周期蛋白PER2及其基因在抑制Tau及磷酸化Tau蛋白聚集、提升认知功能中的应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及周期蛋白PER2及其基因在抑制Tau及磷酸化Tau蛋白聚集、提升认知功能中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白沉积和Tau蛋白过磷酸化引起的神经原纤维缠结。P301L转基因小鼠(P301L小鼠)是通过将包含P301L突变(其染色体10号外显子存在错义突变，使301位的脯氨酸突变为亮氨酸)的人源性最长Tau蛋白异构体和鼠神经元特异性启动子Thy-1序列的质粒注射在小鼠受精卵中繁育而来。故P301L小鼠脑组织表达过量的Tau蛋白与磷酸化Tau蛋白，已形成神经纤维缠结，是目前较为常用的阿尔茨海默病动物模型。

周期蛋白PER2作为调节生物节律的蛋白之一，在体内发挥诸多作用。如李朋佳等公开了PER2蛋白具有抑制β1-AA诱导的H9c2心肌细胞死亡的作用【李朋佳,贾微微,陆洁蓓,马明霞,周秀雅,王宁,原媛,郭蕊,牛晓辰,王晓晖,王丽.Per2蛋白抑制β1-肾上腺素受体自身抗体诱导的心肌细胞死亡[J].陆军军医大学学报,2022,44(9):898-905.DOI:10.16016/j.2097-0927.202110010】，李波等公开了PER2可能通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，对肝癌的进展发挥抑制作用【李波,王沈,颜昭勇,等.Per2对肝癌患者预后及肝癌细胞生长和凋亡的作用[J].基础医学与临床,2018,38(4):6.】。但现有研究中并未揭示周期蛋白PER2与阿尔茨海默病等神经退行性疾病的相互作用关系。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了周期蛋白PER2及其基因在抑制Tau及磷酸化Tau蛋白聚集、提升认知功能中的应用。本发明确定了周期蛋白PER2与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关，通过敲除小鼠的PER2基因可以抑制Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白聚集，以及提升P301L小鼠的认知功能。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了周期蛋白PER2或PER2基因在调控Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集与传播中的应用。

优选的，所述调控包括通过负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量来抑制Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集与传播。

本发明还提供了周期蛋白PER2或PER2基因在调控动物的认知功能中的应用。

优选的，所述调控包括通过负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量来提高动物的认知功能。

本发明还提供了负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量的试剂在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。

优选的，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病。

本发明还提供了负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量的试剂在构建减轻阿尔茨海默病的小鼠模型中的应用。

有益效果：

周期蛋白PER2或PER2基因在调控Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集与传播中的应用。本发明通过利用PER2基因敲除小鼠与P301L小鼠进行杂交，并经过逐代繁育得到PER2-/-x P301L双转基因小鼠，并通过与P301L小鼠比较Tau蛋白、磷酸化Tau的表达量，确定了周期蛋白PER2或PER2基因具有调控Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集的作用，通过敲除小鼠的PER2基因可以抑制Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白聚集。

另外，敲除小鼠的PER2基因可以提升P301L小鼠的认知功能，为研制治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物提供了一种新的思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为PER2敲除小鼠的构建原理图；

图2为PER2-/-小鼠与PER2-/-x P301L小鼠的PCR扩增结果图；其中PER2 KO为PER2敲除小鼠，PER2 WT为PER2未敲除小鼠，Actin为β-actin内参基因，P301L为P301L突变小鼠；

图3为PER2-/-小鼠和野生型小鼠的PER2蛋白表达量的westernblot检测结果；

图4为PER2-/-x P301L小鼠和P301L小鼠的PER2蛋白表达量的western blot检测结果；

图5为PER2-/-x P301L小鼠和P301L小鼠不同蛋白含量的western blot检测结果；

图6为野生型小鼠(WT)、P301L小鼠和PER2-/-x P301L小鼠的活动轨迹图；

图7为野生型小鼠(WT)、P301L小鼠和PER2-/-x P301L小鼠的活动距离结果；

图8为野生型小鼠(WT)、P301L小鼠和PER2-/-x P301L小鼠的Morris水迷宫实验中活动轨迹图；

图9为野生型小鼠(WT)、P301L小鼠和PER2-/-x P301L小鼠的Morris水迷宫实验中滞留时间结果；纵坐标单位为秒；

图10为野生型小鼠(WT)、P301L小鼠和PER2-/-x P301L小鼠的Morris水迷宫实验中穿越平台区域次数结果；

其中*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。

具体实施方式

本发明提供了周期蛋白PER2或PER2基因在调控Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集与传播中的应用。

