一种嵌合抗原受体（CAR）及其抗癌用途

技术领域：

本发明属于疾病治疗领域，具体提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌用途。

背景技术：

免疫疗法彻底改变了癌症治疗的传统模式，成为了继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗手段，肿瘤免疫疗法中最成功的案例是免疫检查点抑制剂和以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞为代表的过继细胞疗法(adoptive celltherapy，ACT)。在使用传统疗法无法治愈的转移性癌症中，CAR-T免疫疗法展现了惊人的疗效，一些患者可以实现长期缓解并可能治愈，据报道CD19 CAR-T治疗复发难治性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)及复发难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的完全缓解率(CRR)分别是60％～90％和40％～50％；B细胞成熟抗原(BCMA)CAR-T治疗复发难治性多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的CRR为39％～80％(冯友琴，张棋琦，胡永仙，黄河，多靶点CAR-T治疗血液系统恶性肿瘤研究进展，临床内科杂志2022年9月第39卷第9期)。

CAR通常由四个结构域组成：细胞外抗原结合结构域、间隔区或铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域。抗原结合结构域通常由抗体重链(VH)和轻链(VL)的可变区通过柔性接头连接形成单链片段可变区(scFv)并决定结合特异性；有时，可以使用与其靶细胞上受体结合的天然蛋白质或肽来代替scFv。与识别通过MHC呈递的抗原的TCR不同，CAR识别并结合细胞表面表位并确定靶标特异性，不依赖于MHC。铰链区是暴露CAR-T细胞表面上的与靶抗原结合的间隔区，临床常用的铰链区通常来源于CD8、CD28或IgG，铰链区的长度由目标抗原的位置凭经验确定，靠近细胞膜的抗原需要较长的铰链，而暴露在细胞表面的抗原需要较短的铰链。跨膜结构域的主要功能是将CAR停靠在免疫细胞膜上，一些研究表明该区域可以影响CAR的表达、稳定性、二聚化和信号转导。细胞内信号结构域已在CAR工程中得到广泛研究，以产生具有最活跃的抗肿瘤免疫的CAR免疫细胞，与CAR结合后，它会转导信号以激活免疫细胞进而展开有效攻击。

第一代CAR-T细胞仅包含一个CD3ζ信号域，由于最佳的T细胞启动和激活需要来自TCR-CD3和CD28信号通路的信号，因此第一代CAR-T细胞疗法在过继转移后治疗效果和持久性均明显不足。为了提高抗癌活性，研究人员设计第二代CAR-T细胞，除了CD3ζ信号结构域外，它还包含一个共刺激结构域。两个最常用的信号结构域是CD28和4-1BB(CD137)细胞内结构域。CD28域被FDA批准的axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel使用，两者都针对CD19。4-1BB信号域被批准的靶向CD19的Lisocabtagene maraleucel和tisagenlecleucel以及靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的idecabtagene vicleucel使用。其他细胞内共刺激结构域，例如OX40、CD27和诱导型T细胞共刺激物(ICOS)，也已在临床前研究中进行了测试，其疗效与CD28和4-1BB结构域相当。其中一些共刺激结构域可能对CAR-T细胞具有更好的有益效果，一项研究表明，CD27共刺激比CD28结构域更能增强CAR-T细胞的体内持久性(Song DG,Ye Q,Poussin M,Harms GM,Figini M,Powell DJJr.CD27costimulation augments the survival and antitumor activity ofredirected human T cells in vivo.Blood.2012；119(3):696–706)。已发现细胞内CD28和4-1BB结构域对CAR-T细胞分化和代谢具有不同的影响，4-1BB和CD3ζ的组合诱导中枢记忆T细胞分化和持续存在，增加线粒体生物合成，增强脂肪酸氧化和氧化代谢；另一方面，CD28和CD3ζ组合诱导效应记忆细胞分化和糖酵解。为了利用共刺激域的不同特性并增强CAR-T细胞的功效，研究人员设计了第三代CAR-T疗法，该疗法除了CD3ζ之外还结合了两个共刺激域，CD28和4-1BB的组合可以挽救对靶抗原亲和力低的CAR-T细胞，增强增殖能力，增强中枢记忆分化并提高体内抗肿瘤活性。当测试包含可变数量的共刺激结构域的CAR构建体库时，发现包含两个共刺激结构域DAP10和CD27的CAR-T细胞在体内实现了最佳抗肿瘤活性(Huang R,Li X,He Y,Zhu W,Gao L,Liu Y,et al.Recent advances in CAR-T cellengineering.J Hematol Oncol.2020；13(1):86)。

