溶血磷脂酰肌醇的制备方法

相关申请的引用

本申请要求2020年7月6日提交的国际专利申请号PCT/CN2020/100444、名称为“溶血磷脂酰肌醇的制备方法”和2020年7月14日提交的美国临时专利申请号63/051,697、名称为“溶血磷脂酰肌醇的制备方法”的优先权权益，它们全部公开内容通过引用整体并入本文。

背景技术

市售卵磷脂是富含磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)的磷脂(PL)家族(图1)。它是公知的天然表面活性剂并且广泛用于食品、饲料和制药行业。商业卵磷脂通常从大豆、油菜籽、葵花籽和蛋黄中提取。不同资源的卵磷脂不仅磷脂类型及其含量不同，而且sn-1和sn-2位脂肪酸谱(profile)也不同，这使卵磷脂成为非常复杂的混合物。很难从天然卵磷脂中分离出高纯度的磷脂成分，尤其是LPI。

肠绒毛的健康发育对营养吸收有很大影响。Lysoforte

LPI可以通过水性介质中的磷脂酶A

表1.大豆卵磷脂(SL)和溶血卵磷脂(LCL)的磷脂谱(重量％)

Kemin已经开发了不同的酶水解方法来生产溶血卵磷脂。然而，溶血卵磷脂(LCL)中LPI的含量小于2.5％，且PI向LPI的转化率很低。

因此，工业上需要在实验室规模和中试规模下生产具有高LPI含量的溶血卵磷脂的有效方法。以低制造成本生产高LPI溶血卵磷脂的能力将为使用LPI作为动物营养成分提供更多机会。

发明内容

本发明涉及使用乙酸酯或醚为溶剂制备具有高LPI含量的溶血卵磷脂。还发展了一种快速有效的后处理程序，只需通过相分离即可将LPI产品与起始材料分离。本发明的方法令人惊讶地在本发明的高LPI溶血卵磷脂产品中提供了丰富的LPC、LPE和LPA含量。

卵磷脂与有机溶剂、缓冲液或水以及磷脂酶组合以催化磷脂的水解。在本发明的一个实施方式中，将卵磷脂与EtOAc、磷酸缓冲盐溶液(PBS)和PLA

附图说明

图1是实施例2中所述的高LPI溶血卵磷脂的中试生产流程图。

图2是示出实施例2中所述的反应温度对LPI含量的影响的图。

图3是示出实施例2中所述的反应时间对LPI含量的影响的图。

图4是示出实施例2中所述的乙酸乙酯体积对LPI含量的影响的图。

图5是示出PBS含量对LPI含量的影响的图。

图6是示出使用实施例2中所述的脱油卵磷脂为起始原料，PBS、PLA1、EtOAc和时间四个因素对LPI含量的影响的图。

图7是在实施例2中所述的建议条件下预测的最高LPI含量(13.9％)。

图8是示出当使用实施例2中所述的脱油卵磷脂作为起始原料时，在最佳条件下重复实验中LPI和LPC含量的图。

图9是示出使用实施例2中所述的常规大豆卵磷脂作为起始材料时，PBS、时间、EtOAc和PLA对LPI含量的影响的图。

图10是示出当使用实施例2中所述的常规大豆卵磷脂作为起始原料时，在最佳反应条件下在重复实验中LPI和LPC含量的图。

图11是示出使用乙酸异丙酯代替乙酸乙酯作为溶剂的实施例3中所述的最终产品中LPI和LPC含量的图。

图12是示出本发明方法的流程图。

具体实施方式

本发明涉及高LPI溶血卵磷脂及其相关工艺和方法。起始材料是卵磷脂(磷脂酰胆碱)及其所有的源(来源，source)，包括但不限于大豆、向日葵、玉米、油菜籽、花生、内脏肉、红肉、全蛋、全脂牛奶加奶油、菠菜、花椰菜、橙子、麦芽、鱼、乳制奶油和肝脏。起始材料也可以是各种形式，包括但不限于液体、固体、糖浆、浆液和糊状物。在本发明的一个实施方式中，卵磷脂的源是脱油卵磷脂和大豆卵磷脂。本发明还旨在包括其他潜在的天然和合成源的卵磷脂。

