MARCH5在鉴别猪对蓝耳病毒易感性及制备药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及MARCH5在鉴别猪对蓝耳病毒易感性及制备药物中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratorysyndrome virus，PRRSV)引起。早在1992年，世界动物卫生组织(OfficeInternational Des Epizooties，OIE)就将该病列为B类传染病。目前，PRRS是养猪业中最重要的传染病之一，几乎分布在所有的养猪国家，在全球对养猪业造成巨大的经济损失。而PRRSV还会引发猪高热病(Porcine high fever syndrome，PHFS)，给养猪业造成了巨大的经济损失，此病是由PRRSV变异而来，具有高热、高致病性及高死亡率。因此，PRRS防控是我国乃至世界的难题。

目前，PRRS难于防控主要表现在以下几方面：(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染免疫细胞--猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolarmacrophages，PAMs)，破坏免疫系统，引起免疫抑制，因此有“人中艾滋，猪中蓝耳”之称；(2)病原极易变异，PRRSV是RNA病毒，变异极快，田间弱毒疫苗使用是促使病毒变异的一个重要原因，有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒株基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或与田间毒株重组；(3)疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV商业化疫苗对不同毒株交叉保护力弱；(4)抗体依赖性增强(ADE)，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但中低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(5)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；(6)混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。

综上，从病原(PRRSV)角度研发的疫苗存在以下问题：产生中和抗体慢、对不同毒株交叉保护力差、疫苗毒带毒时间长、与田间毒株重组产生致病力更强的重组毒。因此，有必要从宿主(猪)遗传角度开展研究，在遗传水平提高宿主对PRRS的抗病力，由于遗传背景与生物抗病性有着紧密的联系，因此，基于基因手段筛选蓝耳病抗性猪的工作，对于该疾病的防控具有不可比拟的优势，重点在于找出PRRSV宿主抗性或易感相关的基因，不仅可以研究蓝耳病的感染机制，还为蓝耳病的治疗和预防提供新办法。例如中国专利CN106191320A公开HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用，通过发掘PRRSV宿主抗病/易感基因，进而培育和筛选抗病(PRRS)猪新品种(系)，探索更多相关基因对于分子层面抗蓝耳病具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在提供MARCH5在鉴别猪对蓝耳病毒易感性及制备药物中的应用。具体地：

本发明的第一个目的是提供MARCH5基因或蛋白的检测试剂的应用。

本发明的第二个目的是提供MARCH5基因在培育抗猪蓝耳病猪品种中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种筛选抗蓝耳病猪的方法。

本发明的第四个目的是提供一种提高猪对蓝耳病毒抗性的制剂。

本发明的第五个目的是提供一种培育抗蓝耳病猪的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究显示，在PRRSV感染PAMs细胞后会促进膜相关环指蛋白5(membraneassociated ring-CH-type finger 5,MARCH5)的表达，随着感染时间增加，MARCH5表达量显著升高。而MARCH5干扰促进PRRSV复制，MARCH5过表达抑制PRRSV复制，表明MARCH5的表达量与PRRSV的复制息息相关。同时，研究显示猪体内MARCH5表达量高对蓝耳病毒具有抗性，反之具有易感性，对PRRSV抗性猪的培育具有很好的临床应用价值。

本发明研究的MARCH5 mRNA序列号：XM_001927572，MARCH5蛋白序列号：XP_001927607。

因此，本发明提供：

MARCH5基因或蛋白的检测试剂在制备检测诊断猪蓝耳病的产品中应用。

MARCH5基因或蛋白的检测试剂在制备检测诊断猪是否感染蓝耳病毒的产品中的应用。

实际工作中，诊断标准为：MARCH5表达量异常升高则表示感染蓝耳病毒或患猪蓝耳病。这里所述的“异常升高”是以本领域技术中猪体内MARCH5表达量的普遍水平为依据。