到目前为止，已有五种CAR-T细胞获得了美国FDA的批准，第一个被批准的CAR-T是Kymriah，它于2018年5月1日获批，用于治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL；第二个被批准的CAR-T是Yescarta，于2017年10月18日批准用于治疗大B细胞淋巴瘤，包括DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL；第三个靶向CD-19的CAR-T产品Tecartus于2020年7月24日被FDA批准用于复发或难治性套细胞淋巴瘤。Breyanzi是最近获批的针对复发性或难治性大B细胞淋巴瘤的CD19靶向CAR-T疗法，经过两种或多种全身治疗，包括DLBCL/高级别B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤和3B级滤泡性淋巴瘤。Abecma是唯一获得FDA批准的不针对CD19的CAR-T疗法，于2021年3月26日获得FDA批准，用于经过四线或更多线全身治疗(包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38单克隆抗体)后的复发或难治性多发性骨髓瘤。

尽管取得了较好的疗效，但是免疫疗法仍存在较多的局限性，从而导致CAR-T细胞治疗失败，这种限制在实体肿瘤尤为明显，主要体现在：

理想的肿瘤抗原难以获得，目前已批准的CAR疗法都是针对B谱系标志物，如CD19、BCMA等，虽然靶向CD19的CAR-T治疗可能导致B细胞再生障碍，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以轻松补偿大部分B细胞功能。然而，实体瘤中很少有这种不影响正常功能的特异性抗原，使得实体瘤中的CAR-T疗法落后于血液系统恶性肿瘤。

CAR-T细胞运输和浸润肿瘤效率低下，具有粘附分子异常表达的异常脉管系统减少了CAR-T细胞附着、迁移和浸润到肿瘤部位；实体肿瘤往往具有致密的细胞外基质，包括癌症相关成纤维细胞，为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了物理屏障；并且失调的细胞因子表达优先吸引抑制性免疫细胞，也对CAR-T细胞起到了阻碍作用。

肿瘤微环境造成了不利的免疫影响，某些癌症中细胞和基质成分都会为癌症免疫治疗创造不利的微环境，肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞、髓源性抑制细胞和肿瘤相关成纤维细胞等细胞成分可以直接抑制CAR-T功能，VEGF、TGF-β、IL-4、IL-10和许多其他物质也会导致T细胞功能障碍并抑制免疫细胞的浸润，其中TGF-β是主要的抑制因子(JordanHartley,Hinrich Abken,Chimeric antigen receptors designed to overcometransforming growth factor-β-mediated repression in the adoptive T-celltherapy of solid tumors,Clin Transl Immunology.2019Jun 22；8(6):e1064)，TGF-β通过与TGF受体TGFBR1和TGFBR2结合，直接抑制T细胞活性；TGF-δ结合诱导各自受体的异源二聚体化和主要TGF-γ信号介质SMAD2和SMAD3的磷酸化，磷酸化SMAD诱导抑制转录程序，导致细胞因子生成减少，抗原结合后的细胞毒性和T细胞扩增；TGF-β也能促使T细胞分化为调节性T细胞，调节性T淋巴细胞又能产生TGF-α，进一步促进免疫抑制和肿瘤耐受。为此，有研究人员提出，使用TGF-β抑制剂以消除或降低TGF-β对CAR-T细胞的不利影响。

