MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

鸽肉具有较高的营养和药用价值，富含多种氨基酸和微量元素，是人类优质蛋白的来源之一。随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对肉鸽产品需求量也日趋增加，肉鸽产业已成为继鸡、鸭、鹅之后第四大家禽产业，也是肉禽产品结构调整的重要来源之一。

肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)于1997年首次在小鼠肌肉cDNA库中克隆，也称为生长分化因子-8(GDF-8)，MSTN基因在不同物种之间同源，主要在动物的骨骼肌中表达，研究报道MSTN基因突变可引起牛、小鼠、羊等多种动物“双肌”表型的产生，是影响动物骨骼肌重量的重要基因。在畜牧业领域，基于MSTN基因多态性已开发诸多肉用动物的分子标记，并应用于分子标记辅助选择育种。

在肉鸽MSTN基因多态性报道方面，Dybus等2013年在《A single nucleotidepolymorphism in exon 3of the myostatin gene in different breeds of domesticpigeon(Columba livia var.domestica)》一文中最早报道MSTN基因编码区上存在一个同义突变(c.C861T)，并研究该突变在肉鸽、观赏鸽和信鸽的多态性，结果表明TT基因型在肉鸽群体中的基因型频率最高，在其他品种中较低，但没有公开基因型与生长性状、屠宰性状的统计学关联性。事实上，胸肌的选育对肉鸽来说非常重要，但是在实际育种工作中需要对肉鸽屠宰后才能对胸肌进行测定，成本高且效率低，而分子标记辅助选择技术为胸肌重量选育提供了非常有效的工具，可以加快遗传进展并提高选择准确性。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记，可以利用该标记提高肉鸽生长和屠宰性状选择的准确性，加快肉鸽新品系的选育进展。

本发明的另一目的是提供上述MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记在肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种中的应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记，该SNP分子标记在肉鸽MSTN基因编码区第861位碱基为C或T，表现为TT、CC或CT三种基因型，其中TT基因型为肉鸽具有优良生长和屠宰性状的分子遗传标记。

作为优选，所述生长性状包括活重、胸宽和胸角；所述屠宰性状包括屠体重、半净膛重、全净膛重、翅膀重、胸肌重、腿肌重、屠宰率、半净膛率和全净膛率。

本发明还提供上述MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记在肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种中的应用。

作为优选，所述肉鸽品种为欧洲肉鸽。

作为优选，当电泳检测确定待检测肉鸽MSTN基因编码区第861位为C或T，且为TT基因型时，判定其为具有优良生长和屠宰性状的肉鸽品种。

本发明还提供用于检测MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供用于检测MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记的试剂盒，其包含上述用于检测MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记的引物，还包含限制性内切酶DraⅠ。

本发明还提供一种肉鸽生长和屠宰性状改良育种方法，包括以下步骤：

步骤a：以待检测肉鸽的基因组DNA为模板，用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

步骤b：用限制性内切酶DraⅠ对PCR产物进行酶切、电泳和凝胶成像，出现TT、CC或CT三种基因型，其中：

含有长度为206bp的一条条带，为TT基因型；

含有长度为206bp、138bp和68bp的三条条带，为CT基因型；

含有长度为138bp和68bp的两条条带，为CC基因型；

步骤c：选择MSTN基因编码区第861位为C或T，且为TT基因型的待检测肉鸽个体作为生长和屠宰性状改良肉鸽留种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供MSTN基因与肉鸽生长和屠宰性状相关的SNP分子标记，并将其用于肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种，可以大大提高肉鸽生长和屠宰性状改良育种的准确性，同时加快遗传进展，从而解决实际育种过程需要对肉鸽屠宰后对胸肌进行测定导致的成本高且效率低等问题。

附图说明

图1为实施例中MSTN基因第三外显子PCR特异性扩增引物的电泳图。

图2为实施例中MSTN基因第三外显子区DraⅠ酶切电泳图。

图3为实施例中MSTN基因编码区c.C861T一代测序基因型的验证结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1 材料

1.1 样品采集

上海金皇鸽业有限公司采集143只28日龄欧洲肉鸽血样，每只鸽子静脉采血1mL于EDTA-K2采血管中，血样采集完毕后迅速混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于-20℃冰箱冷冻保存，用以DNA的提取。

1.2主要试剂及仪器

EDTA-K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计购于美国Thermo FisherScientific公司；DL2000 Marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；PCR仪购自BioRad公司。

2方法

2.1血液基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，将提取出的DNA置于NanoDrop2000分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μL、OD260/OD280在1.7-1.9之间即满足实验需要，存放于-20℃保存备用。