在本发明中，所述调控优选包括通过负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量来抑制Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集与传播。在本发明中，所述负调控优选包括通过敲除PER2基因，降低PER2蛋白或PER2基因的表达量。

本发明通过利用PER2基因敲除小鼠与P301L小鼠进行杂交，并经过逐代繁育得到PER2-/-x P301L双转基因小鼠，并通过与P301L小鼠比较Tau蛋白、磷酸化Tau的表达量，确定了周期蛋白PER2或PER2基因具有调控Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集的作用，通过敲除小鼠的PER2基因可以抑制Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白聚集。

本发明还提供了周期蛋白PER2或PER2基因在调控动物的认知功能中的应用。

在本发明中，所述调控优选包括通过负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量来提高动物的认知功能。

本发明通过实验证明了敲除小鼠的PER2基因还可以提升对P301L小鼠的认知功能，为研制治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物提供了一种新的思路。

本发明还提供了负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量的试剂在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。在本发明中，所述神经退行性疾病优选包括阿尔茨海默病。

本发明通过实验证明了敲除小鼠的PER2基因还可以提升对P301L小鼠的认知功能，利用负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量的试剂制备的药物可用于治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病。

本发明还提供了负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量的试剂在构建减轻阿尔茨海默病的小鼠模型中的应用。在本发明中，所述小鼠优选包括P301L小鼠。通过负调控PER2蛋白或PER2基因的表达量来抑制Tau蛋白和/或磷酸化Tau蛋白的聚集与传播，可以提高P301L小鼠的认知功能，从而可以构建减轻阿尔茨海默病的小鼠模型。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的周期蛋白PER2及其基因在抑制Tau及磷酸化Tau蛋白聚集、提升认知功能中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、PER2敲除小鼠(苏大剑桥基因组中心的动物编号为：C57BL/6N-Per2 tm1a(EUCOMM)Hmgu/Cmsu，网址：https://www.cam-su.org/cms/viewStrainByGene？geneId＝18820&showClone＝Y&keyword＝per2)，由北京生命科学研究所张二荃教授赠送(来自苏州大学-剑桥基因组研究中心)，具体原理如下：通过在目的基因Per2内含子中插入一个SA-IRES-reporter片段(含有报告基因lacZ和一个启动子驱动的Neo)，lacZ的转录在SA的作用下受目的基因启动子控制，并在polyA处终止，从而达到终止目的基因转录、破坏基因表达的目的(图1)。

2、通过对小鼠鼠爪DNA进行PCR扩增并检测验证初步得到敲除小鼠(图2中的A)，具体实验过程如下：

1)样本处理及DNA提取：a.子鼠于产后21天剪爪，组织保存在离心管，于-20℃保存；b.取出组织，恢复至室温，加入100μl工作液A(称取250mg NaOH，0.0186g EDTA，溶于250mL灭菌去离子水中，制成10×工作液A，将10×工作液A与灭菌去离子水按体积比为9:1比例稀释成1×工作液A，室温保存)；c.封口膜封好后，100℃加热55min；d.加热结束，自然冷却，加入100μL工作液B(称取484.4mg Tris，加入50mL灭菌去离子水，HCl调节PH在7.5～8之间，定容至100mL，室温保存)，4℃过夜保存。

2)DNA扩增：

使用检测Per2敲除的标准PCR方案对后代进行DNA扩增

a.每个样品配制2管，分别扩增PER2-WT和PER2-KO序列。

管1：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，ddH

b.瞬时离心，放入PCR仪。PCR程序如下：Step1：94℃3min，Step2：94℃30s，56℃30s，72℃30s(34个循环)，Step3：72℃2min，Step4:4℃forever；

c.用于对PER2敲除小鼠基因分型的PCR引物序列如下：PER2-KO-F：GCTCCAGACTGCCTTGGGAAAA，SEQ ID NO.1，PER2-KO-R：GCTTAGGGAAACTCACTCGGACT，SEQ IDNO.2；PER2-WT-F：TCTACAGACCAGCCCCAGACCACCA，SEQ ID NO.3，PER-WT-R:GCTCCGAAGTCCCTCAGATGAAAAC，SEQ ID NO.4。

d.扩增程序结束后，4℃保存。

3)基因型鉴定

a.配制1％琼脂糖凝胶：1×TAE 75ml中加入0.6g琼脂糖，微波炉加热至沸腾，摇晃均匀，再次加热，直至液体彻底澄清透明，加入5μL 10000×Gelred核酸染料，摇匀。

b.倒入模具，室温静置冷却1h。

c.静置结束后，放入核酸电泳槽中，加入1×TAE工作液。

d.依次向每个加样孔中加入5μL Marker、样品，电泳条件为：100V，30min。

e.电泳结束后，小心取出琼脂糖凝胶，在AMI680系统中进行曝光成像，其中PER2敲除杂合子在300bp，400bp显示双条带，PER2敲除纯合子小鼠仅在300bp显示条带。