肿瘤细胞逃逸，CAR-T细胞发挥抗癌活性后，抗原丢失和下调是治疗失败的重要机制，据统计尽管初始反应率很高，但7-25％的接受靶向CD19的CAR-T疗法治疗的患者会因CD19表达减少而导致恶性肿瘤复发(Majzner RG,Mackall CL.Tumor Antigen Escapefrom CAR-T-cell Therapy.Cancer Discov.2018；8(10):1219–26)。

CAR-T细胞扩增和持久性不足，除免疫逃逸外，CAR-T细胞在体内的扩增和持久性被认为是长期缓解的关键，特别是对于那些需要长期治疗的恶性肿瘤，如急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)。缺乏CAR-T细胞持久性可能与宿主对CAR-T细胞的抗转基因免疫反应有关，如使用氟达拉滨进行淋巴清除，可以减少抗转基因免疫反应，改善CAR-T细胞的扩增和持久性，并增强CAR-T细胞的功效。研究人员相信，除给药方式之外，缺乏CAR-T细胞扩增和持久性与CAR-T细胞本身因素直接相关，包括CAR-T构建、亲代T细胞选择、T细胞培养条件、药理学操作、CAR-T基因表达和代谢的修饰、T细胞衰竭的逆转、促进记忆表型发展等。关于CAR-T结构，大多数临床试验并获得FDA批准的CAR-T细胞产品都含有CD3ζ和一个共刺激结构域，通常是CD28或4-1BB，一些临床研究观察到4-1BB结构域的持续时间更长，可达到168天，而基于CD28的CAR-T细胞约为30天。离体培养、激活和扩增不仅为转导CAR转基因的T细胞做好准备，扩增以产生足够的CAR-T细胞用于临床应用，而且对于维持CAR-T功能和输注后的持久性至关重要。导致T细胞终末分化并具有激活诱导细胞死亡(AICD)和衰竭倾向的离体培养会影响体内扩增和持久性，培养条件的优化可以改善记忆CAR-T细胞的发育和体内扩增和持久性。

在众多实体肿瘤中，神经母细胞瘤无疑是最令人头疼的恶性肿瘤之一，它常见于幼儿患者，是儿童期最常见的颅外实体瘤。基于抗体的免疫疗法是高危神 经母细胞瘤患者的一线治疗方案中，2010年发表的一项关键III期临床试验显示，接受IL-2、GM-辅助抗GD2单克隆抗体的患者的2年无事件生存率(EFS)从46％增加到66％，总生存期(OS)从75％增加到86％(Yu AL,Gilman AL,Ozkaynak MF,London WB,Kreissman SG,Chen HX,etal..Anti-GD2antibody with GM-CSF,interleukin-2,and isotretinoin forneuroblastoma.N Engl JMed.(2010)363:1324–34)。虽然采用抗GD2抗体使得患者存活率有所提高，但仍有约50％的患者会复发并最终死于该疾病，另外据统计，约20％的患者在诊断时对诱导治疗无效。为此，研究人员试图采用靶向GD2的CAR-T细胞治疗该疾病，并取得了积极的治疗效果，Robbie G.Majzner等(Robbie G.Majzner et al,GD2-CAR T celltherapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas，Nature.2022；603(7903):934–941)使用抗GD2 CAR-T治疗弥漫性固有脑桥神经胶质瘤(Diffuse intrinsic pontineglioma，DIPG)和其他H3K27M突变的弥漫性中线神经胶质瘤(diffuse midline gliomas，DMG)取得了积极治疗效果，且未观察到靶向、非肿瘤毒性等副作用，整体不良反应控制良好，展现出了较好的治疗前景。

