一种白背飞虱Ago1基因、合成dsRNA的方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术的领域，特别涉及一种白背飞虱Ago1基因、合成 dsRNA的方法及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用。

背景技术

白背飞虱Sogatalla furcifera(Horváth)属于半翅目Hemiptera飞虱科Delphacidae，是水稻生产中危害严重的害虫之一，其主要以若虫和成虫刺吸水稻茎秆汁液，造成养分流失；同时还传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streakeddwarf virus,SRBSDV)等病毒。作为一种迁飞性害虫，在适宜环境条件时，白背飞虱易爆发，给水稻生产带来严重经济损失。白背飞虱的防治目前仍主要依赖于化学农药，然而，长期不合理和过度的使用化学农药导致白背飞虱产生抗药性，杀伤天敌和污染环境。因此，研究并开发环境友好型的新型杀虫剂对白背飞虱的防控工作具有重大意义。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由小分子dsRNA引起目的基因 mRNA序列特异性降解，导致靶标基因沉默或表达量下调的现象。RNAi已成为研究昆虫基因功能的一个重要工具，且该技术在植保领域已成为新的害虫防治手段：其利用昆虫体内基因片段，通过RNAi抑制害虫生长发育至关重要的基因的转录水平，以达到防治害虫的目的。因此，应用RNAi技术开发新型杀虫剂对于害虫防治具有重要意义。

昆虫RNAi通路中的蛋白主要有Drosha蛋白、Dicer蛋白、Argonaute蛋白以及dsRNA结合结构域蛋白(double-stranded RNA binding domain protein)，其中Argonaute蛋白作为RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex, RISC)的核心元件。Ago蛋白亚类的两个成员分别为Ago1和Ago2，其中Agol 包含DUF1785结构域、PAZ结构域和PIWI结构域。Ago1作为昆虫体内miRNA 通路的重要组分，其能特异性地招募miRNA从而参与mRNA的沉默，从而调控基因表达。

通过干扰Ago1基因探究miRNA在昆虫生长发育、生殖、抗性、免疫等方面的功能研究表明该基因与昆虫各种生长发育过程密切相关。但是目前针对白背飞虱Ago1基因的研究未见相关报道，也未见针对白背飞虱Ago1基因其在 RNAi介导害虫防治的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种白背飞虱Ago1基因、合成dsRNA的方法及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用，该白背飞虱Ago1 基因采用RNA干扰技术制备，注射白背飞虱Ago1基因dsRNA至4龄若虫后出现较高致死现象，因此，Ago1基因在害虫防治中可作为一个新颖的防治靶标。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种白背飞虱Ago1基因，包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列及SEQ ID NO：3所示的靶标基因序列。