MARCH5基因或蛋白的检测试剂在筛选抗蓝耳病猪或制备鉴别猪对蓝耳病毒易感性的产品中的应用。

MARCH5基因或蛋白的检测试剂在制备筛选抗猪蓝耳病治疗药物的产品中的应用。

实际工作中，筛选标准为：MARCH5表达量越高的猪对蓝耳病毒的抗性越强、越不易感；反之易感性越强。

另外，作为一种可优选的实施方案，本发明提供了一种检测猪MARCH5表达的引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。具体为，上游引物-F(SEQ ID NO.1)：5′-GTGACAGTGATGCAGGTTGT-3′；下游引物MARCH5-R(SEQ ID NO.2)：5′-ATTTGCGCCACAGTCTAAGC-3′。

具体地，本发明还提供了一种筛选抗蓝耳病猪的方法，通过检测猪体内MARCH5表达水平(表达量)来鉴别猪对蓝耳病毒是抗性或易感性。进一步地，鉴别的标准是：MARCH5表达量高的猪对蓝耳病毒具有抗性；反之具有易感性。

具体操作时，MARCH5表达量的高低以本领域技术中猪体内MARCH5表达量的普遍水平为依据。这里所述的高低是相对的，根据MARCH5表达量异常较高或较低，从而判定猪是否可能对PRRSV具有抗性，对PRRSV的易感性程度。

更具体地，基于本发明实验的结果，鉴别的具体数据标准大致为：当MARCH5表达量高于4.5±0.5×10

特别地，本发明对于MARCH5表达量的检测方法不作严格限制，可以是本领域内现有的基因表达量检测方法。

另外，本发明还提供：

MARCH5基因或蛋白的表达促进剂或表达激活剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的制剂中的应用。

MARCH5基因或蛋白的表达促进剂或表达激活剂在制备猪蓝耳病治疗药物或制备猪蓝耳病毒抗病毒药物中的应用。

本发明还提供一种提高猪对蓝耳病毒抗性的制剂，该制剂含MARCH5基因或蛋白的表达促进剂或表达激活剂。

此处所述“表达促进剂或表达激活剂”包括但不限于酶激活剂、化合物促进剂、质粒等。

另外，本发明还提供MARCH5基因在培育抗蓝耳病猪品种中的应用。

具体地，一种培育抗蓝耳病猪的方法，是过表达猪的MARCH5基因。

作为可选择的实施方案，所述培育抗蓝耳病猪的方法可采用基因编辑技术。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了MARCH5在鉴别猪对蓝耳病毒易感性及制备药物中的应用。本发明研究显示，猪体内MARCH5表达量与PRRSV感染息息相关，PRRSV感染PAMs细胞后MARCH5 mRNA和蛋白水平显著升高，MARCH5干扰促进PRRSV复制，MARCH5过表达抑制病毒复制；当猪体内MARCH5表达量较高时，猪对PRRSV具有抗性，反之具有易感性。因此，MARCH5可以作为判定PRRSV易感性或抗性的标准，MARCH5表达量异常较高的猪对PRRSV具有抗性，反之易感；本发明为鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选、鉴定和培育奠定了坚实的基础，有利于培育优良品系猪。

本发明为筛选\鉴定\选育抗蓝耳病猪以及PRRSV抗病育种奠定基础，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义，也有利于优良品系猪的培育。同时，本发明也为MARCH5提供了一种新的应用。

附图说明

图1为PRRSV感染PAMs细胞不同时间点MARCH5蛋白表达水平。

图2为PRRSV感染PAMs细胞不同时间点MARCH5 mRNA表达水平。

图3为MARCH5经siRNA干扰后病毒感染不同时间点MARCH5和PRRSV-N蛋白表达水平。

图4为MARCH5经siRNA干扰后病毒感染不同时间点病毒滴度测定(图中Si-Ctrl为siRNA阴性对照，Si-694为靶向MARCH5的siRNA)。

图5为MARCH5过表达后病毒感染不同时间点MARCH5和PRRSV-N蛋白表达水平。

图6为MARCH5过表达后病毒感染不同时间点病毒滴度测定。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPadPrism 5。

