNV与牦牛品种生长性状的关联分析结果如表2所示，其中，表中所计算的数值Mean±SE为平均值±标准误差；在同一行中数值的右上角标有不同小写字母代表同行数据间差异显著水平P＜0.05。

关联分析结果表明：牦牛PCSK1基因CNV位点可显著影响12月龄、30月龄胸围，优势拷贝数变异类型为正常型和缺失型，说明PCSK1基因CNV位点可以作为牦牛生长性状的候选分子遗传标记。

表2 PCSK1基因CNV与牦牛品种生长性状的关联分析

6.上述CNV标记在牦牛选育中的应用

获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座，以对牦牛进行分子标记辅助选择，从而加快牦牛品种改良的选育进程。