为了克服上述困难，本发明中提供了一种新型嵌合抗原受体及其递送系统，一方面所述嵌合抗原受体具有靶向GD2的全新抗原结合域，采用CD27和CD28作为双共刺激因子，能够提高CAR-T细胞的持久性，促进细胞增殖；另一方面，以脂质体为递送基础，脂质体内部包裹携带嵌合抗原受体的核酸载体和抗TGF-β的siRNA，外部结合CD8抗体，可在体内靶向结合CD8+T细胞，并合成自体CAR-T细胞，既能够避免体外制备CAR-T细胞的繁琐过程，又能够延长CAR-T细胞的时间，进而提高肿瘤治疗效果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明中提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、靶向GD2的抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内信号域CD27、CD28和CD3ζ区域，所述靶向GD2的抗原结合片段具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

GD2是一种主要在细胞表面表达的含唾液酸的鞘糖脂,虽然这种碳水化合物抗原的功能尚不完全清楚，但它被认为在肿瘤细胞与细胞外基质蛋白的附着中起重要作用，GD2在正常胎儿和成人组织中的表达主要局限于中枢神经系统、外周神经和皮肤黑色素细胞，GD2在几种高危肿瘤中高表达，包括神经外胚层或上皮起源的肿瘤、几乎所有的黑色素瘤，以及大约50％的骨肉瘤和软组织肉瘤的肿瘤样本，在儿童时期最常见的肿瘤是神经母细胞瘤，因此已经开发出了多种靶向GD2的神经母细胞瘤治疗抗体。本发明中以GD2为目标抗原，筛选并获得了能够有效识别GD2的抗原结合片段，且该抗原结合片段与目标抗原具有较高的结合活性，可防止脱靶现象出现。

共刺激因子是激发和维持CAR-T细胞生理活性的关键因素之一，有研究表明，通过TGF-β的CAR T细胞抑制可以通过CD28ζCAR在与同源抗原结合时提供的CD28共刺激来克服，而4-1BB-CD3ζCAR和第一代CD3ζCAR-T细胞受到抑制(Golumba-Nagy V,Kuehle J,HombachAA,Abken H,CD28-ζCAR T cells resist TGF-βrepression through IL-2signaling,which can be mimicked by an engineered IL-7autocrine loop.Mol Ther 2018；26:2218–2230)。也有研究表明，在临床前实验中，含有CD28的CAR与4-1BB共刺激结构域相比，细胞因子释放通常更大，对肿瘤细胞的杀伤作用更为猛烈(Kathryn M.Cappell，JamesN.Kochenderfer，A comparison of chimeric antigen receptors containing CD28versus 4-1BB costimulatory domains，Nature Reviews Clinical Oncology，2021,18：715–727)因此，为了降低TGF-β的不利影响，同时提高抗肿瘤效果，本发明中选用CD28作为共刺激因子；并且为了提高CAR-T细胞的持续时间，使用CD27和CD28两种共刺激因子构建嵌合抗原受体。

进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

提供了一种基因递送药物，所述药物采用脂质体包裹核酸表达载体和抗TGF-β的siRNA，所述核酸表达载体携带编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列；所述脂质体表面修饰有CD8抗原结合片段，所述CD8抗原结合片段为单域抗原结合片段，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述抗TGF-β的siRNA包括siRNA-01和siRNA-02，siRNA-01的正义核苷酸序列为gagcaccauucuccuugaaaggacu，反义核苷酸序列为aguccuuucaaggagaauggugcuc；siRNA-02的正义核苷酸序列为gcaacaacgccaucuaugatt，反义核苷酸序列为ucauagauggcguuguugctt。

