一种用于口腔癌类器官培养的培养基、及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于口腔癌类器官培养的培养基、使用该培养基培养口腔癌类器官的方法、及其在药物的疗效评估和筛选中的应用。

背景技术

口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤的总称。口腔癌包括原发于口腔舌(舌前2/3)、颊黏膜、牙龈、口底、硬腭的癌症，是全球第六大恶性肿瘤好发区(头颈部)的较常见恶性肿瘤之一，仅次于鼻咽癌，居头颈部恶性肿瘤的第二位。口腔癌可发生于任何年龄，以40～60岁为发病高峰，男女构成比约为2:1。近年来，口腔癌呈现出以下新特点：一是舌癌发病率的增长速度较快，已接近所有口腔癌症的一半；二是口腔癌的患病年龄有年轻化的趋势，20～30岁青年患者并不少见；三是女性患者逐年增多。过去20年，虽然传统治疗方法包括手术、放疗、化疗都有不同程度的发展，但是口腔癌的预后仍然难以让人满意，其5年生存率只有50％～60％左右，大约1/3的患者会复发，而且经过手术治疗的患者吞咽、语言功能及面部容貌等受到严重的影响，存在明显和严重的容貌伤害、进食和语言障碍。影响生存率的主要原因是局部复发和淋巴道转移。因此，新的治疗方法如靶向肿瘤治疗等生物治疗手段正受到越来越多的关注。同时，如何提高药物治疗的抗癌效能，降低药物的毒、副作用，亦即抗癌治疗的靶向性，是抗肿瘤基础和临床研究所关心的问题。

传统临床药物敏感性检测大多采用二维细胞培养。然而，二维培养的细胞仅在有限程度上模拟组织生理条件，缺乏体内真实的组织结构，易导致低分化水平和细胞生理功能的丢失，进而导致获得的实验结果很难预测临床实际结果。类器官，属于三维(3D)细胞培养物，主要来源于人体具有分化能力的胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和成体干细胞。不同组织器官都存在内源组织干细胞，在维持各器官的功能形态发挥着重要作用。这些干细胞在体外一定的诱导条件下，可以自组织形成一个直径仅为几毫米的迷你结构。肿瘤类器官是用取自患者体内原发性肿瘤，在实验室中培养出一些微型的3D肿瘤细胞模型。肿瘤类器官高度模拟了来源肿瘤组织的特征，保留了个体之间的肿瘤异质性，可用于功能性的测试，如进行高通量药物筛选和个体化精准治疗。

当前，口腔癌类器官培养方法多采用基础培养基(DMEM或是DMEM/F12)、R-spondin-1、Noggin以及一些昂贵的蛋白因子，导致类器官培养成本较高；且这项技术操作复杂和技术难度大，导致其大规模商业化应用受到限制。因此，需要开发一种低成本、简单且成功率高的类器官培养方法和培养基。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于在体外快速扩增口腔癌类器官的培养基及培养方法。

本发明的一个方面在于提供一种口腔癌类器官的培养基，所述培养基包含MST1/2激酶抑制剂、选自N2和B27的至少一种细胞培养添加剂、成纤维细胞生长因子、CHIR99021、表皮细胞生长因子、胰岛素、ITS细胞培养添加剂、SB202190、Y27632、地塞米松、GlutaMAX、和非必需氨基酸。其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

R

R

R

R

优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

R

R

R

优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：

(1)MST1/2激酶抑制剂的浓度优选为2.5～10μM；

(2)B27或N2细胞培养添加剂相对于培养基的体积比为1:25～1:100；

(3)成纤维细胞生长因子的浓度优选为3～30ng/mL；

(4)CHIR99021的浓度优选为1.25～5μM；

(5)表皮细胞生长因子的浓度优选为2～18μM；

(6)胰岛素的浓度优选为1～10μg/mL；

(7)ITS细胞培养添加剂相对于培养基的体积比优选为1:30～1:300；

(8)SB202190的浓度优选为100～400nM；

(9)Y27632的浓度优选为3～30μM；

(10)地塞米松的浓度优选为0.02～0.5μM；

(11)GlutaMAX相对于培养基的体积比优选为1:30～1:300；

(12)非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，非必需氨基酸的浓度优选为50～200μM。

在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。

在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，当抗生素选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，当抗生素选自Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL。

