中和新型冠状病毒的C-型单域抗体及应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种中和新型冠状病毒的C-型单域抗体及应用。

背景技术

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)通过病毒表面的囊膜糖蛋白(spike glycoprotein，S蛋白)与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合介导感染，S蛋白在功能上分为负责与宿主细胞结合的含受体结合域(receptor binding domain，RBD)的S1亚基和负责介导病毒与宿主细胞膜融合的S2亚基。S蛋白是SARS-CoV-2主要免疫原和抗体靶点。随着多种突变株的出现，如奥密克戎(OmicronBA.1)以高传播速率迅速成为主要流行株，其S蛋白携带的大量突变位点造成与受体亲和力增强并产生严重的免疫逃逸，极大地影响了现有的疫苗和抗体药物的有效性(Iketani S,et al.,Nature,2022)。奥密克戎在传播过程中又进化出一系列亚系如BA.2和BA.5，并迅速取代前者成为新的主要流行株，这些亚系能继续逃逸针对BA.1产生的免疫(Cao Y,et al.,Nature,2022)，造成突破感染。所以亟需寻找靶向高度保守表位的广谱中和抗体应对现有或未来出现的突变株，研发单域抗体(纳米抗体)成为新的选择。

发明内容

针对现有技术中的问题，本申请提供了一种中和新型冠状病毒的C-型单域抗体及应用。

本发明从以优化的CH2为骨架的噬菌体展示库中，以真核系统表达的SARS-CoV-2囊膜蛋白受体结合域RBD为抗原，经过多轮筛选和亲和力成熟后，获得一个候选克隆BBT-VC002-1。用大肠杆菌原核表达并纯化BBT-VC002-1，对其生物学特异性、体内外中和活性进行了评价，得到一种广谱中和SARS-CoV-2的新型C-型单域抗体BBT-VC002-1。

BBT-VC002-1具有三个Loop区，三个Loop区的氨基酸序列分别如Seq ID No.4、SeqID No.6和Seq ID No.8所示。

BBT-VC002-1中编码所述三个Loop区的核苷酸序列分别如Seq ID No.3、Seq IDNo.5和Seq ID No.7所示。

可选地，BBT-VC002-1的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

可选地，编码BBT-VC002-1的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

本发明还揭示了上述中和新型冠状病毒的C-型单域抗体在制备针对新型冠状病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、偶联抗体中的应用。

本发明提供的上述针对SARS-CoV-2囊膜蛋白的单域抗体，是通过以下方法得到：首先构建以优化的CH2为骨架的噬菌体展示库，然后以哺乳动物细胞表达的SARS-CoV-2囊膜蛋白受体结合域RBD为抗原(图2)，经过4轮筛选得到候选克隆。通过随机突变对候选克隆进行亲和力成熟，最终得到一个高亲和力、特异性结合的克隆。表达纯化该克隆(图3)，进行鉴定，即得到一种中和SARS-CoV-2的抗体BBT-VC002-1。

BBT-VC002-1能够抑制SARS-CoV-2入侵细胞，用于SARS-CoV-2感染的预防、治疗和诊断。

本发明构建了融合前构象野生型(WT)、Delta及Omicron BA.1、BA.2、BA.4/5突变株抗原spike三聚体蛋白，通过ELISA测定了BBT-VC002-1的结合活性，结果表明BBT-VC002-1能够与野生型(WT)、Delta及Omicron BA.1、BA.2、BA.4/5突变株抗原spike蛋白结合(图4A)，与野生型和以往突变株抗原RBD相结合(图4B)。通过体外中和实验测定了中和活性，结果表明BBT-VC002-1可抑制野生型、Omicron突变株及其亚系(图5A)、以往流行突变株等假病毒感染Vero E6细胞(图5B)，能够抑制SARS-CoV-2野生型、Delta、BA.1活病毒感染VeroE6细胞(图6)，证明该抗体具有广谱中和SARS-CoV-2的作用。

本发明以叙利亚仓鼠作为新冠病毒感染动物模型评价BBT-VC002-1的体内药效，滴鼻或雾化肺部给抗体后可显著降低仓鼠体内肺和呼吸道的病毒载量，证明该抗体具有良好体内保护效果(图7)。

本发明使用的术语“C-型单域抗体”指以抗体恒定区CH2结构域为骨架的一类抗体。相对于全长单克隆抗体，单域抗体具有更好的组织渗透性，且能够优势结合空间上存在位阻效应的抗原表位。