3、随后通过western blot方法检测小鼠大脑海马组织的PER2蛋白质表达，具体步骤如下：

小鼠海马样本处理

(1)选择3只PER2 KO小鼠为实验组，3只野生型雄性小鼠为对照组。取材于早上8点进行。

(2)用2，2，2-三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠，使用75％乙醇对腹部进行灭菌消毒，手术剪打开胸腔后，暴露心脏。

(3)使用0.1M PBS进行心脏灌注。待灌注10mLPBS后，此时肝脏由红色变为白色，将小鼠脱颈处死。

(4)眼科剪将头部皮肤剪开，沿人字缝小心划开颅骨，暴露大脑，于冰上将大脑取出，小心分离左右两侧海马。放入冻存管，在液氮中保存。

提取蛋白质

(1)将海马样本于液氮中取出，称重后，放入提前放好磁珠的离心管中。按每1mg样本质量加入10μl RIPA混合液(含1％蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂)，加入冰冷的RIPA，在4℃下使用组织研磨机70Hz，30s研磨组织，4℃离心机离心，10000g，5min。

(2)标记新离心管，吸取蛋白上清液，弃去组织沉淀，将上清放入冰盒中。

(3)配制样品稀释液：另标记新离心管，吸取10μL蛋白上清液，加990μL生理盐水(稀释100倍)，混匀放于冰盒。

(4)配制蛋白标准品：吸取6μl 25mg/mL蛋白标准品，加入294μL生理盐水，混匀，制成0.5mg/ml蛋白标准品稀释液，做好标记。

(5)96孔板加样：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到板中，生理盐水20、19、18、16、12、8、4、0μL补足到20μL，相当于标准品浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，重复三孔。将20μL样品稀释液加入96孔板，重复三孔。

(6)配制BCA工作液：工作液比例为A:B＝50:1，室温放置，标准品孔及样品孔各加200μLBCA工作液，37℃孵育30min。

(7)酶标仪测A562，做蛋白标准曲线，根据稀释比计算蛋白质样品原液浓度。

(8)定浓度：标记新离心管，若将蛋白统一浓度为7μg/μL，总体积200μL，吸取原蛋白上清液V＝7×200/原液浓度，生理盐水体积为200-VμL，50μL5×蛋白上样缓冲液，充分混匀，瞬时离心。

(9)将离心管放入浮漂中，100℃加热10min，冰水冷却，混匀离心，分装(避免反复冻融，不超过3次)，-20℃保存。

制备聚丙烯酰胺凝胶：

(1)配制浓度为10％的分离胶，配置方法如下：固定1.5mm玻璃板，使用去离子水验漏10min，确保玻璃板不漏液。

(2)验漏结束后，擦净玻璃板。在烧杯中依次加入去离子水7.9mL，30％丙烯酰胺(制胶液)6.7mL，1.5M Tris-HCl(pH＝8.8)5.0mL，10％SDS 0.2mL，10％AP 0.2mL，TEMED0.008mL充分混匀后，加入玻璃板中，加至距离绿色横杠1cm处，吸取1mL无水乙醇小心加入压平液面，室温静置1h。

(3)配制浓度为5％积层胶，配制方法如下：将无水乙醇倒出，滤纸吸净，在烧杯中依次加入去离子水4.1mL，30％丙烯酰胺(制胶液)1mL，1M Tris-HCl(pH＝6.8)0.75mL，10％SDS 0.06mL，10％AP 0.06mL，TEMED 0.006mL充分混匀后，加入玻璃板中，插入10孔梳子。室温静置1h。

(4)静置结束后，将胶板浸泡在电泳缓冲液中，保存于4℃冰箱。

SDS-PAGE电泳

(1)冰箱中取出胶板，室温平衡15min。

(2)将胶板对齐放入电泳夹板中，注意短板朝里，倒入电泳液，没过胶板。

(3)小心取下上样梳，注意上样孔中不要有气泡，否则影响条带形状。

(4)Marker，蛋白样品于-20℃冰箱中取出，充分涡旋，瞬时离心。

(5)按顺序将Marker，蛋白样品加入上样孔中，Marker 5μL，蛋白样品上样30μg，上样结束后，盖好电泳槽盖子，连接电源，电泳条件为：100V，120min。