本发明还提供一种口腔癌类器官的培养方法。在本发明的口腔癌类器官的培养方法中，使用本发明的口腔癌类器官培养基对口腔癌类器官进行培养。

本发明的口腔癌类器官培养方法包括以下步骤。

1.从口腔癌实体瘤组织分离样本，获得口腔癌原代细胞。该处理过程包括以下步骤：

(1)分离口腔癌组织样本，加入1:3比例的基础培养基和组织消化液(组织消化液的加入量是每1g肿瘤组织使用约10mL组织消化液)中置于恒温摇床中进行消化，消化温度为4～37℃，摇床转速为200rpm～350rpm，消化时间为3～6小时；

(2)消化完成后，离心后弃去上清液，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟。

其中，基础培养基配方包括选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。组织消化液配方包括1640培养基、胶原酶Ⅱ(1～2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(1～2mg/mL)、DNA酶(50～100U/mL)、透明质酸酶(0.5～1mg/mL)、氯化钙(1～5mM)、牛血清白蛋白BSA(5～10mg/mL)。

2.配制本发明的口腔癌类器官培养基，并对上述步骤获得的口腔癌原代细胞进行培养。

将上述步骤1中获得的口腔癌原代细胞用本发明的口腔癌类器官培养基重悬并计数，将细胞密度稀释为5～10×10

本发明还提供一种用于评估或筛选治疗口腔癌疾病的药物的方法，其包括以下步骤：

(1)使用本发明的口腔癌类器官的培养方法培养口腔癌类器官；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的类器官添加稀释后的所述药物；

(4)进行类器官大小或类器官活力测试。

本发明的有益效果包括：

(1)提高口腔癌类器官培养的成功率，成功率达到90％以上；

(2)保证体外原代培养的口腔癌类器官能够保持病人的病理特性；

(3)扩增效率高，能快速培养出口腔癌类器官，扩增出的口腔癌类器官还可以连续传代；

(4)培养成本可控，培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、Noggin蛋白、BMP抑制剂、成纤维细胞生长因子10(FGF10)等因子；

(5)所述技术培养获得的口腔癌类器官数量大，适合高通量筛选候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。

附图说明

图1A-1L为显示本发明口腔癌类器官培养基所添加因子的不同浓度对口腔癌类器官增殖的影响的图。

图2A-2D为利用显微镜观察使用本发明的口腔癌类器官培养基培养得到的口腔癌类器官的照片，其中图2A显示8天后由样本OZ-018培养获得的类器官的照片；图2B显示10天后由样本OZ-019培养获得的类器官的照片；图2C显示7天后由样本OZ-020培养获得的类器官的照片；图2D显示8天后由样本OZ-021培养获得的类器官的照片。

图3A为对样本OZ-020使用本发明的口腔癌类器官培养基培养得到的口腔癌类器官进行病理和免疫组化鉴定的结果；图3B为对样本OZ-020组织进行病理和免疫组化鉴定的结果；图3C为对样本OZ-021使用本发明的口腔癌类器官培养基培养得到的口腔癌类器官进行病理和免疫组化鉴定的结果；图3D为对样本OZ-021组织进行病理和免疫组化鉴定的结果。

图4为使用本发明的口腔癌类器官培养基与现有培养基对口腔癌类器官进行培养的比较结果，其中图4A显示用本发明的OC-3培养基培养10天后的照片；图4B显示用ED培养基培养10天后的照片；图4C显示OC-3培养基和ED培养基培养得到的类器官相对大小的对比柱状图。

图5显示使用本发明的口腔癌类器官培养基培养得到口腔癌类器官进行不同药物敏感性测试的结果，其中图5A显示未加药处理时类器官生长的照片和加药处理3天后类器官生长的照片；图5B显示不同浓度的测试药物抑制口腔癌类器官生长的抑制率柱状图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。