本发明的有益效果为：相对于全长单抗(分子量～150kDa)，BBT-VC002-1分子量较小(12～15kDa)，具有更好的组织渗透性，并且更易于识别病毒囊膜蛋白上糖基化遮蔽或空间位阻造成的狭小保守表位，针对新冠病毒这一易于突变的RNA病毒具有更好的广谱中和能力；最后，BBT-VC002-1不仅可以在哺乳动物细胞中表达，也可以在原核表达系统、酵母表达系统等中进行表达，其生产成本低、周期短。

附图说明

图1为优化的CH2结构示意图。优化的CH2在本身含有的一对二硫键(nativedisulfide bond)基础上，多引入了一对二硫键(engineered disulfide bond)。CH2所含的三个Loop区分别是Loop BC，Loop DE和Loop FG，它们可以用来引入突变从而构建抗体库。

图2为Fc融合SARS-CoV-2囊膜蛋白受体结合域(RBD)的表达纯化。目的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，泳道M为分子量标准，泳道RBD-Fc为目的蛋白，大小约为55kDa。

图3为纯化的C-型单域抗体BBT-VC002-1。A.纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测，泳道M为分子量标准；B.分子大小排阻色谱显示其以单体状态存在，纯度能达到97％以上。

图4为ELISA实验测定抗体BBT-VC002-1与野生型和以往主要流行突变株的S蛋白或者RBD的结合，EC

图5为假病毒中和实验。A.在假病毒水平BBT-VC002-1中和野生型和Omicron突变株及其亚系，IC

图6为活病毒中和实验。BBT-VC002-1中和野生型、Delta株、BA.1株活病毒，IC

图7为BBT-VC002-1在叙利亚仓鼠模型中对Omicron BA.1感染体内保护实验。A.预防给药后仓鼠肺部病毒滴度。相比对照组(PBS)，按10mg/kg、2mg/kg和0.5mg/kg剂量进行BBT-VC002-1滴鼻给抗体可使病毒滴度分别降低3.00log、2.32log、1.07log值。B.治疗给药后，仓鼠肺部和支气管病毒载量相较对照组(PBS)减少情况。在肺部，20mg/kg组和5mg/kg组相较于对照组活病毒滴度平均下降了2.30和2.37log，在支气管，20mg/kg组和5mg/kg组相较于对照组活病毒滴度平均下降了2.93log和1.77log。仓鼠肺部和支气管病毒RNA拷贝数治疗组相较对照组减少情况。在肺部，20mg/kg组和5mg/kg组分别下降2.04和2.00个log；在支气管，20mg/kg组和5mg/kg组分别下降2.55和1.24个log；使用单因素方差分析显著性差异，****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns,no significance。C.治疗组间接免疫荧光法检测肺组织中SARS-CoV-2复制情况，治疗组相较于对照组病毒荧光信号显著减少。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：表达纯化SARS-CoV-2囊膜蛋白受体结合域(RBD)

将新型冠状病毒SARS-CoV-2的spike glycoprotein(S蛋白)(GenBank:QHR63250.2)中的RBD与人IgG1的Fc片段融合，构建到哺乳动物细胞表达载体pSecTag2 A上，得到重组质粒RecVec-RBD-Fc，采用哺乳动物细胞293F表达体系表达。Beta(GenBank:QUN71037.1)、Gamma(GenBank:QXF23725.1)、Delta(GenBank:QUX81264.1)、BA.1(GenBank:UGN73932.1)等突变株的RBD用以上述同样方法构建。转染前1天将293F细胞(控制细胞密度为5×10

培养120h后收集培养基上清，用Goat Anti-human-IgG Fc Antibody作为抗体通过蛋白免疫印迹(Western Blot)检测RBD-Fc的表达。在检测到RBD-Fc表达后，扩大细胞培养与转染规模，大量表达受体结合域蛋白。收集培养基上清，用Protein A填料纯化目的蛋白，随后用截留分子量为10kDa的超滤离心管超滤置换缓冲液，经SDS-PAGE验证其分子大小和纯度，如图2所示。

实施例2：噬菌体展示库的构建及抗体的筛选

以优化的CH2为骨架，按照已有的文献构建噬菌体库(Gong R,et al.,PLoS ONE,2012)，以哺乳动物细胞表达的抗原进行了筛选。将纯化后的抗原包被于96孔板中4℃孵育过夜后，用已经构建的噬菌体展示文库进行淘选，特异性的噬菌体被抗原所捕获，用PBS+0.05％Tween-20清洗，经过4轮筛选，得到候选克隆。以候选克隆为模板，对其进行随机突变，构建随机突变噬菌体文库，通过抗原序贯筛选，得到一个特异性的高亲和力克隆，命名为BBT-VC002-1。