所述SEQ ID NO：1为：

atggcagttc cttgttctga tatgcagctt ataaggaggg aaccacaaac agtgtccatgcttggaaaaa cctatggatg tggacagtgt tcagctcctc cgcctggagc gttgggagca gctccggggccagtggctcc agctggtggg ccagtagccg gcatgcctcc gggagcgatg ggcctacttc cgccacagcagccccaccag caacctccgc agcctcccga tcttcccatg ttcaactgcc ccagaaggcc gaaccttggcagagaaggtc gaccaatcgt tttgcgtgcc aatcattttc aaatcacgat gccccgcggg ttcgttcatcattatgacat aaacattcag ccggacaagt gtcctcgcaa agtcaaccgt gagatcattg aaactatggtgacagcttac agtaaaatat ttggaaactt gaagccagtc ttcgatggcc gcagcaactt gtacacccgagatcccctgc caattggcaa tgatcgcatg gagcttgagg tgacattgcc gggcgaaggc aaggatcgtgtgttcagggt ggcgatcaag tggctggcgc aggtgtcgct gttcgcgctg gaggaggcgc tggaaggccgtacccgacag atcccctacg acgccatcct ggcactcgac gtcgtcatga ggcacttgcc ctcgatgacctacacccctg tcggccgctc cttcttctcc tcacccgacg gctactatca tccgctcggc ggcggcagagaggtgtggtt cgggttccat caatcagtga ggccgtcaca gtggaagatg atgttgaaca ttgacgtatctgcgacggcg ttttacaaag cgcagcctgt gatagagttc atgtgcgaag tgctcgacat tcgcgacataaacgaccagc gcaagccatt gactgattcc cagcgcgtca aatttaccaa agaaatcaaa ggcttgaaaattgagattac tcactgtgga actatgagac gcaagtaccg tgtttgcaac gtcacgcgcc ggcctgcccagatgcagtcg tttcctctgc agctggaaaa tggacaaacc gtcgagtgta cagtggccaa gtacttcttggacaagtaca aaatgaaact gagatacccc caccttcctt gtcttcaggt cggacaagag cataagcatacttatcttcc cctagaggtg tgcaacatag tggccgggca gcggtgcatc aagaagctga ccgacatgcagacgtcgacg atgatcaagg cgacagcgcg ttcggcgccg gaccgcgagc gtgagatcaa caacctggtgcggcgcgccg acttcaacaa cgatgcctac gtgcaggagt tcggcctcac catctccaac aatatgatggaggtgcgcgg tcgcgtcctc cccccgccca agctacagta cggcggacgc gtcagctctc tctccggacagcaggaattt cagggctgca atgtgctgca gacgaaacag caagcgatgc ccaatcaggg tgtgtgggacatgcgtggca agcagttctt cactggcgtc gagattcgag tctgggcgat cgcctgcttt gctccacaacgcactgtgcg tgaagatgcg ctcagaaact tcactcaaca attgcagaaa atcagtaacg atgctggcatgccaataatc ggccaacctt gtttttgcaa gtacgctact ggccctgacc aagtggagcc gatgttccggtacctgaaaa attctttcca ggctctacaa ttggtcgtag ttgttcttcc aggaaaaact ccagtatatgctgaagtgaa gcgagtgggc gatacagtgc tgggaatggc gacccagtgt gtgcaggcca aaaatgtcaacaagacttcc ccacagaccc tttccaatct ttgtctaaag atcaatgtca agcttggtgg aatcaacagcatacttgttc ctagcattag acccaaggtg ttcaatgagc cggtgatatt cctgggtgcc gacgtgacgcacccgccggc cggcgacaac aagaagccgt cgattgcggc agtggtcggg tcgatggacg cgcatcctagccggtatgca gccactgtgc gcgtgcaaca gcatcgccag gagatcattc aggagctgag ctccatggtcagagaacttc ttatcatgtt ctacaaaagc actggaggct acaaaccaca tcgtattatt ctatacagagatggtgtatc cgagggacag ttccttcacg ttctacagca tgagctgact gctatcagag aagcgtgtatcaaacttgaa ggagactata agcctggaat cacattcatt gttgttcaga agcgacatca cacaaggctgttctgtgcag acaagaagga acagtctgga aaatcaggca acattccagc aggcacaacg gttgacgtaggcatcacaca tccaactgaa tttgatttct acctttgcag tcatcaaggc attcaaggta cgagcagaccgagtcactac cacgtgctgt gggacgacaa ccactttgac tcagacgagc tgcagtgcct gacctaccagctgtgccaca cctatgtgcg ctgcactaga tccgtctcca ttccggcgcc cgcctactac gcgcacctcgtcgccttccg cgcccgctat catctcgtcg agaaagagca tgacagtcat ggtgattgtt tcagtggcgagggctcgcac cagagcggct gcagcgagga ccgcacgcca ggagccatgg cccgcgccat cactgtccacgccgacacca aaaaggtcat gtactttgct tag。

