一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母。

背景技术

PET是一种被广泛应用的高分子芳香族聚酯，由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通过酯键相连构成。2015年，全球PET产量达到约2780万吨，主要制造包装材料和饮料瓶。PET具有优良的综合性能，如质轻、强度大、耐高低温、耐化学腐蚀、绝缘性好、透明度高。然而PET强劲需求在带来便利的同时也产生了一个全球性的问题：如何有效地处理消费后的PET或由于其耐用性而可以在环境中积累并停留数百年的PET废弃物？多项研究表明，已发现超过690种海洋生物在其体内积累了PET碎片和微塑料，这意味着PET已经在人类食物中广泛传播。

目前，已经开发了多种策略来回收使用过的PET，包括化学、物理和生物处理。近年来，生物回收塑料废弃物因其作用条件比较温和环保、安全性较高而备受关注，将有望发展成为塑料降解的方法之一。生物解聚和转化技术是在温和条件下使用微生物/酶选择性将废塑料解聚成不同的聚合物单体，以及对混合塑料降解物进行高值化的生物炼制过程。塑料是人工合成的高分子材料，在设计之初就具备结构致密、疏水性强、分子结晶度高、键能稳定等特点，因此，传统认为无论是微生物还是酶都难以将塑料聚合物高效降解。然而，随着近些年在塑料生物降解领域，特别是PET塑料的酶法降解领域取得的突破性进展，让人们对塑料生物降解有了全新的认识。

聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶(PETase)能将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸或对苯二甲酸,其最大的优势是,与其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比,其在中温段(30-40℃)的酶活显著高于其他酶,这意味着在实际应用中较容易达到适宜的反应条件。

酵母表面展示酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现存储稳定性高，分离回收容易，连续操作可控，工艺简便等优点，并且使用间接表面展示系统，可以提高PETase在酵母表面的蛋白展示量，但目前尚未有细胞表面间接展示PETase的报道。因此，构建PETase的间接表面展示菌株进行PET的转化具有很大的实际意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组毕赤酵母。

本发明还要解决技术问题是提供上述重组毕赤酵母的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母在间接表面展示PETase蛋白中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母，将IM7酵母和CL7-PETase蛋白结合构建得到的。

其中，所述的IM7酵母是以毕赤酵母为宿主，异源表达3×IM7-SED1融合蛋白后培养得到的。

其中，所述的CL7-PETase蛋白是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，异源表达CL7-PETase融合蛋白后培养得到的。

其中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115(购买自碧云天生物技术有限公司)。

上述重组毕赤酵母的构建方法，包括如下步骤：

(1)IM7酵母的构建：

(1a)重组质粒的构建与转化：将构建的重组质粒pPICZαA-HA-3×IM7-SED1(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)通过电转化方法转入毕赤酵母GS115中，得到重组菌IM7蛋白表面展示菌株；

(1b)将步骤(1a)得到的重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种培养并进行诱导产酶，锚定蛋白SED1会将所连接的IM7蛋白固定在酵母表面，得到表面固定了IM7的IM7酵母。

(2)CL7-PETase蛋白的构建：

(2a)重组质粒的构建与转化：将重组质粒pET-22b-CL7-PETase(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌CL7-PETase蛋白表达菌株；

(2b)将步骤(2a)得到的重组菌CL7-PETase蛋白表达菌株接种培养并进行诱导产酶，得到CL7-PETase蛋白。

(3)将步骤(1b)得到的IM7酵母和步骤(2b)得到的CL7-PETase蛋白结合，构建重组毕赤酵母。

其中，步骤(1a)中，所述的IM7蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的SED1蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，步骤(1a)中，所述的电转化方法为：将质粒pPICZαA-HA-3×IM7-SED1使用sacⅠ酶切割成线性化质粒并回收。取出制备好的毕赤酵母GS115感受态细胞，加入1-3μg线性化质粒，轻轻混匀后放置冰上5min再转移至0.2cm的电转杯中。设置电转仪的参数为：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF，进行电转。电转后立刻向电转杯中加入1mL预冷的山梨醇，然后转入1.5mL离心管中，放置在30℃培养箱中静置培养1h。培养结束后在室温下4000rpm离心3min，弃上清，菌体用YPDS培养基重悬，然后涂布在含有100μg/mL博莱霉素的YPD平板上，放置在30℃培养箱中培养48h。