纳米递送系统可用于将DNA或mRNA等核酸递送至细胞，促进体内外源因子的表达，这种技术在基因药物、核酸疫苗的研究中得到了广泛应用。近年来，有研究人员尝试通过纳米递送系统负载CAR基因，并取得了一定的研究进展。例如，Joel G Rurik等(Joel GRurik,István Tombácz et al,CAR T cells produced in vivo to treat cardiacinjury,Science.2022Jan 7；375(6576):91-96)公开了一种治疗心脏纤维化的CAR-T疗法，通过在T细胞靶向脂质纳米粒(lipid nanoparticles，LNPs)中传递修饰的信使RNA(mRNA)，编码CAR的修饰mRNA高效地传细胞，递给T淋巴细胞，从而在体内产生短暂有效的CAR-T细胞，进而减少损伤后的纤维化并恢复心脏功能。这种方式可在体内快速生成CAR-T细胞，但以mRNA为表达介质，为一种短暂的瞬时治疗方式。在肿瘤治疗中，人们更倾向于使用长效治疗手段，以便有效抑制肿瘤复发，因此研究人员也尝试采用LNP负载DNA载体，如Jing-eZhou等(Jing-e Zhou,Lei Sun et al,Lipid nanoparticles produce chimeric antigenreceptor T cells with interleukin-6knockdown in vivo,Journal ofControlledRelease,2022,35,298-307)构建了一个经CD3抗体修饰的脂质纳米粒系统，并装载含有白细胞介素6短发夹RNA(IL-6shRNA)和CD19-CAR(AntiCD3 LNP/CAR19+shIL6)结合基因的质粒，该系统通过CD3抗体介导靶向T细胞，稳定转染T细胞，将其转化为具有IL-6敲除功能的CAR-T细胞，从而杀死GD2高表达白血病肿瘤细胞，降低IL-6引起的CRS。

相比于现有技术在LNP复合物中使用的CD3、CD5等表面抗原，CD4和/或CD8+T细胞对于CAR-T细胞的抗肿瘤活性和持久性更为重要，并且几个临床前模型证明了不同T细胞亚群对有效CAR-T治疗的优势：CD8(+)CD45RA(+)CCR7(+)CAR-T细胞与T记忆干细胞表型细胞最接近，产生更大的CAR-T抗肿瘤活性(Xu Y,Zhang M et al.Closely related T-memorystemcells correlate with in vivo expansion of car.GD2-T cells and arepreserved by IL-7and IL-15.Blood.2014；123:3750–3759)，因此本发明中使得LNP复合物连接抗CD8抗体，以便形成活性更强的CAR-T细胞，进而发挥良好的抗肿瘤作用。

此外，在LNP复合物中还包裹了抗TGF-β的siRNA，可以抑制TGF-β的表达，从而解除其对于T细胞的免疫抑制，提高抗肿瘤效果。所述siRNA包括两组siRNA，是从现有技术中筛选获得的靶向人、鼠、猴等哺乳动物TGF-β保守区的干扰RNA，具有一定的通用性、广谱性和高效性。

进一步的，所述药物的制备方法包括如下步骤：将编码嵌合抗原受体的核苷酸序列导入哺乳动物表达载体中，以大豆卵磷脂、胆固醇和DMG-PEG2000构建脂质体纳米颗粒LNP，使得所述LNP包裹所述哺乳动物表达载体和抗TGF-β的siRNA；然后使得所述LNP表面结合所述CD8抗原结合片段，从而获得纳米递送药物颗粒。

提供了本发明所述的嵌合抗原受体和/或基因递送药物在制备抗神经系统肿瘤制剂中的应用

进一步的，所述肿瘤为神经母细胞瘤。

有益效果

本发明提供了一种嵌合抗原受体及其核酸递送系统，以及在治疗肿瘤中的应用，具有以下优势：

(1)选用与目标抗原GD2具有较高亲和力的抗原结合片段，能够高效识别目标抗原，从而发挥强力抗肿瘤效果，尤其是对于神经母细胞瘤等神经系统肿瘤具有良好的抑制效果；

(2)选用CD27和CD28作为双共刺激因子，提高T细胞的激活程度，并大幅度延长CAR-T细胞在体内的持续时间，能够发挥长效抗肿瘤作用；

(3)构建纳米脂质体药物递送系统，该脂质体包裹哺乳动物细胞表达载体，实现了在体内CAR-T细胞的组装，避免了体外人工制备CAR-T的繁琐过程，降低了生产、运输和储存成本；