卵磷脂首先与溶剂、缓冲液或去离子水以及磷脂酶混合以催化磷脂的水解。溶剂是能够至少部分溶解卵磷脂的溶剂。这种溶剂是本领域公知的并且包括但不限于甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，以及醚和乙酸酯，如二乙醚、乙醚、甲基叔丁基醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、乙酸异丙酯和乙酸乙酯(EtOAc)。在本发明的一个实施方式中，溶剂是EtOAc。应以溶剂体积比卵磷脂重量为至少约100％的量包含溶剂。在一个实施方式中，应以溶剂体积比卵磷脂重量在约300-1200％的范围内、优选溶剂体积比卵磷脂重量在约400-600％的范围内的量包含溶剂。

许多类型的缓冲液以及去离子水都适用于本发明，包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered solution，PBS)、改良的PBS缓冲液、硼酸盐缓冲液、Hepes和其他Good's缓冲液、碱性缓冲液如碳酸盐缓冲液和基于Tris的缓冲液、以及酸性缓冲液如柠檬酸盐缓冲液。在本发明的一个实施方式中，缓冲液是PBS。在一个实施方式中，以缓冲液重量比卵磷脂重量为至少约1％的量包含缓冲液。在一个实施方式中，以缓冲液重量比卵磷脂重量在约20-120％的范围内、优选缓冲液重量比卵磷脂重量为约30-80％的量包含缓冲液。

本发明的磷脂酶可以是任何能够将卵磷脂分子裂解成脂肪酸和其他亲脂性物质的磷脂酶，通常为磷脂酶A

将卵磷脂、溶剂、缓冲液和磷脂酶的混合物加热到足以引起卵磷脂水解的温度。通常，将混合物加热到至少30℃的温度持续至少15分钟的时间段。在一个实施方式中，将混合物加热到约40-65℃范围的温度持续约0.5-5小时的时间段，优选温度低于约65℃且时间段为约3-5小时。反应后，将PLA

接下来将水解混合物冷却至一定温度并持续足以发生相分离的时间段，通常是至40℃或更低的温度和至少30分钟的时间段。溶血卵磷脂成分沉降到底部的水相中，而油和游离脂肪酸保留在顶部的溶剂相中。使用本领域已知的程序收集和干燥水相，包括但不限于喷雾干燥、滚筒干燥、冷冻干燥、微波干燥、对流干燥、传导干燥、空气干燥等。在一个实施方式中，将溶液干燥至20重量％或更少的水分。在另一个实施方式中，将溶液干燥至约10重量％或更少的水分含量。有机相被丢弃或回收。

当使用常规大豆卵磷脂作为起始材料时，最终组合物含有显著较高的LPI百分比，LPI含量从约1.4％增加到6.5％。此外，平均LPC含量从约5％显著增加至15％或更高。LPA含量也明显更高。总之，本发明提供了制备高LPI、高LPC和高LPA溶血卵磷脂的具有成本效益的、环境友好且有效的方法。

本发明的组合物可以任选地与药用载体组合，该药用载体可以包括一种或多种载体或赋形剂，例如填充剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂。这种成分及其包含的相对量是本领域技术人员公知的。

难以获得高LPI含量的溶血卵磷脂的原因有二：难以控制PI水解成LPI的程度，以及缺乏从水解混合物中富集LPI的纯化方法。为了提高PI的水解，需要大量的水或过量的酶如磷脂酶A

在本发明中，有机溶剂用于卵磷脂的酶促水解以更好地控制PI向LPI的转化。当某些有机溶剂与少量水一起使用时，LPI转化率能够达到>90％。没有观察到PI过度水解为GPI。本发明还发明了简化的后处理程序以高产率富集LPI。

1.Cabezas,Dario&Diehl,Bernd&Tomás,Mabel.(2015).Emulsifying propertiesof hydrolysed and low HLB sunflower lecithin mixtures.European Journal ofLipid Science and Technology.118.10.1002.

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3.US专利20050227945A1,2005.Enzymatic modification of lecithin.

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5.专利WO 2019/040992 Al,2019.Synthetic derivatives of oleoyl-lysophosphatidyl inositol(oleolyl-lpi)and uses thereof.