所述SEQ ID NO：2为：

mavpcsdmql irrepqtvsm lgktygcgqc sapppgalga apgpvapagg pvagmppgamgllppqqphq qppqppdlpm fncprrpnlg regrpivlra nhfqitmprg fvhhydiniq pdkcprkvnreiietmvtay skifgnlkpv fdgrsnlytr dplpigndrm elevtlpgeg kdrvfrvaik wlaqvslfaleealegrtrq ipydailald vvmrhlpsmt ytpvgrsffs spdgyyhplg ggrevwfgfh qsvrpsqwkmmlnidvsata fykaqpvief mcevldirdi ndqrkpltds qrvkftkeik glkieithcg tmrrkyrvcnvtrrpaqmqs fplqlengqt vectvakyfl dkykmklryp hlpclqvgqe hkhtylplev cnivagqrcikkltdmqtst mikatarsap drereinnlv rradfnnday vqefgltisn nmmevrgrvl pppklqyggrvsslsgqqef qgcnvlqtkq qampnqgvwd mrgkqfftgv eirvwaiacf apqrtvreda lrnftqqlqkisndagmpii gqpcfckyat gpdqvepmfr ylknsfqalq lvvvvlpgkt pvyaevkrvg dtvlgmatqcvqaknvnkts pqtlsnlclk invklggins ilvpsirpkv fnepviflga dvthppagdn kkpsiaavvgsmdahpsrya atvrvqqhrq eiiqelssmv rellimfyks tggykphrii lyrdgvsegq flhvlqheltaireacikle gdykpgitfi vvqkrhhtrl fcadkkeqsg ksgnipagtt vdvgithpte fdfylcshqgiqgtsrpshy hvlwddnhfd sdelqcltyq lchtyvrctr svsipapayy ahlvafrary hlvekehdshgdcfsgegsh qsgcsedrtp gamaraitvh adtkkvmyfa*。

所述SEQ ID NO：3为：

tggtcgtagt tgttcttcca ggaaaaactc cagtatatgc tgaagtgaag cgagtgggcgatacagtgct gggaatggcg acccagtgtg tgcaggccaa aaatgtcaac aagacttccc cacagaccctttccaatctt tgtctaaaga tcaatgtcaa gcttggtgga atcaacagca tacttgttcc tagcattagacccaaggtgt tcaatgagcc ggtgatattc ctgggtgccg acgtgacgca cccgccggcc ggcgacaacaagaagccgtc gattgcggca gtggtcgggt cgatggacgc gcatcctagc cggtatgcag ccactgtgcgcgtgcaacag catcgccagg agatcatt。

一种采用上述白背飞虱Ago1基因片段体外合成dsRNA的方法，基于所述核苷酸序列SEQ ID NO：1通过Primer Premier 6.0软件设计携带T7 启动子的dsRNA上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，然后通过PCR扩增得PCR产物；将所得PCR产物进行纯化后，克隆转化至大肠杆菌中；以测序正确的菌液进行扩大培养，提取含有目的基因片段的质粒；以提取的质粒为模板，将带有T7启动子的引物再PCR扩增，PCR产物胶回收与纯化后，以该胶回收的高浓度产物为模板，参照Transcript Aid T7High Yield Transcription (Thermo)试剂盒说明书在体外转录合成dsRNA。

所述SEQ ID NO：4为：taatacgact cactataggg tggtcgtagt tgttcttcc。

所述SEQ ID NO：5为：taatacgact cactataggg aatgatctcc tggcgatg。

所述的测序正确，为DNA片段中核苷酸序列如SEQ ID NO：3。

一种白背飞虱Ago1基因在RNAi介导的害虫防治方面应用，所述体外合成dsRNA包含对白背飞虱蜕皮过程具有破坏作用的物质。所述RNAi 介导中，将体外合成的dsRNA以显微注射的方式传递至白背飞虱4龄若虫体内；特异性沉默靶标基因后，白背飞虱蜕皮过程受破坏，最终导致死亡。所述dsRNA注射体积为0.1μl，注射浓度为100ng/μl，注射部位为白背飞虱4龄若虫的前胸和中胸相接处。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明以白背飞虱含有SEQ ID NO：3基因为靶标基因，并通过dsRNA 显微注射的方式进入白背飞虱体内，注射后观察表型和统计死亡数，结果实验组有明显的蜕皮异常、翅畸形等表型，干扰10d后死亡率87％，其中蜕皮异常致死率占85％。本发明可用于以RNA干扰介导的害虫防治，同时也可用于新型杀虫剂靶标基因的研发。

附图说明

图1为本发明白背飞虱Ago1基因的蛋白结构域分布图。

图2为本发明白背飞虱4龄若虫体内注射SfAgo1基因的dsRNA48和72h 后的SfAgo1基因相对表达量(以白背飞虱核糖体蛋白9(SfRPL9)为内参基因， dsSfAgo1为实验组，dsGFP为对照组)示意图。