(4)脂质体包裹抗TGF-β的siRNA，可有效抑制TGF-β表达，解除对于T细胞的免疫抑制，提高其抗肿瘤活性；

(5)纳米脂质体药物递送系统外部使用抗CD8抗体修饰，能够有效捕获CD8+T细胞，进而产生具有强烈抗肿瘤活性的CAR-T细胞，改善肿瘤治疗效果。

附图说明

图1：嵌合抗原受体结构示意图；

图2：纳米脂质体结构示意图；

图3：肿瘤细胞杀伤率；

图4：实验动物平均肿瘤体积；

图5：实验动物平均生存期；

图6：IL-2表达水平；

图7：IFN-γ表达水平；

图8：CAR-T细胞持续时间。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1CAR的设计和CAR-T细胞制备

1.1CAR结构设计

本发明中以GD2为靶点设计CAR结构，相应的抗原结合片段为本发明人在前期研究中获得，其具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中所述CAR结构包括信号肽、靶向GD2的抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内信号域CD27、CD28和CD3ζ区域，其结构如图1所示。通过全基因合成获得所述CAR，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

1.2慢病毒载体的制备

本发明中通过慢病毒载体构建CAR-T细胞，慢病毒载体的制备步骤如下：

(1)制备重组表达载体：将编码所述CAR的核苷酸序列经酶切连接导入pWPXLd-2A慢病毒骨架，双酶切鉴定阳性克隆；将所述阳性克隆质粒通过电转化法，导入DH5α感受态细胞中，加入LB液体培养基，在37℃200rpm摇床培养6h；将感受态细胞均匀涂布于带有氨苄抗性的LB平板上，倒放在培养箱37℃过夜培养；挑取阳性克隆菌株，接种于氨苄抗性液体LB培养基中，37℃200rpm摇床培养过夜；离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)提取质粒，进行序列鉴定，筛选获得测序正确的阳性克隆菌株并保存，所述质粒命名为pWPXLd-2A-CAR。

(2)慢病毒包装，使用含10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞，待细胞融合度达到80％以上时，更换新鲜无血清DMEM培养基，放入培养箱中静置2h；以4mL 2×HEPES buffer缓冲液为A液；按1:1:2比例将辅助质粒pMD2.G质粒、psPAX2质粒和pWPXLd-2A-CAR质粒，加入到2.5M钙离子溶液中，混合均匀制备B液；A液、B液等体积混合，静置3min得到混合溶液；逐渐滴加混合溶液至293T细胞中，静置培养10h；更换新鲜含10％FBS的DMEM培养基，放入培养箱中静置培养48h，培养基经过1500rpm离心5min后保留上清液，收集合慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。

(3)超速离心获得慢病毒：将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，离心管底部设有20％的蔗糖；在4℃下25000rpm离心2h，弃去上清液，使用无菌PBS溶解沉淀物，得到浓缩的慢病毒载体；经检测病毒滴度为1.8×10

1.3CAR-T细胞的制备

采集健康志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，收集细胞沉淀；使用无菌PBS重悬细胞，加入37℃预热的单个核细胞分离液，混合均匀后，1000rpm离心20min；离心后分为三层，小心吸取中间白膜层细胞至洁净离心管中，使用无菌PBS洗涤细胞3次；使用含10％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞并进行培养。

调整细胞浓度至1×10

采用类似方法制备具有同样靶向GD2的抗原结合片段，但仅包括CD28共刺激因子的CAR-T细胞，命名为CD28-CAR-T。

实施例2脂质体递送系统的设计和制备

本实施例中提供一种脂质体纳米药物递送系统，如图2所示，所述脂质体内部包裹携带编码所述CAR的质粒表达载体和抗TGF-β的siRNA，外部链接CD8捕获抗体，可实现CAR-T细胞的体内组装。

