一种用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置及应用

技术领域

本发明涉及一种用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置及应用，属于食品分析检测技术领域。

背景技术

抗生素作为药品和饲料添加物被长期应用，对人类社会产生了巨大的影响。由于抗生素在畜牧养殖中的长期滥用，导致养殖动物肠道内诱导出抗生素抗性菌，抗生素通过日常生活、医疗、养殖业等活动进入到环境中又诱导环境中的微生物产生抗药性，在这个过程中抗生素抗性基因不断富集积累；同时抗生素抗性基因可以在非病原体、病原体甚至是远源相关生物之间转移，并在环境中的迁移与传播，所以抗生素抗性基因不仅会污染环境，还对人体健康造成威胁。因此检测抗生素抗性基因对于保护生态环境和机体健康尤为重要。

侧流层析试纸具有检测时间短、选择性良好、成本低、样品量要求小、易于大规模生产以及可稳定的长期储存的特点，被广泛应用于便携式分析检测传感器的设计中，现已逐步应用在核酸检测领域。基于光热效应进行信号放大的侧流分析技术主要依赖于激光激发等离子体纳米材料，当激发光与纳米粒子的表面等离子体共振频率相匹配时，粒子吸收光能并以热的形式释放能量从而产生温度变化并达到一种信号放大的效果。这种通过温度变化反映分析物浓度变化的方法背景信号较低，传感灵敏，现已成功应用于核酸等各类目标物的检测。

相较于比色和荧光侧流分析技术，光热侧流分析技术具有更高的灵敏度和信噪比，近年来受到越来越多的关注。Zhang等基于多功能光热纳米粒子Fe3O4@Au研制了一种超灵敏的光热侧流免疫分析方法用于赭曲霉毒素A(OTA)的定量检测(Talanta 2021,222,121478)，Zhang等以花状金纳米粒子沉积二氧化锰纳米载体作为光热材料，研制了一种检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的光热侧流免疫分析方法(Food Chemistry 2021,341,128231)。

然而，现有的光热侧流分析均无法实现多分析物的同时检测，原因是所有的光热侧流分析均以点激光为光源，一次只能照射试纸检测区上的一个检测位点，即使检测区上设置多种分析物的区域，也只能逐个区域照射、逐个区域测温，多种分析物只能陆续检测，总分析时间是单个分析时间的加和且很难控制分批次检测时激发条件的统一。因此，如何实现光热侧流分析的多分析物同时检测，是领域内的难点和瓶颈。

发明内容

技术问题：现有核酸光热型试纸具有以下局限性：一、光源是点激光，光斑集中、面积小(5*8mm

提高分析通量、提高检测效率是及时检测技术发展中的重要问题，也是目前分析化学主要的发展方向。从技术或者装置的角度进行探索，开发同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析方法，具有重要的科研和现实意义。

技术方案：

一方面，本发明提供一种同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的方法，具体步骤包括：

(1)构建用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置，具体包括制备试纸条、制备n种光热捕获探针、搭建808nm面激光光源和热检测器件四部分。其中，所述试纸条包括底板，在所述底板上沿水平方向依次交叠粘贴有样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜包括检测区、质控区即C区；所述试纸条的检测区包括n个独立的T区，每个T区上分别固定有不同的待测磺胺类抗生素抗性基因检测探针，记为T

(2)将n种光热捕获探针、待测样品液、缓冲液混合后形成混合液，将试纸条样品垫端插入该混合液中进行层析；

(3)n种光热捕获探针因层析作用迁移流经检测区被对应的T

作为一种可选的实施方式，所述的定性分析是指，根据T

在本申请中，所述各检测区的光热温度变化与对应待测磺胺类抗生素抗性基因的含量呈负相关，具体为：

当样品不含待测磺胺类抗生素抗性基因时，T

当样品中含有某种磺胺类抗生素抗性基因时，对应的T

所述质控区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显暗紫色。

作为一种可选的实施方式，所述待测磺胺类抗生素抗性基因为在环境中游离或存在于细胞中能使细菌具有抗药性的基因片段，包括但不限于sul1基因、sul2基因、sul3基因其中的至少两种。

作为一种可选的实施方式，所述光热捕获探针即Fe

作为一种可选的实施方式，所述待测磺胺类抗生素抗性基因检测序列为链霉亲和素修饰的、与待测基因部分相同、与捕获序列完全互补的单链核酸。链霉亲和素赋予检测序列固定在NC膜上的能力，检测探针用来结合光热捕获探针。

作为一种可选的实施方式，所述待测磺胺类抗生素抗性基因的质控探针为链霉亲和素与质控探针偶联结合的混合物，链霉亲和素赋予质控探针固定在NC膜上的能力，质控探针用来捕获多余的光热捕获探针。