图3为本发明白背飞虱4龄若虫注射SfAgo1基因片段的dsRNA 1-10d后的绘制白背飞虱若虫存活率曲线图(其中dsGFP为对照组，SfAgo1为实验组)。

图4为白背飞虱4龄若虫注射dsSfAgo1和dsGFP后，对白背飞虱蜕皮发育的影响的结果对照图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所实现的白背飞虱Ago1基因，包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列及SEQ ID NO：3所示的靶标基因序列。

所述SEQ ID NO：1为：

atggcagttc cttgttctga tatgcagctt ataaggaggg aaccacaaac agtgtccatgcttggaaaaa cctatggatg tggacagtgt tcagctcctc cgcctggagc gttgggagca gctccggggccagtggctcc agctggtggg ccagtagccg gcatgcctcc gggagcgatg ggcctacttc cgccacagcagccccaccag caacctccgc agcctcccga tcttcccatg ttcaactgcc ccagaaggcc gaaccttggcagagaaggtc gaccaatcgt tttgcgtgcc aatcattttc aaatcacgat gccccgcggg ttcgttcatcattatgacat aaacattcag ccggacaagt gtcctcgcaa agtcaaccgt gagatcattg aaactatggtgacagcttac agtaaaatat ttggaaactt gaagccagtc ttcgatggcc gcagcaactt gtacacccgagatcccctgc caattggcaa tgatcgcatg gagcttgagg tgacattgcc gggcgaaggc aaggatcgtgtgttcagggt ggcgatcaag tggctggcgc aggtgtcgct gttcgcgctg gaggaggcgc tggaaggccgtacccgacag atcccctacg acgccatcct ggcactcgac gtcgtcatga ggcacttgcc ctcgatgacctacacccctg tcggccgctc cttcttctcc tcacccgacg gctactatca tccgctcggc ggcggcagagaggtgtggtt cgggttccat caatcagtga ggccgtcaca gtggaagatg atgttgaaca ttgacgtatctgcgacggcg ttttacaaag cgcagcctgt gatagagttc atgtgcgaag tgctcgacat tcgcgacataaacgaccagc gcaagccatt gactgattcc cagcgcgtca aatttaccaa agaaatcaaa ggcttgaaaattgagattac tcactgtgga actatgagac gcaagtaccg tgtttgcaac gtcacgcgcc ggcctgcccagatgcagtcg tttcctctgc agctggaaaa tggacaaacc gtcgagtgta cagtggccaa gtacttcttggacaagtaca aaatgaaact gagatacccc caccttcctt gtcttcaggt cggacaagag cataagcatacttatcttcc cctagaggtg tgcaacatag tggccgggca gcggtgcatc aagaagctga ccgacatgcagacgtcgacg atgatcaagg cgacagcgcg ttcggcgccg gaccgcgagc gtgagatcaa caacctggtgcggcgcgccg acttcaacaa cgatgcctac gtgcaggagt tcggcctcac catctccaac aatatgatggaggtgcgcgg tcgcgtcctc cccccgccca agctacagta cggcggacgc gtcagctctc tctccggacagcaggaattt cagggctgca atgtgctgca gacgaaacag caagcgatgc ccaatcaggg tgtgtgggacatgcgtggca agcagttctt cactggcgtc gagattcgag tctgggcgat cgcctgcttt gctccacaacgcactgtgcg tgaagatgcg ctcagaaact tcactcaaca attgcagaaa atcagtaacg atgctggcatgccaataatc ggccaacctt gtttttgcaa gtacgctact ggccctgacc aagtggagcc gatgttccggtacctgaaaa attctttcca ggctctacaa ttggtcgtag ttgttcttcc aggaaaaact ccagtatatgctgaagtgaa gcgagtgggc gatacagtgc tgggaatggc gacccagtgt gtgcaggcca aaaatgtcaacaagacttcc ccacagaccc tttccaatct ttgtctaaag atcaatgtca agcttggtgg aatcaacagcatacttgttc ctagcattag acccaaggtg ttcaatgagc cggtgatatt cctgggtgcc gacgtgacgcacccgccggc cggcgacaac aagaagccgt cgattgcggc agtggtcggg tcgatggacg cgcatcctagccggtatgca gccactgtgc gcgtgcaaca gcatcgccag gagatcattc aggagctgag ctccatggtcagagaacttc ttatcatgtt ctacaaaagc actggaggct acaaaccaca tcgtattatt ctatacagagatggtgtatc cgagggacag ttccttcacg ttctacagca tgagctgact gctatcagag aagcgtgtatcaaacttgaa ggagactata agcctggaat cacattcatt gttgttcaga agcgacatca cacaaggctgttctgtgcag acaagaagga acagtctgga aaatcaggca acattccagc aggcacaacg gttgacgtaggcatcacaca tccaactgaa tttgatttct acctttgcag tcatcaaggc attcaaggta cgagcagaccgagtcactac cacgtgctgt gggacgacaa ccactttgac tcagacgagc tgcagtgcct gacctaccagctgtgccaca cctatgtgcg ctgcactaga tccgtctcca ttccggcgcc cgcctactac gcgcacctcgtcgccttccg cgcccgctat catctcgtcg agaaagagca tgacagtcat ggtgattgtt tcagtggcgagggctcgcac cagagcggct gcagcgagga ccgcacgcca ggagccatgg cccgcgccat cactgtccacgccgacacca aaaaggtcat gtactttgct tag。