以下实施例用于说明而非限制本发明。因此，在理解可以进行各种制剂改变和递送方法改变但仍然在本发明宗旨内的情况下呈现实施例。

材料和方法

化学品和试剂。PC含量约15％(PC15)和30％(PC30)的大豆卵磷脂购自MeryasLecithin Co.Ltd,Beijing,China。PC30为粉状。磷脂酶A

有机溶剂中磷脂酶A

将混合物在50℃下连续温育，并在1小时、2小时和4小时后取样用于薄层色谱(TLC)分析(稍后描述)。TLC可以半定量地确定卵磷脂向溶血卵磷脂的转化。为了用最少剂量的Lecitase Ultra获得最大的转化率，通过改变溶剂、底物浓度和酶剂量重复该试验几次。

薄层色谱法。用二氯甲烷(DCM)将卵磷脂和溶血卵磷脂标准品、反应混合物和来自快速层析(闪光色谱，flash chromatography)的馏分稀释至约10mg/mL。然后将它们点样到6x3cm TLC板上并用吹风机吹干。将TLC板置于玻璃室中进行显影。DCM:甲醇:水(75:25:4,v/v/v)的混合物用作显影溶剂(developing solvent)。当显影溶剂接近TLC板的顶部边缘时，将其取出，干燥并用2.5％磷钼酸的乙醇溶液染色。最后将染色后的TLC板在热板上或用吹风机加热使其显色，PC和LPC在TLC板上显示为绿色斑点。

卵磷脂的酶促水解。卵磷脂的水解由三个主要步骤组成—反应、后处理和快速纯化。1)反应：分别称取PC15或PC30(各10g)到150mL带磨砂玻璃接头的锥形烧瓶中。向每个烧瓶中添加50mL乙酸乙酯(EtOAc)。烧瓶用磨砂玻璃塞塞住。然后将混合物加热至50℃并通过磁力搅拌棒搅拌直至卵磷脂全部溶解，随后添加2.5mL的10％Lecitase Ultra水溶液。温育2小时后，立即用水浴将混合物冷却至室温。大多数LPC会沉淀出来并在烧瓶底部形成粘性固体层。2)后处理：沉降10分钟以分离有机相和固体层后，倾析顶部有机相。沉淀物再次用另一份EtOAc(50mL)洗涤。然后添加乙醇(50mL)以在50℃下溶解LPC。过滤热溶液或浆液。收集滤液并蒸干得到产物。

结果

卵磷脂酶促水解的溶剂筛选。

测试了九种用于酶促水解的有机溶剂(表2)。作为反应物，添加极少量的水以避免O/W乳化。当加热至50℃时，PC在甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、甲基叔丁基醚(MTBE)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EtOAc)和己烷中显示出良好的溶解性。PC微溶于异丙醇(iPrOH)，几乎不溶于丙酮。通过薄层色谱(TLC)板上的卵磷脂/(卵磷脂+溶血卵磷脂)的比估计转化率。发现MTBE和EtOAc是卵磷脂酶促水解的非常好的溶剂。他们都得到了>90％的转化率。更有趣的是，两种溶剂中都有沉淀物，我们发现大多数LPI产品留在沉淀物中，而脂肪酸留在溶剂中，只需倾析有机层即可富集LPI。

表2.卵磷脂在有机溶剂中的溶解度和转化率

富含LPI的溶血卵磷脂的酶促合成。两种不同等级的大豆卵磷脂样品PC15和PC30(各10g)用作合成富含LPI的溶血卵磷脂的起始材料。来自它们的粗制品分别标记为LPC15和LPC30。

合成结果列于表3中。甚至在所有样品中都检测不到PI。LPI分别达到6％和9.6％。还发现LPC和LPE都富集到>10％，而LPA富集到>2.9％。

表3.来自酶促水解的高LPI溶血卵磷脂产品的磷脂谱(％)

讨论

本文展示了通过酶促合成获得克级的高LPI溶血卵磷脂的简便方法。

与LCL的酶促合成相比，这种新的酶促合成的主要变化是：以乙酸乙酯为溶剂，将PI完全转化为LPI，并在该过程中富集了LPC/LPE/LPA。Lecitase Ultra是用于LCL中的磷脂酶A

这种新的酶促合成由所有易于处理的步骤组成：反应、倾析、洗涤和过滤。不需要复杂的纯化过程。反应步骤需要少量水用于水解过程，所以环境空气中的水分不会对合成造成问题。此外，整个过程没有使用混合溶剂。乙酸乙酯可以容易地单独蒸馏并重新用于下一批合成。其具有可规模化反应的特性。经过必要的改变后，其可以达到千克或百千克的规模。

参考文献

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7.Yao L.and Jung S.2010.

