一种葛根总黄酮的含量测定方法
文献发布时间:2023-06-19 18:47:50
技术领域:
本发明属于中药材检测技术领域,具体涉及一种葛根总黄酮的含量测定方法。
背景技术:
葛根(PuerariaeLobataeRadix)是豆科植物野葛(PuerariaLobata(Willd)Ohwi)的干燥根。葛根中含有丰富的营养成分,《神农本草经》中记载葛根可“主消渴、身大热、呕吐、诸痹、起阴气、解诸毒”。现代医学研究表明其在心血管疾病的治疗中具有显著作用,也被应用于解酒、免疫调节、肝脏保护、抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等方面,是我国应用最为广泛的中药材之一。
现代科学研究证明,根中存在诸多化学成分,除淀粉外,还有异黄酮类、三萜类、香豆素类、皂苷类、生物碱类、多糖类及人体所必需的氨基酸和矿物质等。目前我国葛根种植地域众多,而各地种植的葛根药材的化学成分及含量均有差异,若化学成分和含量不能达到质量要求,势必会影响临床应用的安全性以及有效性。为确保中药使用的安全有效,对中药材进行准确可靠的质量检测是十分必要。
目前,《中国药典》仅制定了采用液相色谱对葛根中葛根素进行含量测定的方法,为了更好地控制药材质量,有必要对葛根中的主要药效成分总黄酮进行含量测定,以进一步有效地控制葛根质量,从而保证临床用药疗效。
发明内容:
本发明要解决的技术问题是提供一种葛根总黄酮的含量测定方法。该方法操作简便,试剂和设备成本低廉,测定葛根总黄酮稳定性好,便于推广。
本发明提供的技术方案是:
一种葛根总黄酮的含量测定方法,包括如下步骤:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加溶剂制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用溶剂稀释为浓度为1.60~22.40μg/mL的系列标准溶液,以溶剂为空白对照,在190~400nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入溶剂50ml,称定重量,提取15~45min,放冷,再称定重量,用溶剂补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加溶剂至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在190~400nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
优选为,所述紫外-可见分光光度计的检测波长为250~350nm。
进一步优选为,所述紫外-可见分光光度计的检测波长为250nm。
本发明所用溶剂为水或30%~95%乙醇。
优选为,溶剂为30%~75%乙醇。
进一步优选为,溶剂为30%乙醇。
上述步骤(2)中,所述提取方法为加热回流或超声提取。
优选为,步骤(2)中,提取方法为加热回流,提取时间为30min。
优选为,步骤(1)中,所述系列标准溶液浓度分别为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/mL,22.4μg/mL。
本发明的线性回归方程为y=0.0709255x+0.00378142,R
本发明有益效果如下:
1、本发明提供了一种葛根总黄酮的含量测定方法,在《中国药典》制定的葛根中葛根素含量测定的基础上,增加了对葛根中总黄酮的含量测定,进一步完善了葛根药材的质量检测内容,对葛根药材及相关中成药质量检测标准具有重要意义;
2、本发明葛根总黄酮的检测方法经方法学验证结果表明:总黄酮(以葛根素计)在1.60~22.40μg/mL浓度范围内与吸光度线性关系良好,线性方程为y=0.0709255x+0.00378142,R
3、通过本发明的方法对不同地区的葛根中总黄酮(以葛根素计)进行测定,实验结果显示葛根素回收率范围为92%~105%,表明回收率良好。
4、本发明采用紫外-可见分光光度计对葛根中的总黄酮含量进行测定,该方法操作简便,试剂和设备成本低廉,测定葛根总黄酮稳定性好,便于推广。
附图说明
图1为葛根总黄酮专属性考察结果;
图2为葛根素标准曲线图。
具体实施方式:
下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明,但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加30%乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用30%乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液,以30%乙醇为空白对照,在250nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入30%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取30min,放冷,再称定重量,用30%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在250nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
实施例2:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加水制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用水稀释为浓度为1.6μg/mL,
3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液,以水为空白对照,在190nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入水50ml,称定重量,加热回流提取15min,放冷,再称定重量,用水补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在190nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