实施例1 MARCH5基因的表达情况

用含10％胎牛血清的1640培养液培养猪肺泡巨噬细胞(PAMs)，以MOI＝0.1接毒PRRSV高致病毒株Li11(该毒株保存于本实验室)，在2％胎牛血清的1640培养液中37℃继续培养，在培养不同时间点0、6、12、24、36h(其中0h为没有感染病毒)收集细胞，采用MARCH5基因的引物：上游引物-F(序列如SEQID NO.1所示)：5′-GTGACAGTGATGCAGGTTGT-3′；下游引物MARCH5-R(序列如SEQ ID NO.2所示)：5′-ATTTGCGCCACAGTCTAAGC-3′，进行real-timePCR、Western-blot检测。

PRRSV感染PAMs细胞后MARCH5蛋白、mRNA表达结果如图1和图2所示，显示PRRSV感染PAMs细胞后，MARCH5蛋白表达量及mRNA表达量显著升高。随着感染时间延长，PRRSV-N蛋白表达量升高更加显著。

实施例2 MARCH5的干扰

设计MARCH5 siRNA引物(MARCH5-694 sense:GCAGGUUGUAGGCCAUAAATT；antisense:UUUAUGGCCUACAACCUGCTT)及1对NegativeControl(Si-Ctrl sense:GGCCCCUUAUGUTTAGCCUAA；antisense:GTTAGUUGUCGGAUCCAGACA)(siRNA阴性对照)引物，并送到Thermo Fisher Scientific公司合成，再使用Lipofectamine

在另外一个6孔板培养48h后，在培养基中加入PRRSV，再培养12、24、36h，收集细胞并通过Western-blot、TCID50实验验证MARCH5干扰后对PRRSV复制影响。

检测结果如图3所示，MARCH5经siRNA干扰后，相对于对照组，siRNA显著地抑制了MARCH5蛋白表达，在PRRSV接毒12、24、36h后，PRRSV-N蛋白表达量显著升高。

TCID50检测结果如图4所示，显示在MARCH5干扰后，PRRSV病毒滴度显著升高。表明MARCH5经siRNA干扰后促进PRRSV复制。

实施例3 MARCH5的过表达

采用酶切连接技术构建pcDNA3.1-MARCH5过表达载体，在2个6孔板中用含10％胎牛血清的1640培养液培养PAMs细胞至80％密度，一个6孔板，使用Lipofectamine

在另外一个6孔板培养24h后，在培养基中加入PRRSV，再培养12、24、36h，收集细胞检测MARCH5过表达后对PRRSV复制影响。

检测结果如图5所示，MARCH5过表达后，MARCH5蛋白水平显著升高。在PRRSV感染12、24、36h后，PRRSV-N蛋白表达水平显著降低。

TCID50测定结果如图6所示，显示PRRSV病毒滴度显著降低。表明MARCH5过表达后抑制PRRSV复制。

实施例4 MARCH5在鉴别猪对蓝耳病毒易感性中的应用

采用我国地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪作为研究对象，其中，已知通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，即具有抗性；而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。

选取通城猪、梅山猪、长白猪、大白猪各10头，每5头1组，即分成2组，其中1组进行PRRSV攻毒，另外1组不做任何处理(对照)，分别在攻毒前1d和攻毒后第7、14、21、28d采血，对照组同步采血，第28d处死，采集血液、肺、淋巴结组织。取一部分血清进行TCID50测定，剩余血清及肺、淋巴结组织提取RNA、反转，对MARCH5及PRRSV N蛋白进行qRT-PCR检测，并对肺组织做病理切片。

根据TCID50、PRRSV N蛋白表达水平及肺组织病理切片确定地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力，根据猪体内MARCH5表达量高低研究其与上述4种品种猪对PRRSV抗病力的关系。

根据结果可判断，通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感(具有抗性)，而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。

同时，攻毒前猪体内MARCH5表达水平(基因本底表达水平)检测结果显示，通城猪和梅山猪体内MARCH5表达量显著高于长白猪和大白猪；攻毒后，猪体内MARCH5表达量显著升高，与细胞水平实验结果一致。

另外，基于大量实验结果显示，鉴别猪对蓝耳病毒易感性的具体数据标准大致为：当MARCH5表达量高于4.5±0.5×10

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。