其中，步骤(1b)中，所述的重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种培养，其接种培养条件为：将重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种在YPD培养基中，加入100μg/mL的博莱霉素，在30℃培养24h后，将菌液按照1％v/v的接种量加入到BMGY液体培养基中30℃培养24h后，将菌液装入无菌离心管中6000rpm离心10min后，弃上清，用等体积的BMMY液体培养基重悬菌体后转入摇瓶中放置在30℃摇床中培养，每隔24h补加1％v/v的甲醇，发酵五天后，离心收集菌体，得到IM7酵母。

其中，步骤(2a)中，所述的CL7蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的PETase蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

其中，步骤(2a)中，所述的转化，是将1μg质粒pET-22b-CL7-PETase加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购买自庄盟生物基因有限公司)中，在冰上放置30min，然后将感受态细胞放在42℃水浴锅中热激90s后立刻放置在冰上2min。随后加入900μL的液体LB培养基，在37℃，200rpm条件下培养45min。最后以4000rpm离心5min收集菌体，并将其涂布在含有50μg/mL的氨苄霉素的LB平板上，放置在37℃培养箱培养12h。

其中，步骤(2b)中，所述的重组菌CL7-PETase蛋白表达菌株接种培养，其接种培养条件为：将重组菌CL7-PETase蛋白表达菌株接种在LB培养基中，加入50μg/mL的氨苄霉素，在37℃下培养12-16h后，将菌液按照1％v/v的接种量加入液体LB培养基中37℃培养,当培养菌液浓度达到OD

其中，步骤(3)中，所述的IM7酵母和CL7-PETase蛋白结合，其结合条件为：将IM7酵母和CL7-PETase蛋白于pH＝8，含有10mM CaCl

具体的，每隔1h取一次样，8000rpm离心2min分离上清和菌体，将菌体用Tris-HCl缓冲液洗涤细胞3次，然后用p-NPB法分别测定重组毕赤酵母和上清的酶活。

具体的，酶活的计算：蛋白酶活力＝A/(B*C)，其中A-对照标准曲线计算出产生的对硝基苯酚的量(μmol)，B-反应时间(min)，C-反应所加入的酶量(mL)。每分钟水解p-NPB产生1μmol对硝基苯酚定义为一个蛋白酶活力单位。

上述重组毕赤酵母在PET塑料降解中作为全细胞催化剂中的应用也在本发明所保护的范围之内。

有益效果：本发明所使用CL7/IM7系统，实现了PETase在毕赤酵母表面的间接展示，避免了复杂的纯化步骤，可提高分离纯化的效率并节省成本。酵母表面展示酶在保持游离酶的专一性的同时，还具有以下优势：(1)表面展示酶比游离酶更加容易回收利用，且稳定性更高。(2)表面展示酶可重复利用。(3)表面展示酶区别于传统的物理或化学的固定化方法，对于PET这种刚性底物，表面展示酶更能充分有效地与底物接触，最大限度催化底物。(4)间接表面展示系统相比直接表面展示系统具有更高的蛋白展示量。本发明使用的PETase蛋白可以催化PET塑料的生物降解，对PET和其他塑料的生物降解具有重要的意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为CL7/IM7系统间接表面展示PETase蛋白的示意图。

图2为pPICZαA-HA-3×IM7-SED1重组质粒图谱。

图3为pET-22b-CL7-PETase重组质粒图谱。

图4为激光共聚焦显微镜下IM7酵母经过免疫荧光染色后的示意图。

图5为荧光显微镜下IM7酵母与CL7-mCherry荧光蛋白结合后的示意图。

图6为对硝基苯酚标准曲线。

图7为p-NPB法检测IM7酵母与CL7-PETase结合过程中重组毕赤酵母以及上清的酶活变化。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用培养基如下：

LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

YPD培养基配方为：20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉。

酵母感受态母液配方为：100mM醋酸锂，10mM二硫苏糖醇，0.6M山梨醇，10mM Tris-HCl。

YPDS培养基配方为：20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，1M山梨醇。

BMGY液体培养基配方为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，13.4g/L YNB(含硫酸铵)，3.01g/L K

BMMY液体培养基配方为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，13.4g/L YNB(含硫酸铵)，3.01g/L K