作为一种可选的实施方式，所述待测磺胺类抗生素抗性基因捕获序列为与待测磺胺类抗生素抗性基因互补的一段单链核酸序列。

作为一种可选的实施方式，所述待测磺胺类抗生素抗性基因检测探针为与待测磺胺类抗生素抗性基因相同的一段核酸序列。

作为一种可选的实施方式，所述待测磺胺类抗生素抗性基因质控探针互补和质控探针为一对互补的与待测磺胺类抗生素抗性基因核酸序列无关的核酸序列。

所述光热检测装置包含808nm激发光源和面发散激光光束扩展器。本申请中所使用的面发散激光光束扩展器作为808nm激发光源的光学配件使用，可将点光斑的面积由原来5*8mm

作为一种可选的实施方式，所述的多种目标物的光热侧流分析装置的检测装置通过808nm激发光源组合面发散激光光束扩展器实现，具体为：在激光光源与侧流层析试纸间增加一个面发散激光光束扩展器，面发散激光光束扩展器紧挨着激光探头，此光学配件可以将点光源的激发面积扩大1.5-30倍不等。作为一种示例说明，当扩大倍数为2.5倍时，可将5*8mm

作为一种可选的实施方式，所述的光热侧流层析装置检测原理具体为：Fe

另一方面，提供一种检测磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流层析装置的制备方法，其中，所述装置的制备方法包括：

(1)制备n种光热捕获探针：将一份Fe

(2)构建试纸条：T

作为一种可选的实施方式，所述制备Fe

作为一种可选的实施方式，所述制备光热捕获探针即质控探针互补序列-Fe

作为一种可选的实施方式，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液其中任意一种。

作为一种可选的实施方式，所述检测探针为与待测基因部分相同、与捕获序列完全互补的一段核酸序列，检测探针的数量与待测基因的数量一致；所述质控探针为与待测磺胺类抗生素抗性基因无关的一段核酸序列。

作为一种可选的实施方式，所述检测探针和质控探针均带有生物素修饰或者寡聚核苷酸，以使其能够固定在试纸条上，

当所述检测探针和质控探针带有生物素修饰时，试纸条的n个T区即T

作为一种可选的实施方式，所述T

作为一种可选的实施方式，所述C区固定质控探针，包括在C区滴加或喷涂链霉亲和素和质控探针的缓冲液，具体为：C区滴加或喷涂含有0.05-2.5mg/mL链霉亲和素和0.2-5mg/mL质控探针的缓冲液。

一方面，本申请提供一种同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流层析装置，所述光热侧流层析装置包含试纸条、n种光热捕获探针、808nm面激光光源和热检测器件四部分；

所述试纸条主体包括底板，在所述底板上沿水平方向依次交叠粘贴有样品垫、NC膜、吸收垫，其中，NC膜用于实现样品中分析物与其他物质的分离和检测，样品垫用于上样，吸收垫用于吸收过量液体并为层析提供前进动力，底板为试纸提供物理支撑；所述NC膜包括检测区即T

所述808nm面激光光源是以808nm点激光通过面发散激光光束扩展器形成的；所述面发散激光光束扩展器作为808nm点激光的光学配件使用，通过面发散激光光束扩展器可将5*8mm

作为一种可选的实施方式，所述光热捕获探针包含Fe

所述热检测器件指热成像或测温设备，包括但不限于手机红外热成像分析配件、红外热成像仪、手持式红外热成像分析仪或者红外热成像测温枪，所述热成像或测温设备采集光热成像照片，并通过与之相连的智能显示端得以输出显示，所述智能显示端包括电脑或智能手机。

本发明中检测磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置的检测原理，以三种磺胺类抗生素抗性基因sul1基因、sul2基因、sul3基因为例解释如下：当样品中没有三种磺胺类抗生素抗性基因时，光热捕获探针被NC膜上对应的三种检测区(T

有益效果：

本发明提供的检测方法，一次层析即可在20分钟内同时完成多种磺胺类抗生素抗性基因的光热定量检测，灵敏度更高，而且较现有的光热侧流分析方法拓宽了检测通量且不增加检测时间。

附图说明

图1为本发明试纸条结构及原理示意图；

图2为本发明检测装置示意图；

图3为本发明试纸条对阴性、阳性样品的响应情况以及工作曲线；

图4为本发明试纸条检测区以及特异性测试情况。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本申请以下实施例公开了一种用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置的制备及应用，包括以下步骤：

(1)制备光热捕获探针：n份Fe

(2)组装试纸条：在T

(3)将n种光热捕获探针、待测样品液、缓冲液混合后，将试纸条样品垫端插入该混合液中，进行层析；

(4)以808nm面激光照射T

本发明可实现多种磺胺类抗生素抗性基因同时光热定量分析。根据T区的数量，可以调整面激光中面发散激光光束扩展器的放大倍数，以调整面激光照射面积，使光斑面积满足n个T区的覆盖需求。以下实施例以sul1基因、sul2基因、sul3基因作为磺胺类抗生素抗性基因的示例，对整个装置的制备及应用方法进行充分详细的说明。