实施例1口腔癌类器官培养基中各添加因子对口腔癌类器官增殖的影响

(1)口腔癌类器官培养基的配制

首先配制含有初始培养基的基础培养基。初始培养基可选自本领域常用的DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。在本实施例中，基础培养基的配方为：DMEM/F12培养基(购自Corning公司)+100μg/mL Primocin(购自InvivoGen公司，0.2％(v/v)，市售产品浓度50mg/ml)。

在基础培养基内分别加入不同种类的添加剂(参见表1)配制成含有不同添加成分的口腔癌类器官培养基。

(2)口腔癌原代细胞的分离和处理

1样品选择

口腔癌实体瘤组织样品(术中)由专业医疗机构的专业医务人员从患者获取，患者均签署了知情同意书。术中样本0.25cm

2材料准备

15mL无菌离心管、移液枪、10mL移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱取出基础培养基DMEM/F12(Corning)，提前30分钟从-20℃冰箱取出组织消化液。

组织消化液配方：1640培养基(Corning，10-040-CVR)、胶原酶Ⅱ(2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(2mg/mL)、DNA酶(50U/mL)、透明质酸酶(0.75mg/mL)、氯化钙(3.3mM)、牛血清白蛋白BSA(10mg/mL)。

以上提及的胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、DNA酶、透明质酸酶均购自Sigma公司；氯化钙购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BSA购自Biofroxx公司。

3样品分离

3.1超净台中取组织样品于培养皿中，去除带血液的组织，用基础培养基冲洗2次，将组织转移至另一培养皿中用无菌手术刀进行机械分离，将组织块分割为1*1*1mm

3.2将切割后的术中组织吸至15mL离心管中，加入5mL基础培养基，混匀，于1500rpm离心4分钟；

3.3弃上清，加入1:3比例的基础培养基和组织消化液(注：组织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约10mL组织消化液)，标记样品名称及编号，用封口膜密封，在37℃下于300rpm摇床(知楚仪器ZQLY-180N)中进行消化，期间每30分钟观察消化是否完成，判断依据为无肉眼可见的颗粒物；

3.4消化完成后，经100μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用基础培养基冲洗入离心管中以减少细胞损失，于25℃下1500rpm离心4分钟；

3.5弃上清，观察是否有血细胞，若有血细胞，加8mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解20分钟，期间颠倒混匀一次，25℃下1500rpm离心4分钟；

3.6弃上清，加入2mL基础培养基重悬细胞，备用。

4细胞计数及处理

4.1镜下观察：移取少量重悬细胞平铺于培养皿中，显微镜(CNOPTEC，BDS400)下观察癌细胞密度和形态；

4.2活细胞计数：取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生产厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞计数板(生产厂家：Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000)下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞数*100％。

(3)口腔癌类器官的培养

将上述步骤中获得的口腔癌原代细胞用预冷的DMEM/F12重悬并计数，将细胞密度稀释为5～10×10

表1培养基中的添加成分及促类器官增殖效果

其中，“+”表示与基础培养基相比，加入该添加剂的培养基对从口腔癌组织分离出的口腔癌类器官中的至少两例有促进增殖的作用；“－”表示添加该添加剂的培养基对从口腔癌组织分离出的口腔癌类器官中的至少一例显示有抑制增殖的作用；“○”表示添加该添加剂的培养基对从口腔癌组织分离出的口腔癌类器官中的至少两例的增殖没有明显的影响。

根据以上结果，拟选择B27、成纤维细胞生长因子bFGF、CHIR99021、表皮细胞生长因子EGF、胰岛素、ITS细胞培养添加剂、SB202190、Y27632、地塞米松、GlutaMAX、化合物1、非必需氨基酸等因子进行进一步培养实验。

实施例2培养基添加因子的不同浓度对口腔癌类器官的增殖作用

按照实施例1之(2)的方法从术中组织样本(编号为OZ013、OZ014)获得口腔癌原代细胞，并使用下表2中的进行类器官培养。

表2培养基组分(浓度为终浓度)