如图1所示，是CL7/IM7系统间接表面展示PETase的示意图。

实施例1 IM7蛋白在毕赤酵母上的表面展示以及CL7-PETase在大肠杆菌中的异源表达

(1)重组质粒的构建与转化

将由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的重组质粒pPICZαA-HA-3×IM7-SED1(质粒图谱如图2所示，IM7蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SED1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。)转入毕赤酵母GS115中获得IM7蛋白表面展示菌株。

毕赤酵母转化方法如下：

毕赤酵母GS115感受态制备方法：将毕赤酵母GS115菌株接种在YPD试管培养基中30℃，200rpm培养过夜。将培养好的菌液按照5％v/v的接种量加入到50mL液体YPD培养基中30℃，200rpm培养至OD

毕赤酵母电转化方法：将质粒pPICZαA-HA-3×IM7-SED1使用sacⅠ酶切割成线性化质粒并回收。取出制备好的毕赤酵母GS115感受态细胞，加入1-3μg线性化质粒，轻轻混匀后放置冰上5min再转移至0.2cm的电转杯中。设置电转仪的参数为：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF，进行电转。电转后立刻向电转杯中加入1mL预冷的山梨醇，然后转入1.5mL离心管中，放置在30℃培养箱中静置培养1h。培养结束后在室温下4000rpm离心3min，弃上清，菌体用YPDS培养基重悬，然后涂布在含有100μg/mL博莱霉素的YPD平板上，放置在30℃培养箱中培养48h。

将由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的重组质粒pET-22b-CL7-PETase(质粒图谱如图3所示，CL7蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，PETase蛋白的核苷酸序列如SEQID NO:4所示)转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得CL7-PETase蛋白表达菌株。

大肠杆菌转化方法如下：

将1μg质粒pET-22b-CL7-PETase加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购买自庄盟生物基因有限公司)中，在冰上放置30min，然后将感受态细胞放在42℃水浴锅中热激90s后立刻放置在冰上2min。随后加入900μL的液体LB培养基，在37℃，200rpm条件下培养45min。最后以4000rpm离心5min收集菌体，并将其涂布在含有50μg/mL的氨苄霉素的LB平板上，放置在37℃培养箱培养12h。

(2)IM7蛋白表面展示菌株和CL7-PETase蛋白表达菌株的接种培养

将IM7蛋白表面展示菌株接种在YPD培养基中，加入100μg/mL的博莱霉素，在30℃培养24h后，将菌液按照1％v/v的接种量加入到BMGY液体培养基中30℃培养24h后，将菌液装入无菌离心管中6000rpm离心10min后，弃上清，用等体积的BMMY液体培养基重悬菌体后转入摇瓶中放置在30℃摇床中培养，每隔24h补加1％v/v的甲醇，发酵五天后，离心收集菌体，得到IM7酵母。

将CL7-PETase蛋白表达菌株接种在LB培养基中，加入50μg/mL的氨苄霉素，在37℃下培养12-16h后，将菌液按照1％v/v的接种量加入液体LB培养基中37℃培养,当培养菌液浓度达到OD

实施例2 IM7蛋白表面展示效果鉴定

(1)免疫荧光染色初步鉴定IM7蛋白在细胞表面展示

将实施例1中培养好的IM7酵母用PBS溶液重悬，并稀释至OD

(2)IM7酵母与CL7-mCherry荧光蛋白鉴定CL7与IM7的结合能力

将实施例1培养好的IM7酵母用100mM Tris-HCl缓冲液重悬，并稀释至OD

实施例3 PETase蛋白间接表面展示效果鉴定

将实施例1中得到的IM7酵母和CL7-PETase蛋白于pH＝8，含有10mM CaCl

其中，p-NPB测定酶活的方法为：

对硝基苯酚标曲的制作：用异丙醇配置2mM的对硝基苯酚母液，然后用PBS分别稀释成10μM，20μM，40μM，50μM，60μM，80μM，100μM，200μM的浓度，用酶标仪测定不同浓度下对硝基苯酚在OD

用异丙醇配置10mM的p-NPB，取2mL离心管加入980μL的PBS，10μL的p-NPB，10μL的酶液，在37℃反应5min后，用酶标仪测定其OD

酶活的计算：蛋白酶活力＝A/(B*C)，其中A-对照标准曲线计算出产生的对硝基苯酚的量(μmol)，B-反应时间(min)，C-反应所加入的酶量(mL)。每分钟水解p-NPB产生1μmol对硝基苯酚定义为一个蛋白酶活力单位。

本发明提供了一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母的思路与方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。