化学品和试剂。含有高磷脂酰肌醇(PI,24％)和低磷脂酰胆碱(PC,5％)的脱油粉状卵磷脂(淡黄色粉末)购自Maxim Biotechnology Co.,Ltd,Jiangsu,China；使用的磷脂酶A

设备。带热水器的磁力搅拌器(Shanghai Lichenbangxi Instruments Co.,Ltd)；电子天平；电动搅拌器(IKA RW20,German)；烘箱、真空烘箱、水浴锅(Shanghai YihengInstruments Co.,Ltd)。

磷酸缓冲盐溶液(PBS,pH 7.0,0.1M)的制备。将20.66g Na

在实验室规模下高LPI溶血卵磷脂的合成。在实验室规模下一般合成程序是根据Huang描述的方法并进行一些改变而进行的

反应条件对LPI转化率的影响。关于水解度的四个因素评价如下：反应时间(0.5、1.0、1.5、2、3和4h)、反应温度(40℃、50℃、60℃和65℃)、EtOAc体积(卵磷脂的300％、500％、750％和1000％，体积比卵磷脂重量，v/w)和PBS含量(20％、40％、60％和100％，重量比卵磷脂重量，w/w)。从反应混合物中取出样品并在真空烘箱中干燥以定量LPI和LPC含量。

通过应用正交实验设计优化反应参数。选择反应时间、PBS含量、EtOAc体积和PLA

表4.将脱油卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的正交实验设计的因素和水平

注：PBS、PLA

表5.将脱油卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的正交实验设计的实验细节

表6.将常规大豆卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的正交实验设计的因素和水平

注：PBS、PLA

表7.将常规大豆卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的正交实验设计的实验细节

在优化条件下重复小规模合成。将250g脱油卵磷脂或常规大豆卵磷脂添加到圆底烧瓶(2.5L)中，然后添加最佳量PBS、PLA

高LPI溶血卵磷脂的中试生产。在Hongji Photoelectric Material Co.,Ltd.Fuxin,Liaoning Province,China进行了三批次生产。使用常规大豆卵磷脂作为起始材料。最佳条件应用于中试生产。简而言之，将250kg常规大豆卵磷脂、75kg PBS、800kgEtOAc和0.5kg PLA

磷脂的高效液相色谱(HPLC)分析。如先前研究所述，使用HPLC-ELSD方法对LPI、LPC、PI和PC进行定量。

结果

反应条件对LPI转化率的影响。反应温度的结果显示在图2中。随着温度的升高，LPI含量略有增加，但当温度升高到65℃时，LPI含量急剧下降。这可能是由于PLA

将脱油卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的反应条件优化。当使用脱油卵磷脂作为起始材料时；不同反应条件下的LPI和PI水平显示在表8中。条目6、8、9中获得的LPI含量均高于11％，这远高于其他条目中获得的LPI含量。各因素对LPI水平的影响排序为PBS>PLA

表8.不同反应条件对脱油卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的影响

将常规大豆卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的反应条件优化。正交实验设计不同反应条件下的LPI含量显示在表9中。条目4、6和7的LPI含量远高于其他条目。四个因素对LPI含量的影响排序为：PBS>时间>EtOAc>PLA

表9.不同反应条件对将常规大豆卵磷脂转化为高LPI溶血卵磷脂的影响

高LPI溶血卵磷脂的中试生产。来自三批次中试生产的高LPI溶血卵磷脂产品中的LPI含量在表10中示出。LPI含量在酶促反应的前2小时内迅速增加，且生产的三批次中的最终LPI含量范围从5.8％至6.8％，这接近实验室规模实验获得的LPI含量。产率范围从56％至71％。还观察到高LPI溶血卵磷脂中的LPC含量较高，范围从10％至15％(表11)。批次2和3的LPI和LPC含量较低，但产率较高。所有三批次的LPI的总质量重量非常接近。乙酸乙酯的回收率约87％，这可以进一步优化以降低溶剂成本。来自有机相的废弃物(油、游离脂肪酸和少量乙酸乙酯)需要进一步调查以确定它是否对环境友好。