在使用配方1的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方1的基础上分别添加配制好的B27每孔200μL，B27的终浓度分别为1:25、1:50、1:100；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。该系列的培养基中其他添加因子的终浓度与OC-3培养基相同。以下配方1-12的实验也以同样的方式进行，不再赘述。

在使用配方2的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方2的基础上分别添加配制好的bFGF每孔200μL，bFGF的终浓度分别为3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方3的基础上分别添加配制好的CHIR99021每孔200μL，CHIR99021终浓度分别为1.25μM、2.5μM、5μM；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方4的基础上分别添加配制好的EGF每孔200μL，EGF的终浓度分别为2ng/mL、6ng/mL、18ng/mL；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方5的基础上分别添加配制好的胰岛素每孔200μL，胰岛素的终浓度分别为1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方6的基础上分别添加配制好的ITS每孔200μL，ITS终浓度分别为1:300、1:100、1:30；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方7的基础上分别添加配制好的SB202190每孔200μL，SB202190的终浓度分别为100nM、200nM、400nM；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方8的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方8的基础上分别添加配制好的Y27632每孔200μL，Y27632的终浓度分别为3μM、10μM、30μM；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方9的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方9的基础上分别添加配制好的地塞米松每孔200μL，地塞米松的终浓度分别为0.02μM、0.1μM、0.5μM；并使用配方9的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方10的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方10的基础上分别添加配制好的GlutaMAX每孔200μL，GlutaMAX的终浓度分别为1:300、1:100、1:30；并使用配方10的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方11的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方11的基础上分别添加配制好的化合物1每孔200μL，化合物1的终浓度分别为2.5μM、5μM、10μM；并使用配方11的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方12的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方12的基础上分别添加配制好的非必需氨基酸每孔200μL，非必需氨基酸的终浓度分别为50μM、100μM、200μM；并使用配方12的培养基设置对照孔(BC)。

7天后对所培养的类器官进行拍照，并测量统计类器官的直径大小，比较各因子浓度对口腔癌类器官增殖的促进作用。将2例样本收集的数据汇总示于图1A～1L。图1A～1L中，比值为使用各培养基培养7天得到的类器官直径与对应的BC对照孔培养7天得到的类器官直径的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。

根据图1A～1L的结果，B27的体积浓度优选为1:25～1:100；成纤维细胞生长因子bFGF的含量优选为3～30ng/mL；CHIR99021的含量优选为1.25～5μM；表皮细胞生长因子EGF的含量优选为2～18ng/mL；胰岛素的含量优选为1～10μg/mL；ITS细胞培养添加剂的体积浓度优选为1:30～1:300；SB202190的含量优选为100～400nM；Y27632的含量优选为3～30μM；地塞米松的含量优选为0.02～0.5μM；GlutaMAX的体积浓度优选为1:30～1:300；MST1/2激酶抑制剂的含量优选为2.5～10μM；非必需氨基酸的含量优选为50～200μM。

实施例3口腔癌类器官培养及鉴定

将按照实施例1之(2)所述方法获得的口腔癌原代细胞用本发明的口腔癌类器官培养基OC-3重悬并计数，将细胞密度稀释为5～10×10

在第7-10天，使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培养得到的口腔癌类器官。图2A-2D的是10倍物镜下拍摄样本OZ-018、OZ-019、OZ-020、OZ-021培养后得到的口腔癌类器官的照片。口腔癌类器官在镜下呈规则球状，表面较光滑。

对培养得到的口腔癌类器官进行病理和免疫组化鉴定，同时将对应的组织样本送去进行病理和免疫组化鉴定，比较类器官和组织结果的一致性。

图3A和3C分别为由样本OZ-020、OZ-021体外培养后得到的口腔癌类器官进行病理和免疫组化鉴定的结果，分别为20倍物镜下拍照的图片。如图3A和3C所示，HE结果显示类器官的结构形态为癌组织形态；CK、34βE12、P63、CK5/6、Ki67表达，提示该样本为口腔癌。图3B和图3D为OZ-020、OZ-021对应组织的病理和免疫组化结果，结果表明使用本发明的培养基OC-3培养的口腔癌类器官与口腔癌组织诊断结果一致。