(6)剪裁与胶合适大小的PVDF膜，注意不要用手触碰，全程使用镊子，以防污染PVDF膜。将膜在甲醇中浸泡30s活化，活化结束后浸泡在预冷转膜缓冲液中平衡15min。将滤纸、海绵、夹板浸泡在预冷转膜缓冲液中15min。

(7)切去蓝色溴酚蓝指示条带，根据目的蛋白大小切去不需要的胶，按照“黑板-海绵-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-海绵-白板”三明治结构夹好，注意胶、PVDF膜与滤纸之间不要有气泡。将夹板放入电泳槽，加入预冷的转膜缓冲液。盖上转膜槽盖子，连接电源，湿转条件为：200mA，90min，当目的蛋白为90KD以上时，电泳条件改为：200mA，110min。电泳槽中加冰袋，电泳槽放在冰盒中。防止快转产生的大量热量影响转膜效率。

(8)转膜时间结束后，使用含5％脱脂牛奶的TBST封闭PVDF膜，室温摇床1小时。

(9)封闭结束后，将PVDF膜转移到一抗中在4℃下与一抗摇床过夜。

(10)一抗孵育结束后，TBST洗PVDF膜三次，每次10min。

(11)随后将PVDF膜转移至HRP缀合的二抗，室温摇床1h。

(12)二抗室温摇床结束后，TBST洗PVDF膜三次，每次10min。

(13)按1:1比例配制化学发光显影液，均匀滴加在PVDF膜上，在AMI680系统上成像，其中β-ACTIN作为内参蛋白。

蛋白抗体及稀释比例

图像采集及数据处理

使用Image J对目的蛋白和内参蛋白(统一使用β-ACTIN作为内参蛋白进行标准化)条带扫灰度值，确保背景灰度一致，内参蛋白表达一致的情况下，目的蛋白的表达量计算公式如下：

目的蛋白相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值

结果见图3，由图3可知，PER2蛋白质含量显著性降低，其中PER2敲除小鼠(PER2-/-)的PER2蛋白质含量为1.184±0.153，野生型小鼠(Contronl)蛋白质含量为0.461±0.088，证明PER2敲除小鼠的构建成功。

4、利用雌性PER2敲除小鼠与雄性P301L小鼠进行合笼饲养，待雌性PER2敲除小鼠受孕获得子一代杂合子小鼠即PER2+/-x P301L小鼠，随后将雌性与雄性的PER2+/-x P301L小鼠进行合笼进行品系内自交，获得PER2-/-x P301L小鼠。

5、通过对小鼠鼠爪DNA进行PCR扩增并检测验证得到PER2-/-x P301L小鼠，结果见图2中的B，具体实验过程如下：

1)样本处理及DNA提取：a.子鼠于产后21天剪爪，组织保存在离心管，于-20℃保存；b.取出组织，恢复至室温，加入100μl工作液A(称取250mg NaOH，0.0186g EDTA，溶于250mL灭菌去离子水中，制成10×工作液A，将10×工作液A与灭菌去离子水按体积比为9:1比例稀释成1×工作液A，室温保存)；c.封口膜封好后，100℃加热55min；d.加热结束，自然冷却，加入100μL工作液B(称取484.4mg Tris，加入50mL灭菌去离子水，HCl调节PH在7.5～8之间，定容至100mL，室温保存)，4℃过夜保存。

2)DNA扩增：

使用检测h-tau转基因的标准PCR方案对后代进行DNA扩增。

a.按照10μl反应体系加入PCR管：dNTP 1.0μL，iTaq酶0.2μL，10×Taq Buffer 1μL，2对引物：β-actin(20μM)各0.2μL，Tau(20μM)各0.2μL，DEPC处理水5μL，DNA模板2μL。

b.瞬时离心，放入PCR仪。PCR程序如下：Step1：94℃5min，Step2：94℃45s，58℃45s，72℃45s(35×)，Step3：72℃10min，Step4:4℃forever。

c.用于对P301L小鼠基因分型的PCR引物如下：Tau-F：GGAGTTCGAAGTGATGGAAG，SEQID NO.5，Tau-R：GGTTTTTGCTGGAATCCTGG，SEQ ID NO.6；β-Actin-F：CAACTGGGACGATATGGAGAAG，SEQ ID NO.7，β-Actin-R:TCTCCTTCTGCATCCTGTCAG，SEQ IDNO.8。