2.2引物设计

参考NCBI鸽MSTN基因编码区序列(GenBank:HM749880.1)，利用Primer Premier5.0软件设计一对特异性引物，目标序列如SEQ ID NO：3所示，包含编码区第861碱基SNP(c.C861T)突变，其中SEQ ID NO:3所示的碱基序列如下：

CGCAGAGATTTTGGCCTTGACTGTGACGAGCACTCGACAGAATCCCGATGTTGTCG

CTACCCACTGACCGTGGATTTCGAAGCTTTTGGATGGGACTGGATTATCGCACCTAAAAG

ATACAAAGCCAATTACTGCTCCGGAGAATGCGAATTTGTTTTTTTACAAAAATACCCGCAC

ACTCACCTCGTACACCAAGCAAACCCCAG。

引物序列如下：

F：5'-CGCAGAGATTTTGGCCTTGA-3'(SEQ ID NO:1)；

R：5'-CTGGGGTTTGCTTGGTGTAC-3'(SEQ ID NO:2)。

扩增片段长度206bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.3PCR扩增和测序

PCR扩增体系15μL：2×Mix 7.5μL，DNA模板0.9μL、下游引物各0.3μL，水6μL。

PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格用于后续DraⅠ酶切进行分型和一代直接测序方法验证，由北京六合华大基因科技有限公司完成测序。

2.4PCR扩增产物的DraⅠ酶切分型

酶切反应体系：10μL：PCR产物4μL，酶0.3μL，水4.7μL，缓冲液1μL。

将反应体系试剂上下摇匀，37℃水浴反应10min，然后80℃加热20min灭活，2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB染色，凝胶成像系统拍照，鉴定基因型。

2.5统计分析

根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用excel软件计算MSTN基因SNP(c.C861T)基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、位点杂合度(He)、Hardy-Weinberg平衡检验、多态信息含量(PIC)。采用IBM SPSS Statistics 25软件中一般线性模型分析欧洲肉鸽不同基因型与生长、屠宰性状的关联性，结果以“平均值±标准误”表示。

3结果

3.1PCR扩增及测序结果

用1.5％琼脂糖凝胶检测包含欧洲肉鸽MSTN基因(c.C861T)SNP位点扩增产物(见图1)，条带清晰无杂带，特异性良好，PCR产物片段大小为206bp，符合预期大小，可以进行下一步实验。

PCR产物进行DraⅠ酶切分型，见图2。由图2可知，c.C861T SNP位点的基因型信息：一条带206bp为TT基因型，两条带138bp、68bp为CC基因型，三条带206bp、138bp、68bp的为CT基因型。通过对PCR产物一代测序检测基因型，结果与酶切结果一致，各基因型测序峰如图3所示。

3.2统计分析结果

对欧洲肉鸽MSTN基因(c.C861T)SNP位点的基因型和等位基因频率进行分析。由表1可见，在(c.C861T)SNP位点上，CT基因型频率最高，为优势基因型，T等位基因频率为51.0％，表现为优势等位基因。由χ2适应性检验表明，SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.500，PIC为0.375，0.25＜PIC＜0.50，属于中度多态。

表1：欧洲肉鸽MSTN基因(c.C861T)SNP位点多态性

3.3不同基因型与欧洲肉鸽生长性状的关联分析

采用IBM SPSS Statistics 25软件中一般线性模型分析欧洲肉鸽不同基因型与生长性状的关联性，TT基因型欧洲肉鸽的活重、胸宽和胸角都极显著高于CC和CT基因型个体(P<0.01)，TT基因型的胫围极显著高于CC基因型个体(P<0.01)，显著高于CT基因型个体(P<0.05)，各基因型个体间的其他生长指标差异不显著(P>0.05)。结果见表2。综上，可得出结论TT基因型的生长性状较好。

表2：欧洲肉鸽MSTN基因(c.C861T)SNP位点基因型与欧洲肉鸽生长性状的相关性分析

注：肩表不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，下同。

3.4不同基因型与欧洲肉鸽屠宰性状的关联分析

采用IBM SPSS Statistics 25软件中一般线性模型分析欧洲肉鸽不同基因型与屠宰性状的关联性，TT基因型欧洲肉鸽的屠体重、半净膛重、全净膛重、翅膀重、胸肌重和腿肌重都极显著高于CC和CT基因型个体(P<0.01)，TT基因型的屠宰率、半净膛率和全净膛率均显著高于CC和CT基因型个体(P<0.05)，各基因型个体间的其他屠宰指标差异不显著(P>0.05)。结果见表3。综上，可得出结论TT基因型的屠宰性状较好。

表3：欧洲肉鸽MSTN基因(c.C861T)SNP位点基因型与欧洲肉鸽屠宰性状的相关性分析

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。