实施例4与现有培养基培养效果的比较

(1)对照培养基的配制

配制文献(Else Driehuis等，Cancer Discov.2019,9:852-871)中使用的培养基，其配方为DMEM/F12培养基(购自Corning公司)+1:50B27(购自Gibco公司)+1.25mmol/L N-乙酰半胱氨酸(购自MCE公司)+10mmol/L烟酰胺(购自MCE公司)+250ng/ml两性霉素B(购自Selleck公司)+10μg/ml庆大霉素(购自MCE公司)+500nM A8301(购自MCE公司)+50ng/ml表皮细胞生长因子(购自R&D公司)+10ng/mL成纤维细胞生长因子10(购自sino biological公司)+5ng/mL成纤维细胞生长因子2(购自R&D公司)+1μmol/L前列腺素E2(购自Tocris公司)+0.3μmol/L CHIR99021(购自MCE公司)+1μmol/L Forskolin(购自MCE公司)+10ng/mL R-spondin(购自R&D公司)+10ng/mL Noggin(购自R&D公司)。以下简称为ED培养基。

(2)口腔癌类器官培养

按照实施例1之(2)的方法从术中组织样本OZ-022获得口腔癌原代细胞，并分别用OC-3培养基和ED培养基按照实施例3的方法进行类器官培养。

在培养第10天，使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培养得到的口腔癌类器官。图4A和4B是10倍物镜下拍摄分别由OC-3培养基和ED培养基培养得到的类器官的照片，图4C是两种培养基培养得到的类器官相对大小的对比柱状图。

根据图4A-4C的结果可知，与ED培养基相比，OC-3培养基能显著促进口腔癌类器官的扩增和培养。

实施例5使用本发明的培养基扩增得到的口腔癌类器官用于药物筛选

(1)口腔癌类器官培养

从得到的口腔癌术中样本(OZ-016)按照与实施例1之(2)的方法分离得到口腔癌原代细胞，并使用OC-3培养基进行类器官培养，待口腔癌类器官直径超过50μm时进行药物筛选。

(2)筛选药物配制

按照下表配制2个浓度梯度的3种药物(柔红霉素、阿柔比星、多柔比星；均购自MCE公司)，保存待用。

表3柔红霉素、阿柔比星、多柔比星药物添加液的配制

(3)加药

取出配制好的药物，置于室温，将药物用OC-3培养基稀释1000倍后备用。从孵箱取出按照步骤(1)培养获得的类器官，去除培养孔中的培养基，将含有药物的培养基沿着孔壁慢慢将入到培养孔。加药结束后，96孔板表面消毒后移至培养箱中继续培养，72小时后测定类器官活力。

(4)类器官活力测试

4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自Promega公司)，取10毫升试剂于加样槽中，培养箱中取出待检测96孔板，每孔加入20μL CellTiter-Glo发光试剂，静置10分钟后混匀，使用多功能酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测。

(5)数据处理

按照公式药物抑制率(％)＝100％-(第三天培养孔化学发光数值

由图5A可以确认，使用本发明的口腔癌类器官培养基培养得到的类器官生长状态良好，用柔红霉素和阿柔比星处理之后类器官生长明显受到抑制。图5B是不同浓度的三种测试药物抑制口腔癌类器官生长的抑制率柱状图。由图5B可以看出，药物处理组的数据误差值很小，表明利用此套体系进行药物筛选，相同药物重复孔之间数据基本保持一致。三个抗肿瘤药物中，阿柔比星在两个浓度下都具有较强的抑制类器官生长的效果，不同浓度的柔红霉素的抑制效果差异显著，多柔比星对类器官生长的抑制作用较弱，这表明同一病人的类器官对不同药物的敏感性不同。根据结果可以判断口腔癌病人在临床使用该种药物时的有效性及有效用量。