通过酶切、连接反应将CD27-CD28-CAR的基因序列导入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中(所述表达载体中预先构建有绿色荧光蛋白GFP基因)，命名为pcDNA3.1(+)-CD27-CD28-CAR。以大豆卵磷脂、胆固醇和DMG-PEG2000为脂质体纳米颗粒(lipidnanoparticles，LNP)主要成分，将三者按55:35:10比例混合，然后缓慢加入pcDNA3.1(+)-CD27-CD28-CAR质粒和抗TGF-β的siRNA。所述抗TGF-β的siRNA包括比例相同的siRNA-01和siRNA-02，siRNA-01的正义核苷酸序列为gagcaccauucuccuugaaaggacu，反义核苷酸序列为aguccuuucaaggagaauggugcuc；siRNA-02的正义核苷酸序列为gcaacaacgccaucuaugatt，反义核苷酸序列为ucauagauggcguuguugctt。质粒、抗TGF-β的siRNA与脂质材料比例为1：1：20，通过Nanoassemblr混合器进行快速混合，将所述质粒包裹如脂质体中，构成LNP-pcDNA3.1(+)-CD27-CD28-CAR-siRNA复合物；通过洗涤、浓缩及换液至制剂溶液中，获得相应LNP复合物产品。

抗CD8抗体为发明人前期制备并获得的靶向CD8抗原的单域抗原结合片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，该抗体不仅能够与目标抗原高特异性结合，还由于仅具有重链可变区结构，使得其分子质量更小，易于和脂质体结合，便于LNP复合物的制备。

将抗CD8抗体溶于pH7.4的PBS溶液中，随后将该溶液缓慢滴加入4mol/L的DSPE-PEG2000二甲基亚砜(DMSO)溶液中，缓慢搅拌使其混合均匀，静置反应6h，反应完成后透析并干燥，获得antiCD8-DSPE-PEG2000。将antiCD8-DSPE-PEG2000与LNP-pcDNA3.1(+)-CD27-CD28-CAR-siRNA按5:1比例混合，在37℃下反应4h，洗涤、浓缩后获得antiCD8-LNP-CAR-siRNA复合物。

实施例3体外抗肿瘤实验

3.1肿瘤细胞培养

本实施例中以神经母细胞瘤细胞系SH-SH5Y(购自中国科学院细胞库)为目标细胞，研究所述CAR-T细胞的肿瘤抑制能力。复苏-80℃冷冻保持的SH-SH5Y细胞，接种于含有10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5％CO

3.2体外抗肿瘤实验

采用如1.3节中所述方法制备T细胞，然后调整细胞数量至1×10

将本发明提供的CD27-CD28-CAR-T、CD28-CAR-T和LNP-CD27-CD28-CAR-T与SH-SH5Y细胞，按5:1比例混合后接种于96孔板中共培养(以新鲜培养基为对照组)，培养48h后，吸取各孔上清液，使用无菌PBS洗涤2次，加入20μL CCK8，37℃孵育2h，使用酶标仪检测各孔吸光值，并依据公式：杀伤率＝[(对照组0D值-实验组0D值)/对照组0D值]，分别计算各组对肿瘤细胞的杀伤率。

如图3所示，本发明中所提供的三种CAR-T细胞均能够在体外有效杀伤肿瘤细胞，其中CD28-CAR-T的肿瘤抑制效果最差，而CD27-CD28-CAR-T和LNP-CD27-CD28-CAR-T作用水平类似，可能是由于这两种细胞中均设计有双共刺激因子，可有效激活T细胞所致；此外，尽管LNP-CD27-CD28-CAR-T中含有抗TGF-β的siRNA，但在体外实验中却并未展现出更强的肿瘤杀伤作用。