表10.来自三批次中试生产的高LPI溶血卵磷脂产品中的LPI含量

表11.三批次中试生产的高LPI溶血卵磷脂粉末中的LPC含量

讨论

虽然LPI分子已广泛用于研究，但其高纯度形式大多数来自试剂公司或化学合成。两者都需要耗时的纯化步骤，例如制备型HPLC。然而，酶促水解是从含PI的卵磷脂中获得LPI的另一种方法。文献已经报道了卵磷脂水解形成溶血卵磷脂的各种条件，该溶血卵磷脂的组成主要以LPC的含量来标示。该研究证明了通过脱油卵磷脂和常规大豆卵磷脂的有机相酶促水解获得高LPI含量溶血卵磷脂的可能性。该反应体系能够充分水解PI以及在最终产物中富集水解产物(LPI)。无论起始原料如何，采用这种新方法制备的溶血卵磷脂中的LPI含量在5.8-13.1％的范围内，这是商业溶血卵磷脂中的LPI含量5-10倍高(图8)。该方法还在250kg规模下进行了验证以生产大量高LPI溶血卵磷脂。

卵磷脂的这种新的酶促改变由所有易于处理的步骤组成：反应、相分离和干燥。不需要复杂的纯化过程。尽管据报道许多有机溶剂可以耐受卵磷脂的酶促水解

总之，这种新优化的酶促合成为我们提供了具有成本效益、环境友好且有效的制备高LPI溶血卵磷脂的方法。未经进一步纯化从该合成中获得的产物含有高达13.1％ LPI和15.8％ LPC。(图8和10)。

参考文献

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7.U.S.专利号:7189544,Schmitt et al.,Enzymatic modification oflecithin.

材料和方法

化学品和试剂。磷脂酶A

大规模生产高LPI溶血卵磷脂。在中国湖南省的一家工厂进行了六批生产。使用常规大豆卵磷脂作为起始材料。最佳条件应用于放大生产。简而言之，将450kg常规大豆卵磷脂、135kg去离子水、1440kg乙酸异丙酯和0.9kg磷脂酶A

结果

最终产品(二氧化硅和溶血卵磷脂的混合物)中的LPI和LPC含量显示在图11中。所有批次的最终产品中的LPI含量均高于3.5％。除LZ202009-06批次外，LPI含量范围从4.8-5.8％。LPC含量与LPI表现出相同的趋势。对于LZ202009-06批次，LPI含量低于其他批次，可能原因也许是酶促反应不完全，由磷脂酰肌醇(PI)残留量高于其他批次指示。结果显示，乙酸异丙酯是提高PC和PI转化为LPC和LPI的良好溶剂。图12描绘了过程流程图。

所有6批次中试生产的质量平衡在表12中列出。从2770kg大豆卵磷脂中获得了总共2356kg的高LPI溶血卵磷脂。总产率为85％。

表12.高LPI溶血卵磷脂粉末的中试生产的材料平衡表(450kg/批次)

讨论

这种新发展的用于制备高LPI溶血卵磷脂的酶促方法在使用乙酸异丙酯作为溶剂的中试规模中被证明是可行和稳健的。最终产品中LPI和LPC的平均含量分别达到5.0％和10.2％。产率达到85％。考虑到最终产品中负载了约40％的二氧化硅载体，如果我们调整载体比例甚至除去它，则最终产品中的LPI和LPC含量会更高。

应理解，可以对本文所述的组合物和范围进行较小的剂量和制剂修改，并且仍然落入本发明的范围和精神内。

已经参考特定的组合物、有效性理论等描述了本发明，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明并不旨在受这种说明性的实施方式或机制的限制，并且修改可以在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围或精神的情况下进行。旨在将所有这种明显的修改和变化包括在所附权利要求所限定的本发明的范围内。权利要求旨在以有效满足其预期目标的任何顺序覆盖要求保护的成分和步骤，除非上下文特别指出相反。

已经出于说明和描述的目的呈现了前述描述。它不旨在成为详尽的列表或将本发明限制为所公开的精确形式。考虑到对于本领域技术人员来说显而易见的其他替代过程和方法被认为包括在本发明中。该描述仅仅是实施方式的示例。应当理解，可以进行任何其他修改、替换和/或添加，这在本公开的预期的精神和范围内。综上所述，可以看出本公开的示例性方面至少实现了所有预期目的。