d.扩增程序结束后，向PCR产物中加入2μL 6×Loading Buffer，涡旋混匀，4℃保存。

3)基因型鉴定

a.配制1％琼脂糖凝胶：1×TAE 75ml中加入0.6g琼脂糖，微波炉加热至沸腾，摇晃均匀，再次加热，直至液体彻底澄清透明，加入5μL 10000×Gelred核酸染料，摇匀。

b.倒入模具，室温静置冷却1h。

c.静置结束后，放入核酸电泳槽中，加入1×TAE工作液。

d.依次向每个加样孔中加入5μLMarker、样品，电泳条件为：100V，30min。

e.电泳结束后，小心取出琼脂糖凝胶，在AMI680系统中进行曝光成像，Actin在700bp显示条带，h-Tau在500bp显示条带。最终保留基因型为PER2敲除纯合子的P301L转基因小鼠。

随后通过westernblot方法检测小鼠大脑海马组织的PER2蛋白质表达，方法同步骤3，结果见图4；由图4可知，PER2蛋白质含量显著性降低，其中PER2-/-x P301L小鼠的PER2蛋白质含量为1.93±0.24，P301L小鼠(Contronl)蛋白质含量为0.64±0.09，证明PER2-/-xP301L小鼠的构建成功。

6、取PER2-/-x P301L小鼠海马组织进行westernblot实验，具体实验过程为：

小鼠海马样本处理同步骤3；

提取蛋白质同步骤3；

制备聚丙烯酰胺凝胶同步骤3；

SDS-PAGE电泳同步骤3；

蛋白抗体及稀释比例同步骤3；

图像采集及数据处理

使用Image J对目的蛋白和内参蛋白(统一使用β-ACTIN作为内参蛋白进行标准化)条带扫灰度值，确保背景灰度一致，内参蛋白表达一致的情况下，目的蛋白的表达量计算公式如下：

目的蛋白相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值

结果见图5。由图5可知，敲除P301L小鼠的PER2基因，显著性降低了几个位点的总Tau蛋白磷酸化含量(Tau5)，具体为：丝氨酸396位点磷酸化形式Tau蛋白(ps3965)，丝氨酸202位点及苏氨酸205位点磷酸化Tau蛋白(AT8)含量显著降低。

综上所述，PER2-/-小鼠海马Tau蛋白与磷酸化Tau蛋白含量显著降低，故敲除PER2蛋白能降低Tau蛋白与磷酸化Tau蛋白的聚集。

实施例2

分别对P301L小鼠以及PER2-/-x P301L小鼠进行水迷宫以及旷场实验，具体实验过程为：

旷场实验是将小鼠置于50cm x 50cm空旷的场箱中，让小鼠自由活动，通过摄像记录分析小鼠的活动轨迹，活动距离，用来评估检测动物的活动能力与空间探索能力。

Morris水迷宫实验被认为是评价空间学习记忆的经典实验方法，把直径120cm的圆形水箱中设立4个象限，并在第三象限中放置平台，分别从第一，第二，第三，第四个象限中放入动物，记录动物进入平台所需要的时间，每天每只动物训练4次，共计训练6天，在第7天撤去平台，记录小鼠在平台区域穿过次数以及滞留时间。

通过对6只野生型小鼠(WT)，6只P301L小鼠，以及5只PER2-/-x P301L小鼠进行旷场实验发现，相比较于P301L小鼠，PER2-/-x P301L小鼠在旷场中活动距离显著性增加，其中野生型小鼠平均活动距离为39601±2495mm，P301L小鼠的平均活动距离为45118±1351mm，PER2-/-x P301L小鼠的平均活动距离为60766±3824mm，活动能力增强(图6和图7)。

通过对6只野生型小鼠(WT)，6只P301L小鼠，以及5只PER2-/-x P301L小鼠进行Morris水迷宫实验发现，相比较于P301L小鼠，PER2-/-x P301L小鼠显著性降低进入平台区域的潜伏期(其中野生型小鼠平均潜伏期为18±8.625min，P301L小鼠的平均潜伏期为59.67±0.228min，PER2-/-x P301L小鼠的平均潜伏期为28.40±12.57min)，并增加穿越平台区域的次数(其中野生型小鼠平均次数为3.67±0.803次，P301L小鼠的平均次数为0.14±0.14次，PER2-/-x P301L小鼠的平均次数为2.60±1.08次)，表明敲除PER2蛋白能显著性增加P301L小鼠的空间学习记忆能力(图8～10)。

综上所述，本发明确定了周期蛋白PER2与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关，通过敲除小鼠的PER2基因可以抑制Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白聚集，以及提升对P301L小鼠的认知功能。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。