所述SEQ ID NO：2为：

mavpcsdmql irrepqtvsm lgktygcgqc sapppgalga apgpvapagg pvagmppgamgllppqqphq qppqppdlpm fncprrpnlg regrpivlra nhfqitmprg fvhhydiniq pdkcprkvnreiietmvtay skifgnlkpv fdgrsnlytr dplpigndrm elevtlpgeg kdrvfrvaik wlaqvslfaleealegrtrq ipydailald vvmrhlpsmt ytpvgrsffs spdgyyhplg ggrevwfgfh qsvrpsqwkmmlnidvsata fykaqpvief mcevldirdi ndqrkpltds qrvkftkeik glkieithcg tmrrkyrvcnvtrrpaqmqs fplqlengqt vectvakyfl dkykmklryp hlpclqvgqe hkhtylplev cnivagqrcikkltdmqtst mikatarsap drereinnlv rradfnnday vqefgltisn nmmevrgrvl pppklqyggrvsslsgqqef qgcnvlqtkq qampnqgvwd mrgkqfftgv eirvwaiacf apqrtvreda lrnftqqlqkisndagmpii gqpcfckyat gpdqvepmfr ylknsfqalq lvvvvlpgkt pvyaevkrvg dtvlgmatqcvqaknvnkts pqtlsnlclk invklggins ilvpsirpkv fnepviflga dvthppagdn kkpsiaavvgsmdahpsrya atvrvqqhrq eiiqelssmv rellimfyks tggykphrii lyrdgvsegq flhvlqheltaireacikle gdykpgitfi vvqkrhhtrl fcadkkeqsg ksgnipagtt vdvgithpte fdfylcshqgiqgtsrpshy hvlwddnhfd sdelqcltyq lchtyvrctr svsipapayy ahlvafrary hlvekehdshgdcfsgegsh qsgcsedrtp gamaraitvh adtkkvmyfa*。

所述SEQ ID NO：3为：

tggtcgtagt tgttcttcca ggaaaaactc cagtatatgc tgaagtgaag cgagtgggcgatacagtgct gggaatggcg acccagtgtg tgcaggccaa aaatgtcaac aagacttccc cacagaccctttccaatctt tgtctaaaga tcaatgtcaa gcttggtgga atcaacagca tacttgttcc tagcattagacccaaggtgt tcaatgagcc ggtgatattc ctgggtgccg acgtgacgca cccgccggcc ggcgacaacaagaagccgtc gattgcggca gtggtcgggt cgatggacgc gcatcctagc cggtatgcag ccactgtgcgcgtgcaacag catcgccagg agatcatt。