测序可知，BBT-VC002-1编码基因序列为Seq ID No.1，氨基酸序列为Seq IDNo.2。BBT-VC002-1的三个Loop区为：Loop 1、Loop 2和Loop 3，编码Loop 1的基因序列为Seq ID No.3，氨基酸序列为Seq ID No.4；编码Loop 2的基因序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为Seq ID No.6；编码Loop 3的基因序列为Seq ID No.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。

实施例3：BBT-VC002-1的表达纯化

按照已有文献(Gong R,et al.,Methods Mol Biol.,2012)对BBT-VC002-1进行表达和纯化。提取BBT-VC002-1质粒，转化入E.coli HB2151中。再接种菌种于含100μg/ml氨苄青霉素的SB培养基(1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10g MOPS，pH值用NaOH调至7.0)中，待OD

实施例4：ELISA测定BBT-VC002-1和抗原受体结合域RBD的结合

将病毒Spike三聚体蛋白(WT、Delta、Omicron BA.1、BA.2、BA.4/5)或者受体结合域RBD(WT、Alpha(N501Y)、Beta(K417N/E484K/N501Y)、Gamma(K417N/E484K/N501Y)、Delta(L452R/T478K)、Delta plus(K417N/L452R/T478K)、Kappa(L452R/E484Q)、Lota(S477N)、Eta(E484K)、Epsilon(L452R)、Mu(R346K/E484K/N501Y)、Lambda(L452Q/F490S))以4μg/mL包被在ELISA板上，4℃孵育过夜后用PBS+3％milk于37℃封闭1.5小时，用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗3次。加入梯度稀释的抗体，37℃孵育1.5小时后用PBST洗6次，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗FLAG单克隆抗体于37℃孵育1小时后，用PBST洗6次，再加入ABTS底物后通过酶标仪在405nm波长下进行读值检测。图4A展示了BBT-VC002-1与病毒S蛋白的结合；图4B展示了BBT-VC002-1与病毒S蛋白的RBD区域的结合。

实施例5：BBT-VC002-1在Vero E6细胞上假病毒中和活性的测定

假病毒包装：编码SARS-CoV-2野生型和各突变株S蛋白的cDNA由公司合成或点突变PCR获得，克隆到pCAGGS载体上得到重组表达质粒；瞬时转染293T细胞，转染24小时后弃掉原培养基，加入MOI＝2的VSV△G，在37℃感染2小时后PBS洗三次，加入含2％FBS的DMEM维持培养基(2-DMEM)使细胞生产假病毒。第二天收上清0.45μM滤膜抽滤，10倍梯度稀释感染Vero E6细胞测定滴度，根据滴度结果按照2×工作滴度(约2000个荧光点/100μL)分装后-80℃保存备用。

假病毒中和实验：将Vero E6细胞1.5×10

实施例6：BBT-VC002-1在Vero E6细胞上活病毒中和活性的测定

将Vero E6细胞按每孔1.5×10

实施例7：BBT-VC002-1在仓鼠模型中预防和治疗Omicron BA.1感染体内保护实验

预防实验：用于动物实验叙利亚仓鼠分为4组，每组4只，用以评估BBT-VC002-1的预防效果。用异氟烷麻醉仓鼠，按照10mg/kg、2mg/kg和0.5mg/kg剂量滴鼻给抗体，体积为100μL每只，给等量PBS作为病毒组对照。给抗体1小时后，麻醉仓鼠，以1×10

治疗实验：用于动物实验的11只叙利亚仓鼠被分为3组，高剂量组4只、低剂量组4只，PBS对照组3只，用以评估BBT-VC002-1的治疗效果。用三溴乙醇(Avertin)麻醉仓鼠，1×10

间接免疫荧光法检测肺组织中SARS-CoV-2。制作石蜡切片，肺组织样本用8％多聚甲醛固定7天后石蜡包埋，切成3.5μm的切片。石蜡切片脱蜡再水化，将切片浸泡在加热的EDTA(pH 8.0)缓冲液中用于抗原修复。载玻片用PBS/0.02％Triton X-100渗透15分钟，在室温用5％BSA封闭1小时后与一抗(兔抗SARS-CoV-2NP蛋白多克隆抗体，1:800)37℃孵育1小时，PBS洗后加入二抗Cy3偶联羊抗兔IgG(1:200)继续孵育，PBS洗后加入1:200DAPI染色。切片用中性胶固定后用采集图像(图7C)。

本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。