实施例4体内抗肿瘤实验

4.1动物模型制备

将周龄6-8周的Balb/c裸鼠适应饲养一周后，离心收集生长状态良好的对数生长期的SH-SH5Y细胞，使用无菌生理盐水重悬细胞，调节细胞浓度1×10

4.2实验动物观测

将造模成功的裸鼠随机分为4组，每组10只，分别为：对照组：注射200μL生理盐水；CD28-CAR-T组：注射1×10

统计平均肿瘤体积(给药30天后)和平均生存周期，如图4所示，CAR-T细胞治疗可抑制肿瘤生长，其中CD27-CD28-CAR-T和LNP组的效果最为显著；类似的结果也反应在生存周期上，如图5所示，CAR-T治疗可显著延长动物生存周期，其中LNP组的改善最为明显，使得实验动物生存周期提高了近一倍。

4.3炎症因子表达

肿瘤治疗过程中的炎症因子具有双重作用，一方面炎症因子的表达可介导体液免疫和细胞免疫，强化肿瘤杀伤作用；另一方面大量高水平的免疫因子，可能产生免疫因子风暴，反而加重了机体所能承受的免疫负担，在临床上诱发发热、呼吸窘迫甚至死亡等不良反应，因此需要监测CAR-T治疗过程中患者的免疫因子水平，以便及时进行管理和干预，保证治疗的安全性。

本实施例中为考察治疗后动物体内炎症因子表达情况，于治疗10天后取小鼠血液，置于抗凝管中室温静置1h，4℃、2000rmp离心20min，获得小鼠血清。使用ELISA试剂盒(购自美国Abcam公司)检测血清中的IL-2和IFN-γ含量，结果如图6、图7所示。使用CAR-T治疗后，血液中的免疫因子水平大幅度提高，由于本发明的CAR-T细胞中使用了CD28刺激因子，使得动物体内的免疫因子水平大幅度提高，尤其是IL-2水平相对于正常水平提高了约4-5倍，虽然能够有助于杀伤肿瘤细胞，但也可能导致免疫因子风暴等不希望看到的不良反应；使用CD27和CD28两种刺激因子，并没有进一步强化这一趋势，并且在使用LNP组，IL-2的表达水平均有所下降，推测可能是用于一方面抗TGF-βsiRNA的免疫调节作用，另一方面是体内利用自体T细胞合成CAR-T降低了移植抗宿主免疫反应。但是，在IFN-γ方面LNP系统给药似乎不具有显著影响，相关因子表达仍处于高水平，但据推测IFN-γ介导的免疫因子风暴逊于白介素家族，且IFN-γ在抑制肿瘤过程中发挥了更大的正向作用，故具有一定的积极意义。

实施例5CAR-T细胞持久性试验

为考察CAR-T细胞在体内持续时间，本实施例将CD28-CAR-T、CD27-CD28-CAR-T、antiCD8-LNP-CAR复合物分别注射到小鼠体内，在第7、14、21、35、60和90天提取小鼠外周血，使用单个核细胞分离液获得T细胞(方法参照1.3节)，通过流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白的CAR-T细胞数量，进而计算T细胞中CAR-T细胞占比。

结果如图8所示，CD28-CAR-T细胞在动物体内的持续时间最短，经能够维持一个月作用，注射第35天已难以检测到；由于添加了CD27、CD28两种共刺激因子，使得CD27-CD28-CAR-T在体内能够维持更长时间，注射35天后仍能够检测到，但是这种效果也仅能够维持2个月作用，到第60天也难以检测到CAR-T细胞；antiCD8-LNP-CAR复合物使得体内的CAR-T细胞维持较长时间，到90天时仍可检测到少量CAR-T细胞存在，但是LNP复合物携带CAR-T基因，在体内捕获T细胞并进行组装需要一定的时间，故所述CAR-T细胞达到峰值时间较长。由此可见，这说明添加CD27共刺激因子和使用LNP纳米药物传递系统能够有效延长体内的CAR-T细胞持续时间，为发挥长效抗肿瘤作用奠定了基础。