一种采用上述白背飞虱Ago1基因片段体外合成dsRNA的方法，基于所述核苷酸序列SEQ ID NO：1通过Primer Premier 6.0软件设计携带T7 启动子的dsRNA上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，然后通过PCR扩增得PCR产物；将所得PCR产物进行纯化后，克隆转化至大肠杆菌中；以测序正确的菌液进行扩大培养，提取含有目的基因片段的质粒；以提取的质粒为模板，将带有T7启动子的引物再PCR扩增，PCR产物胶回收与纯化后，以该胶回收的高浓度产物为模板，参照Transcript Aid T7High Yield Transcription (Thermo)试剂盒说明书在体外转录合成dsRNA。

所述SEQ ID NO：4为：taatacgact cactataggg tggtcgtagt tgttcttcc。

所述SEQ ID NO：5为：taatacgact cactataggg aatgatctcc tggcgatg。

下面结合实施例对本发明的实施进行说明。

实施例1：白背飞虱Ago1基因获取、结构域分析及靶标基因片段验证。

1.白背飞虱Ago1基因序列的获取。

基于白背飞虱基因组和转录组数据库，通过Geneious R9软件对白背飞虱Ago1基因进行搜索，通过NCBI数据库BLAST进行序列比对分析后，获得白背飞虱Ago1基因序列：SEQID NO：1。

2.白背飞虱Ago1基因生物信息学分析。

根据白背飞虱Ago1基因的cDNA序列，利用在线蛋白质翻译软件ExPASy-Translatetool翻译核苷酸序列SEQ ID NO：1，获得氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用在线软件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对白背飞虱Ago1基因所编码的氨基酸序列分析发现，所推导的蛋白质分子式为 C

实施例2：dsRNA基因片段验证与合成

(1)基于所述核苷酸序列SEQ ID NO：1，利用Primer Premier 6.0软件设计含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO：4和下游引物SEQ ID NO：5。因为绿色荧光蛋白GFP在昆虫体内并不存在，故选用GFP基因作为对照基因合成dsRNA。把设计的特异性引物送往北京擎科生物科技有限公司合成。具体序列如下：

T7-SfAgo1-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGTCGTAGTTGTTCTTCC SEQ ID NO 4；

T7-SfAgo1-R：TAATACGACTCACTATAGGGAATGATCTCCTGGCGATG SEQ ID NO 5；

T7-GFP-F：TAATACGACTCACTATAGGGGCCAACACTTGTCACTACTT SEQ ID NO 6；

T7-GFP-R：

TAATACGACTCACTATAGGGGGAGTATTTTGTTGATAATGGTCTG SEQ ID NO 7。

(2)选取白背飞虱若虫和成虫混合，置于1.5mL无RNA酶的离心管中，使用RNA提取试剂盒HP Total RNA Kit(美国Omega公司)，参照说试剂盒明书提取白背飞虱总RNA，然后利用反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit and gDNA Eraser(TaKaRa公司)按照操作说明将总RNA反转录成第一链cDNA。

(3)以上述合成的cDNA为模板，将合成的dsRNA引物进行PCR扩增。PCR 反应体系总体积为25μL，包括：上下游引物(10μmol/L)各1μL，PCR Mix 12.5μL，cDNA模板3μL，ddH

(4)取上述1μL产物在1％琼脂糖凝胶中跑电泳，得到预期大小一致的目的条带。通过E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(美国Omega公司)对PCR产物进行回收与纯化，具体操作步骤参见试剂盒说明书。将胶回收产物连接到pMD18-T载体上(体系为回收产物2μL、SolationⅠ2.5μL和pMD18-T载体0.5μL，16℃过夜孵育)，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在摇床中培养3～4h。然后吸取50μL菌液加入到含有氨苄青霉素(AMP+)的LB固体培养基中，用玻璃棒涂抹均匀，然后倒置于37℃恒温箱过夜培养。取1μL菌液进行菌液PCR检验，吸取检验正确的菌液500mL送北京擎科生物科技有限公司测序。将测序结果通过 SeqMan软件进行比对，获得一段长度为368bp的DNA片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 3。

(5)把测序正确的预留菌液加入到5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床37℃、180rpm震荡培养过夜。质粒提取采用E.Z.N.A.Plasmid Midi(美国Omega公司)试剂盒，步骤参照说明书。