实施例3:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加50%乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用50%乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液,以50%乙醇为空白对照,在300nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取30min,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加50%乙醇至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在300nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
实施例4:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加稀乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用稀乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液,以稀乙醇为空白对照,在350nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇50ml,称定重量,加热回流提取45min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加稀乙醇至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在350nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
实施例5:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加75%乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用75%乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液,以75%乙醇为空白对照,在400nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入75%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取30min,放冷,再称定重量,用75%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加75%乙醇至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在400nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
实施例6:
(1)绘制标准曲线:精密称定葛根素对照品10mg,加95%乙醇制成80μg/mL的葛根素对照品母液,取适量对照品母液用95%乙醇稀释为浓度为1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/m L,22.4μg/mL的系列标准溶液,以95%乙醇为空白对照,在250nm用紫外-可见分光光度计测定吸光度,绘制标准曲线,得到线性回归方程;
(2)供试品溶液的制备:精密称取过三号筛的葛根药材粉末适量,置于具塞锥形瓶中,精密加入95%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取30min,放冷,再称定重量,用95%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置于50ml量瓶中,加95%乙醇至刻度,摇匀,即得;
(3)供试品的测定:在250nm用紫外-可见分光光度计测定步骤(2)所述供试品溶液的吸光度,根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
实施例7-12:
分别按实施例1-6的方法检测葛根总黄酮含量,区别在于,用超声提取替换加热回流。
实验例:
1、供试品溶液前处理方法考察
对葛根总黄酮含量测定方法的提取溶剂、提取方式以及提取时间进行考察,确定样品前处理方法。
1.1提取溶剂考察
取葛根药材粉末(样品批次:JY2021K001)适量,精密称定,平行4组,每组2份,置具塞锥形瓶中,分别精密加入水、30%乙醇、稀乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇50ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用相应溶剂补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置50ml量瓶中,加相应溶剂至刻度,摇匀,即得。分别取供试品溶液和对照品溶液,以相应溶剂为空白,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在250nm波长处测定吸光度,计算,即得。实验结果见表1。
表1不同提取溶剂葛根总黄酮含量测定结果
实验结果表明:通过对比4种提取溶剂样品中总黄酮含量,可发现30%乙醇对葛根中总黄酮的提取率较高,故选择30%乙醇作为葛根总黄酮含量测定的最佳提取溶剂。
1.2提取方式考察
取葛根药材粉末(过三号筛)适量,精密称定,平行2组,每组2份,置具塞锥形瓶中,分别精密加入30%乙醇50ml,称定重量,分别超声处理(功率250W,频率40kHz)60分钟,加热回流60分钟,放冷,再称定重量,分别用30%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置50ml量瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,即得。分别取供试品溶液和对照品溶液,以30%乙醇为空白,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在250nm波长处测定吸光度,计算,即得。实验结果见表2。
表2不同提取方式葛根总黄酮含量测定结果
实验结果表明:通过对比超声与回流两种提取方式的总黄酮含量,发现提取方式为加热回流时总黄酮含量最高,故选择加热回流为最佳提取方式。
1.3提取时间考察