实施例1：

一种用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置的制备及工作曲线的绘制，具体步骤如下：

1.试纸材料的制备

1.1制备Fe

在氮气保护下，FeCl

1.2制备Fe

将Fe

1.3Fe

分别取1mL Fe

1.4检测区(T

用1×TBE溶液分别将生物素修饰的sul1检测探针、sul2检测探针、sul3检测探针、质控探针稀释为1mM。所述sul1基因的检测探针为：5’-biotin-GCATAGCGCTGGGTT-3’；所述sul2基因的检测探针为：5’-biotin-GCCTCGCGCCGATCT-3’；所述sul3基因的检测探针为：5’-biotin-ACACCAGCCTCAACT-3’；所述质控探针为：5’-biotin-TTTTTTTTTT-3’。分别向100μL sul1检测探针溶液、sul2检测探针溶液、sul3检测探针溶液、质控探针溶液加入300μLPBS、600μL 1.67mg/mL链霉亲和素，室温下作用1h；碱溶液移入截留相对分子质量25Kd的超滤管中，8000rpm离心10min，去除未结合DNA；使用PBS洗涤偶联物三次，最后定容至1mL，即制得检测区(T

2.试纸条的制备

按照图1的膜组合方式，将NC膜粘贴在底板中间，样品垫与吸水垫分别搭接于NC膜左右两端，使其覆压NC膜2mm左右，将搭建好的大卡切割成3mm宽度的纸条，即得到空白试纸条。分别使用n种检测区溶液在靠近样品垫的一端点上检测区T

3.样品预处理

用10mM PBS溶液(pH7.4)作为阴性待测液备用。用PBS溶液(pH7.4)分别配置1mg/mL sul1基因、sul2基因、sul3基因标准溶液，用10mM PBS溶液(pH7.4)将待测抗生素抗性基因标准溶液稀释到浓度为0.2ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL。

4.工作曲线的绘制

将上述待测抗生素抗性基因梯度稀释液分别取20μL，共60μL置于离心管中，再分别取三种光热探针各5μL，共15μL加入离心管中，再加入15μL运行缓冲液于离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管进行层析，层析结束后以图2中所示的检测方式，用808nm面激光(功率为1.96W/cm

根据检测区T

sul1基因、sul2基因、sul3基因的工作曲线分别如图3(C)、(D)、(E)所示。

sul1基因的工作曲线为：Y

sul2基因的工作曲线为：Y

sul3基因的工作曲线为：Y

表1-标准浓度样品对应光热温度表

实施例2：

一种用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置对多种磺胺类抗生素抗性基因的特异性验证，包括以下步骤：

1.试纸材料的制备

同实施例1

2.试纸条的制备

同实施例1

3.样品预处理

用10mM PBS溶液(pH7.4)作为阴性待测液备用。

4.特异性验证

在三支离心管中分别加入72μL阴性待测液，再分别加入9μL sul1光热捕获探针，sul2光热捕获探针、sul3光热捕获探针(分别对应记为T

如图4所示，sul1光热捕获探针层析的试纸除sul1检测区外的检测区均显示较浅且光热温度较低；sul2光热捕获探针层析的试纸除sul2检测区外的检测区均显示较浅且光热温度较低；sul3光热捕获探针层析的试纸除sul3检测区外的检测区均显示较浅且光热温度较低；探针间的特异性识别结果好。

实施例3：

一种用于同时检测多种磺胺类抗生素抗性基因的光热侧流分析装置应用于实际样品分析，包括以下步骤：

1.试纸材料的制备

同实施例1

2.试纸条的制备

同实施例1

3.样品预处理

取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(含有sul1、sul2、sul3基因)培养液1-5ml(小于1.0×10

4.工作曲线的绘制

同实施例1

5.样品检测

在待测液离心管中分别加入72μL待测样品溶液，再分别加入9μL sul1光热捕获探针，sul2光热捕获探针、sul3光热捕获探针，再分别加入9μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)，混合并孵育10min，然后将试纸条插入离心管进行层析。待试纸层析结束后，用配有面发散激光光束扩展器的808nm激光器(功率为1.96W/cm

6.数据处理

测试结果如下。

(1)待测样品其试纸条对应的三个检测区颜色显示较浅，首先可以得出定性分析结果，说明其含有sul1、sul2、sul3三种磺胺类抗生素抗性基因。

(2)进一步的，根据光热温变数据，将其代入以上步骤4获得的工作曲线中，可以进一步实现定量分析，得出sul1、sul2、sul3三种磺胺类抗生素抗性基因的具体浓度，具体数据如下：

T

T

T

本实施例结果说明，该未知成分的待测样品中含有70.98ng/mL sul1基因、12.52ng/mL sul2基因、12.77ng/mL sul3基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。