(6)以抽提的质粒为模板，以携带T7启动子的上下游引物进行PCR扩增，反应体系及条件参照上述(3)。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验扩增片段的大小，之后采用E.Z.N.A.Gel&PCR Clean Up Kit(美国Omega公司)进行PCR 产物回收与纯化，并Nanodrop2000spectrophotometer(Thermo Fisher)检测纯化产物的浓度，确保dsDNA浓度≥300ng/L。

(7)回收的dsDNA为模板，采用TranscriptAid T7 High Yield TranscriptionKit (Thermo)试剂盒体外合成dsRNA。合成前，将5X TranscriptAid Reaction Buffer 置于室温解冻，其它试剂也需在冰上进行解冻。待所有试剂解冻后，轻柔混匀后进行短暂离心。具体反应体系如下：ATP 2μL，GTP 2μL，UTP 2μL，CTP 2μ L，5X TranscriptAidReaction Buffer 4μL dsDNA模板1μg，T7 Enzyme Mix 2μ L，Nuclease-free Water补足至20μL。依次加入上述溶液在1.5mL的离心管内，轻柔混匀，短暂离心，随后将其置于PCR仪上37℃孵育8h。待反应结束后，在上述反应体系中加入2μL DNase I，混匀后进行短暂离心，将其置于PCR仪上 37℃孵育10min。然后在反应体系中加入2μL EDTA，轻轻混匀，简易离心，随后将其置于PCR仪上65℃孵育10min，终止反应。

(8)采用Thermo公司的GeneJET RNA Purification Kit试剂盒对dsRNA进行纯化，将纯化得到的作为dsRNA合成模板，使用Transcript Aid T7 High Yield Transcription(Thermo)试剂盒体外合成dsRNA，随后使用试剂盒纯化。

(9)取上述纯化的dsRNA产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，并用Nanodrop 2000核酸浓度分析仪检测dsRNA浓度。置-80℃冰箱保存备用。

实施例3：白背飞虱Ago1基因片段的dsRNA注射干扰实验。

1.白背飞虱Ago1基因基因片段的dsRNA注射。

以大小一致且健康的4龄1d若虫作为实验虫。首先准备2％的琼脂糖平板，供试白背飞虱用CO

2.SfAgo1基因的沉默效率检测。

基于上述注射试验，在注射dsSfAgo1或dsGFP 48和72h后，每个处理收集存活的试虫各10头，3个生物重复。提取总RNA并反转录为cDNA，以SfRPL9 为内参基因，通过qPCR检测RNAi后的SfAgo1转录水平。结果表明，注射 48和72h后，与对照组相比，dsSfAgo1的实验组的相对表达量显著降低，分别下调74％和73％，结果如图2所示。

qPCR引物如下：

Y-SfAgo1-F：TCGCATGGAGCTTGAGGTGACA SEQ ID NO 8

Y-SfAgo1-R：CGTCGGGTGAGGAGAAGAAGGA SEQ ID NO 9

Y-SfRPL9-F：GGGCGAGAAGTACATCCGTAGG SEQ ID NO 10

Y-SfRPL9-R：GCGGCTGATCGTGAGACATCTT SEQ ID NO 11

3.注射dsRNA后白背飞虱死亡情况的统计。

注射dsRNA或dsGFP后，每天观察和记录实验组与对照组的白背飞虱死亡情况。结果表明，注射10d后，注射dsSfAgo1的实验组白背飞虱死亡率高达87％，这与注射dsGFP的对照组(死亡率仅3％)相比，致死效果明显，结果比较如图3所示。

4.注射dsRNA后白背飞虱表型的观察。

白背飞虱4龄1d若虫注射dsGFP后，对照组有97％能成功蜕皮羽化为成虫，且蜕皮后成虫发育状态良好。注射dsSfAgo1后，白背飞虱出现高致死现象，虫体正常死亡仅占供试虫13％；而虫体畸形或旧表皮打开，未能完成整个蜕皮过程导致死亡，达74％。另外，统计发现在存活个体(n＝20)中翅畸形率为25％。表型如图4所示。从而验证SfAgo1基因显著抑制白背飞虱正常的蜕皮发育，且SfAgo1基因是白背飞虱在RNAi介导的害虫防治中较为理想的靶标基因。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。