取葛根药材粉末(过三号筛)适量,精密称定,平行3组,每组2份,置具塞锥形瓶中,分别精密加30%乙醇50ml,称定重量,分别加热回流15分钟、30分钟、45分钟,放冷,再称定重量,分别用30%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置50ml量瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,即得。分别取供试品溶液和对照品溶液,以30%乙醇为空白,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在250nm波长处测定吸光度,计算,即得。实验结果见表3。
表3不同提取时间葛根总黄酮含量测定结果
实验结果表明:通过对比不同加热回流时间的总黄酮含量,发现加热回流30min效果最好,故选择30min为最佳加热回流提取时间。
1.4供试品溶液制备方法的确定
根据样品前处理考察实验结果,确定供试品最佳制备方法可确定为:
取葛根药材粉末(过三号筛)适量,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加30%乙醇50ml,称定重量,加热回流30分钟,放冷,再称定重量,用30%乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取滤液0.5ml,置50ml量瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,即得。
2、本发明葛根总黄酮含量测定方法学验证试验
2.1专属性考察
精密吸取本发明葛根总黄酮供试品溶液、葛根素对照品溶液与空白溶剂,在190nm~400nm进行全波长扫描。结果见图1。
实验结果表明:葛根总黄酮供试品溶液与葛根素对照品溶液在250nm处均有最大吸收,但空白溶剂在此处无干扰,故以本法测定葛根中总黄酮(以葛根素计)的含量具有专属性。
2.2线性考察
精密称定葛根素对照品10mg,加30%乙醇(溶剂)制成80μg/mL的葛根素对照品溶液母液。
标准曲线的制备:分别将上述母液稀释为浓度1.6μg/mL,3.2μg/mL,4.8μg/mL,6.4μg/mL,8.0μg/mL,9.6μg/mL,12.8μg/mL,16.0μg/mL,19.2μg/mL,22.4μg/mL的标准溶液,以30%乙醇溶为空白,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在250nm的波长处分别测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,结果见表4、同时绘制标准曲线,标准曲线见图2。
表4葛根素线性考察结果
本发明线性回归方程为:y=0.0709255x+0.00378142,R
2.3精密度考察
按照本发明的供试品制备方法,制备供试品溶液并测定,连续测定6次吸光度,经测定,精密度RSD为0.02%,结果表明仪器精密度良好,测定结果见表5。
表5精密度考察结果
2.4稳定性考察
按照“1.2.1.1”项下确定的供试品制备方法,制备供试品溶液并测定,分别在0,15,30,60,120,180分钟测定吸光度,经测定,稳定性RSD为1.10%,供试品溶液在180分钟内稳定,测定结果见表6。
表6稳定性考察结果
2.5重复性考察
取同一批葛根药材粉末约0.1g,精密称定,平行称定6份,按照“1.2.1.1”项下确定的供试品制备方法,制备供试品溶液及测定,测定供试品溶液中总黄酮含量,经测定,重复性RSD为1.79%,本发明的分析方法的重复性良好,测定结果见表7。
表7重复性考察结果
2.6总黄酮含量范围实验
按照本发明的供试品制备方法,测定不同产地葛根总黄酮含量,结果见表8。
表8贵州不同产地葛根总黄酮含量测定结果
本研究中,总黄酮的含量范围实验为含量的最大值和含量的最小值。根据不同产地葛根总黄酮含量测定结果可得:葛根黄酮含量最高批次为J22K0012,含量为21.58%,葛根黄酮含量最低批次为J22K0030,含量为0.92%。2020版中国药典要求本品按干燥品计算,含葛根素(C
2.6.1含量最大值
(1)重复性实验
取同一批葛根总黄酮含量最高的葛根药材粉末约0.1g(批号:J22K0012),精密称定,按本发明的供试品溶液制备方法,制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量,计算RSD,测定结果见表9。
表9重复性考察结果
实验结果表明该分析方法的重复性良好。
(2)准确度实验
取已知含量的样品(批号:J22K0012,含量:20.15%)约0.1g,精密称定,每份加入约1/3倍量的葛根素对照品,按本发明的供试品溶液制备方法,制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量,计算RSD,并按以下列公式计算回收率及RSD,结果见表10。
表10准确度试验
实验结果显示葛根素回收率为94.82%,根据《中国药典》2020版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10%时,回收率限度为92%~105%,表明回收率良好。
2.6.2含量最小值
(1)重复性实验
取同一批含量最低的葛根药材粉末(批号:JY2021K001,)0.1g,精密称定,按本发明的供试品溶液制备方法,制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量,计算RSD,测定结果见表11。
表11重复性考察结果
实验结果表明该分析方法的重复性良好。
(2)准确度实验
取已知含量的样品(批号:JY2021K001)0.1g,精密称定,每份加入0.5倍量葛根素对照品,按本发明的供试品溶液制备方法,制备供试品溶液6份。测定250nm条件下供试品溶液中总黄酮含量,计算RSD,并按以下列公式计算回收率及RSD,结果见表12。
表12准确度试验
实验结果显示葛根素回收率为102.29%,根据《中国药典》2020版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10%时,回收率限度为92%~105%,表明回收率良好。
本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑地分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
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